胡楚元，詹麗超，朱嘯川

（湖南省職業(yè)病防治院，湖南長沙 410007）

毒性病理學(xué)是研究藥物在不同劑量作用下，從組織病理學(xué)水平上探究受試動物的病變原因、發(fā)病機(jī)制、組織形態(tài)改變以及由此而引起的結(jié)構(gòu)功能變化的學(xué)科[1]。毒性病理學(xué)技術(shù)和方法不僅應(yīng)用于藥物安全性評價，而且廣泛應(yīng)用于食品（保健食品）、農(nóng)藥、化學(xué)品等的安全性評價，食品的功能性評價檢驗(yàn)，以及所有利用各種實(shí)驗(yàn)動物的科學(xué)研究?？茖W(xué)管理和規(guī)范化操作是確保毒性病理學(xué)方法與技術(shù)精準(zhǔn)實(shí)施的關(guān)鍵。

1 毒性試驗(yàn)染毒方式及注意事項(xiàng)

1.1 染毒方式

①經(jīng)口灌胃染毒方式，使用大鼠灌胃針灌胃，一次性完成單次受試物的給予，動物每天經(jīng)口染毒1次；②經(jīng)皮染毒方式，以不同劑量受試物每日分別涂布實(shí)驗(yàn)動物皮膚上；③吸入染毒方式，將受試物制備成特定濃度的氣態(tài)、氣溶膠或顆粒狀物混懸態(tài)，以動式染毒系統(tǒng)重復(fù)染毒等。

1.2 注意事項(xiàng)

（1）染毒操作時應(yīng)充分考慮動物的利益，善待動物，防止或減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害，制止針對動物的野蠻行為。

（2）實(shí)驗(yàn)人員需崗前培訓(xùn)，持證上崗，操作技術(shù)規(guī)范。

（3）保障實(shí)驗(yàn)動物的福利倫理，成立動物倫理委員會并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物福利和動物倫理的審核[2]。

2 實(shí)驗(yàn)動物的剖檢

2.1 解剖要求

應(yīng)對計(jì)劃剖檢的全部動物進(jìn)行全面的大體解剖學(xué)檢查，剖檢時應(yīng)快速、全面、完整、精細(xì)。

2.2 解剖注意事項(xiàng)

（1）解剖前項(xiàng)目負(fù)責(zé)人應(yīng)召集相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員安排準(zhǔn)備工作，確定解剖人員，明確解剖方案。

（2）了解受試物信息，盡可能明確靶器官；核對動物信息，包括項(xiàng)目編號、動物號、動物性別、劑量組、數(shù)量等。

（3）準(zhǔn)備解剖器械，如剪刀，鑷子，止血鉗，解剖板等。

（4）準(zhǔn)備固定臟器的容器并貼好標(biāo)簽，配制10%中性福爾馬林溶液用來固定組織。

（5）準(zhǔn)備解剖所需的記錄表格及異常臟器照相裝置。

（6）解剖前對動物進(jìn)行體表檢查，包括發(fā)育狀態(tài)、營養(yǎng)狀況、精神狀態(tài)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、被毛、皮膚等。

（7）準(zhǔn)備麻醉用具：根據(jù)試驗(yàn)要求，選擇合適的安樂死模式，如乙醚麻醉、10%水合氯醛麻醉、CO2安樂死等。

（8）準(zhǔn)備采血用具，包括抗凝管、離心管、采血針等并做好標(biāo)記，并選擇合適的采血方式，如腹主動脈采血。

2.3 大鼠系統(tǒng)解剖要求及方法

（1）大鼠系統(tǒng)解剖的一般檢查。主要檢查動物外觀，包括體形、被毛和皮膚、外生殖器及各腔道；按照順序打開腹腔、盆腔、胸腔和顱腔，觀察各臟器在體位置、顏色、質(zhì)地、有無出血及有無積液、粘連等[3]。

（2）按照試驗(yàn)方案摘取所需的組織和器官，一般來說組織病理學(xué)檢查包括腦、心臟、主動脈、食道、肺臟、氣管、胸腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胰臟、甲狀腺、甲狀旁腺、有代表性的淋巴結(jié)、脊髓（頸、胸、腰段）、坐骨神經(jīng)、胸骨、膀胱，雄性大鼠的睪丸、附睪、前列腺及精囊，雌性大鼠的卵巢、子宮及陰道。

（3）根據(jù)試驗(yàn)要求，對相應(yīng)臟器進(jìn)行稱重，需稱重的臟器，其表面的脂肪或筋膜要剔除干凈，以免影響臟器重量，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確；小臟器如腎上腺、垂體等容易丟失，稱重后可直接放到預(yù)先準(zhǔn)備好的包埋盒中。

（4）留取的組織標(biāo)本應(yīng)盡可能塊的浸放到固定液中，解剖時應(yīng)注意力度，避免用力過度損傷臟器，影響后期的組織病理學(xué)檢查結(jié)果。

3 病理學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)試驗(yàn)中的應(yīng)用

3.1 病理工作一般流程

3.1.1 預(yù)約登記、標(biāo)本驗(yàn)收

（1）項(xiàng)目負(fù)責(zé)人填寫《病理組織學(xué)檢查申請表》。

（2）病理檢查人員與項(xiàng)目負(fù)責(zé)人共同核對樣本信息，如樣本數(shù)量、組織類型等。

（3）病理檢查人員填寫《病理組織學(xué)檢查登記表》。

3.1.2 取材

按照毒理試驗(yàn)病理組織學(xué)取材SOP 進(jìn)行取材，并及時填寫《毒理試驗(yàn)組織標(biāo)本取材記錄表》。組織標(biāo)本規(guī)范化取材舉例如下。

3.1.2.1 脾臟

中部橫切取一塊，厚度約為2.5mm。

圖1 病理工作一般流程

圖2 脾臟取材位置

3.1.2.2 肝臟

橫切中間葉，縱切左葉，各取一塊，厚度為2～3mm，長寬度分別為0.5cm×1.0cm。

圖3 肝臟取材位置

3.1.2.3 腎臟

組織取材時，應(yīng)對左右腎分別進(jìn)行取材，左側(cè)橫切，右側(cè)縱切，含乳頭部各取一塊，取材厚度為2.5mm。

圖4 腎臟取材位置

3.1.2.4 心臟

去掉心臟基部血管（橫切去除），將切面朝下，沿心臟縱切面最大截面方向取心肌，含左右心房，左右心室，厚度約為2.5mm，大小為0.8cm×0.8cm。

圖5 心臟取材位置

3.1.2.5 肺臟

取肺左葉近肺門部組織，橫切取一塊，大小約為2.5mm×0.5cm×0.8cm。

圖6 肺臟取材位置

3.1.3 脫水與包埋

取材后將組織放到脫水盒中(圖9、圖11)，進(jìn)行規(guī)范化脫水處理及包埋（圖7、圖8、圖10），并及時填寫《毒理試驗(yàn)組織標(biāo)本脫水記錄表》 和《毒理試驗(yàn)組織標(biāo)本包埋記錄表》。

圖7 櫻花全自動脫水機(jī)

圖8 櫻花全自動包埋機(jī)

圖9 組織取材包埋盒

圖11 標(biāo)本編號

3.1.4 切片與染色

使用（圖12）輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)對已包埋的組織進(jìn)行切片操作，切片前準(zhǔn)備鋒利的一次性刀片，將包埋塊夾在切片機(jī)持塊架上，調(diào)節(jié)角度使其合適，然后轉(zhuǎn)動切片機(jī)。使蠟塊切面與刀刃平行。切片時，先對蠟塊進(jìn)行粗修使組織平面完全暴露，再進(jìn)行組織切片。組織切片后需進(jìn)行1～2h 時烘烤，使組織與載玻片粘貼牢固后方可進(jìn)行常規(guī)HE 染色[4]，使用（圖13）櫻花自動染色機(jī)及自動封片機(jī)按預(yù)先設(shè)定好的程序進(jìn)行規(guī)范化高通量自動染色與封片。上述操作完畢后應(yīng)及時填寫《毒理試驗(yàn)組織標(biāo)本石蠟切片記錄表》 和《毒理試驗(yàn)組織標(biāo)本染色記錄表》。

圖12 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)

圖13 櫻花全自動染色機(jī)

3.1.5 毒理學(xué)試驗(yàn)中的組織病理學(xué)檢查

3.1.5.1 組織病理學(xué)檢查原則

（1）先對最高劑量組和對照組的動物標(biāo)本以及剖檢中發(fā)現(xiàn)異常的標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

（2）發(fā)現(xiàn)高劑量組動物器官和組織有病變后再對中、低劑量組動物相應(yīng)器官和組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

（3）對大體解剖時發(fā)現(xiàn)異常的組織臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；染毒處理組有異常改變的，應(yīng)對恢復(fù)觀察期動物相應(yīng)的器官和組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

（4）試驗(yàn)過程中死亡或?yàn)l死動物，應(yīng)對全部保留的組織和器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[5]。

3.1.5.2 組織病理學(xué)評價流程

鏡檢前病理學(xué)家應(yīng)該獲得的必要信息，包括如下部分：①化學(xué)品的特性以及該類物質(zhì)已知的活性；②該化學(xué)品前期的毒性研究結(jié)果；③毒理學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的資料；④動物的個體數(shù)據(jù)（臨床癥狀、體重的變化、食物消耗等）；⑤血液學(xué)、臨床生化以及尿液分析結(jié)果；⑥個體動物的剖檢（大體）改變必須提供給病理學(xué)家[6]，以上信息對于確定靶器官和認(rèn)識毒性機(jī)制有一定的幫助作用。病理學(xué)家還應(yīng)該了解臟器重量的改變，因?yàn)橥ǔ＝M織病理學(xué)的改變與臟器重量的改變相關(guān)聯(lián)。

病理學(xué)家應(yīng)該使用標(biāo)準(zhǔn)化的診斷術(shù)語和診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)語應(yīng)該能夠清晰地描述組織病變的特點(diǎn)。如果簡單的術(shù)語不能很好地描述復(fù)雜的病理改變，應(yīng)使用詳細(xì)的文字描述對病理結(jié)果進(jìn)行解釋。此外，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行同行評議能增加研究中組織病理學(xué)改變正確判斷的可靠性。

3.1.5.3 組織病理學(xué)檢查中的數(shù)據(jù)歸檔

鏡檢原始記錄，病理報(bào)告，病理影像（電子圖片或數(shù)碼照片）原始數(shù)據(jù)，病理標(biāo)本（蠟塊或玻片）必須歸檔；同行評議過程中對原病理結(jié)果產(chǎn)生改動時需提供一份病理修訂報(bào)告，也應(yīng)依據(jù)要求進(jìn)行歸檔[7]。

4 毒性病理學(xué)技術(shù)中的生物安全

在毒性病理學(xué)試驗(yàn)操作過程中會使用大量的甲醛、二甲苯、酒精、松節(jié)油等有害化學(xué)物，具有較強(qiáng)的揮發(fā)毒性和刺激性，有的甚至具有強(qiáng)致癌性，不僅容易對病理實(shí)驗(yàn)人員產(chǎn)生身體傷害，對環(huán)境污染也不容小覷。生物安全是實(shí)驗(yàn)室安全工作的重點(diǎn)之一，病理實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室空間布局，加大生物安全防護(hù)設(shè)備的投入力度，設(shè)置清潔區(qū)，半污染區(qū)和污染區(qū)[8]。根據(jù)實(shí)際情況制定病理實(shí)驗(yàn)室生物安全制度，建立生物安全意識，避免實(shí)驗(yàn)室感染，防止實(shí)驗(yàn)室事故發(fā)生。實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行相關(guān)生物安全知識、法規(guī)培訓(xùn)，進(jìn)一步強(qiáng)化職業(yè)安全防護(hù)意識與防護(hù)技能?；瘜W(xué)性廢物應(yīng)根據(jù)其腐蝕性和毒性分類存放，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)統(tǒng)一用廢液桶收集，由專業(yè)的廢液處理公司處置。實(shí)驗(yàn)人員要把生物安全防范作為一個長期的工作來做，才能確保毒性病理學(xué)試驗(yàn)過程中每個環(huán)節(jié)的安全，最大程度地避免生物安全事故的發(fā)生。

5 小結(jié)

毒性病理學(xué)試驗(yàn)方法與技術(shù)在毒性病理學(xué)診斷中具有重要意義，毒性病理診斷的準(zhǔn)確性和可靠性對毒理學(xué)試驗(yàn)具有非常重要的指導(dǎo)意義，也將影響毒理學(xué)試驗(yàn)的發(fā)展。隨著時代發(fā)展和科技進(jìn)步，毒性病理學(xué)規(guī)范化平臺逐步建設(shè)，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備更新?lián)Q代，毒性病理技術(shù)的規(guī)范化操作水平不斷提高，將為毒理學(xué)試驗(yàn)提供充分的保障，在促進(jìn)我國毒性檢測事業(yè)蓬勃發(fā)展的同時，也將逐漸縮小我國毒性病理學(xué)與世界發(fā)達(dá)國家和地區(qū)的差距。