夏 娜，黃 凱，王 瑜，楚電峰

（青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266032）

豬細(xì)小病毒（PPV）是一種無包膜的細(xì)小病毒，被認(rèn)為是引起世界范圍內(nèi)豬繁殖障礙的主要原因之一，其特征是不孕、流產(chǎn)、死胎、畸形胎和木乃伊胎，通常用首字母縮寫為SMEDI（死產(chǎn)、木乃伊、胚胎死亡和不孕）。PPV 一直是養(yǎng)豬業(yè)的全球性問題，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。從歷史上看，商品豬的繁殖損失在20 世紀(jì)60 年代很高，當(dāng)時(shí)與飼養(yǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、遺傳和有毒物質(zhì)等問題有關(guān)[2]。首次豬細(xì)小病毒是從培養(yǎng)豬瘟病毒的豬腎原代細(xì)胞和睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的，發(fā)現(xiàn)了持續(xù)的小顆粒污染（22～23nm）[3]。這些顆粒類似于克氏大鼠病毒（一種細(xì)小病毒）[4]。由于該病毒在豬的細(xì)胞系中具有復(fù)制能力，因此有可能分離并分類為豬細(xì)小病毒[5]。豬細(xì)小病毒病被認(rèn)為是世界上大多數(shù)地區(qū)的地方病，在所有豬群種類中都可以檢測(cè)到。據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）的最新發(fā)布的分類，該病毒是細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科和蹄類細(xì)小病毒1 型的成員。

1 病毒分子生物學(xué)

所有細(xì)小病毒的基因組都代表一個(gè)約5kb 的單鏈DNA 分子。在病毒的兩個(gè)末端序列中，一個(gè)120～200 個(gè)堿基的復(fù)發(fā)的回文結(jié)構(gòu)是DNA 復(fù)制所必需的，而豬細(xì)小病毒的基因組能進(jìn)行自主復(fù)制[6]。PPV 基因組使用選擇性剪接來擴(kuò)展編碼蛋白質(zhì)，編譯2 條結(jié)構(gòu)多肽（VP1 和VP2），VP1 分子量為84ku，VP2 分子量為64ku。較小的蛋白質(zhì)（VP2）與VP1 蛋白通過從相同的RNA 模板反轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生，VP1 有729 個(gè)氨基酸殘基中120 個(gè)形成氨基末端的獨(dú)特部分（其中VP2中沒有）[7]。第三種結(jié)構(gòu)蛋白VP3 是VP2 的翻譯后修飾產(chǎn)物，分子量為60ku[8]。PPV 中的主要的非結(jié)構(gòu)蛋白是NS1，NSl 的基因大小為1989bp，有663 個(gè)氨基酸序列，具有3 個(gè)不同的潛在糖化點(diǎn)。該非結(jié)構(gòu)蛋白是PPV 基因組通過自身編譯的反式蛋白，在病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮重要的作用[9]。編譯豬細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的基因組貫穿整個(gè)DNA 結(jié)構(gòu)中，導(dǎo)致的病毒粒子在非常小的空間能夠生存[10]。

如圖1 所示，PPV 衣殼是一個(gè)球形外殼（直徑約28nm），由60 個(gè)編碼的PPV 結(jié)構(gòu)蛋白（VP）組裝而成右側(cè)開放閱讀框（RORF），二十面體對(duì)稱排列[11]。PPV 有序的VP 單體由核心的八鏈（βB～βI）反向平行β-桶基序和構(gòu)成衣殼內(nèi)表面的BIDG 片組成[6]。該β-桶結(jié)構(gòu)由該單體由八條反平行的β-鏈組成是病毒衣殼的一種常見結(jié)構(gòu)，在目前所有脊椎動(dòng)物細(xì)小病毒的衣殼中都是保守的，其中細(xì)小病毒還由1 個(gè)α-螺旋和4 個(gè)環(huán)組成[6]。在PPV 由5 個(gè)DE 環(huán)組裝而成，VR 3D 構(gòu)象位于二十面體5 倍體對(duì)稱軸的通道上使其賦予了細(xì)小衣殼屬的特征。圍繞著5 倍體對(duì)稱軸將衣殼內(nèi)部與外部連接起來，該通道的凹陷處被稱為峽谷區(qū)，在細(xì)小病毒的復(fù)制過程中起著重要的作用。凸起位于包圍著二十面體的3 倍體軸上，由2 種或3 種VP 單體的環(huán)/VRs 組裝而成，由大約90%的VP2 和10%的VP1 分子構(gòu)建[12]。2 倍體對(duì)稱軸和3 倍體對(duì)稱軸主要由位于單體環(huán)中的氨基酸組成[12]。病毒與不同宿主因子的相互作用主要由3 倍體軸表面環(huán)介導(dǎo)而成，包括病毒與受體和抗體的相互作用[13]。2 倍體對(duì)稱軸上可以觀察到凹陷其在不同種屬內(nèi)的深度和寬度是可變的，主要是由于側(cè)鏈方向的差異導(dǎo)致的[6]。

圖1 豬細(xì)小病毒的衣殼結(jié)構(gòu)

2 病毒的細(xì)胞生物學(xué)

PPV 的主要復(fù)制發(fā)生在淋巴組織中，其次病毒可以通過病毒血癥在全身分布。目前還不清楚PPV 是如何穿過胎盤屏障到達(dá)胎兒的，因?yàn)? 個(gè)組織層完全分隔了母豬和胎兒的血液循環(huán)，并且這些細(xì)胞緊密相連，甚至不允許小分子如抗體通過[14]。很可能由于病毒在被巨噬細(xì)胞吞噬后仍能保持感染性，它可以利用巨噬細(xì)胞穿過豬的上皮絨毛膜胎盤感染胎兒[15]。

胎兒感染后，由于胎兒組織中的細(xì)胞具有有絲分裂的活性，為PPV 提供易受感染和病毒復(fù)制的環(huán)境[16]。PPV 進(jìn)入細(xì)胞仍不清楚，但包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用或調(diào)節(jié)型外排途徑的胞吐運(yùn)輸，胞內(nèi)運(yùn)輸和酸化對(duì)于PPV 進(jìn)入細(xì)胞核是必不可少的[10]，因?yàn)橐職さ目赡嫘揎椩试S病毒從核內(nèi)體逃逸[17]。但有研究表明，PPV 可以和細(xì)胞表面糖蛋白上的唾液酸受體結(jié)合后，利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用和胞飲途徑進(jìn)入細(xì)胞，獨(dú)立的病毒粒子通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入胞內(nèi)，而在pH 小于8 的情況下PPV 具有聚集性的趨勢(shì)，并且趨向于通過胞飲作用侵入[18]。病毒到達(dá)細(xì)胞核后，細(xì)小病毒通過利用宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，主要在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制利用了轉(zhuǎn)錄和復(fù)制酶系統(tǒng)。PPV 復(fù)制過程降低了線粒體膜電位，隨后的氧化損傷也導(dǎo)致細(xì)胞毒性蛋白如細(xì)胞色素c 從線粒體釋放到胞質(zhì)溶膠，引發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致病毒性疾病中的細(xì)胞死亡和組織損傷[19]。在PPV 感染過程中，豬細(xì)小病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白能與自噬相關(guān)蛋白和RAB2A 互作[20]。VAMP7能通過介導(dǎo)來自高爾基體和溶酶體的囊泡與質(zhì)膜的融合來調(diào)節(jié)自噬小體的形成從而維持線粒體的穩(wěn)態(tài)[21]。PPV 感染能夠誘導(dǎo)PTCs 發(fā)生自噬，PPV 感染的早期NS1 通過與RAB2A 相互作用影響了RAB2A 與VAMP7 介導(dǎo)的自噬體和溶酶體融合，而在PPV 感染的后期，NS2 能同RAB2A 和VAMP7 都發(fā)生互作來促進(jìn)RAB2A 和VAMP7 介導(dǎo)的自噬體與溶酶體融合，誘導(dǎo)細(xì)胞形成完全自噬[22]。目前報(bào)道的豬細(xì)小病毒的出核方式主要是依賴于核輸入受體蛋白CRM1 介導(dǎo)的出核方式，CRM1 是importinβ 家族成員之一。結(jié)果表明，B19V 在感染過程中通過11kDa 蛋白與CRM1發(fā)生互作促進(jìn)病毒出核[23]。

PPV 的毒力特性似乎與病毒蛋白基因有關(guān)，PPV的兩個(gè)原型菌株NADL-2 株和Kresse 株在體內(nèi)和體外的致病能力都有很大差異，使用來自致病性（Kresse株）和非致病性（NADL-2 株）PPV 的重組病毒的體外研究表明，它們的基因組序列幾乎相同（13 個(gè)單核苷酸取代和一個(gè)127 個(gè)核苷酸非編碼重復(fù)序列），基因組之間的比較顯示非編碼區(qū)幾乎相同。對(duì)于非結(jié)構(gòu)基因區(qū)（NS1/NS2），發(fā)現(xiàn)的所有差異都是沉默的，而在結(jié)構(gòu)基因（VP1/VP2）中，8 個(gè)差異中的6 個(gè)導(dǎo)致氨基酸取代，衣殼蛋白中的單個(gè)氨基酸影響PPV 在某些細(xì)胞系中的復(fù)制能力[24,25]。在PPV 感染過程中VP2能參與病毒基因組的入核和成熟病毒粒子的組裝，具有抗原特性以刺激宿主免疫反應(yīng)[26]。VP1 是病毒衣殼的次要成分，也參與病毒復(fù)制[27]。NS1 是一種重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和宿主細(xì)胞致病性[28]。NS2 已被確定參與衣殼組裝和核出口[29]。

在大多數(shù)情況下，PPV 感染本身不會(huì)導(dǎo)致未懷孕的成年豬或仔豬以及公豬不產(chǎn)生肉眼可見的損傷，損傷僅在胚胎或胎兒中明顯[30,31]。低致病性和疫苗弱毒株（如NADL-2 株和MSV 株）不能像高致病性強(qiáng)毒株（如Kresse 株和27A 株）那樣有效地穿過胎盤屏障，因此弱毒株對(duì)妊娠的有害影響不能像強(qiáng)毒株被檢測(cè)出的頻繁高，但將NADL-2 株直接注射到羊水中可能會(huì)導(dǎo)致胎兒死亡[1]。

豬細(xì)小病毒感染免疫9～22 周齡的豬，抗體會(huì)被動(dòng)地保護(hù)仔豬數(shù)周和直到成年。動(dòng)物應(yīng)被動(dòng)保護(hù)仔豬（綠線），直到9～22 周齡。先接種母源抗體后再接種的動(dòng)物，長(zhǎng)期免疫是靠接種疫苗維持的。先接種后母體抗體耗盡，長(zhǎng)期免疫是對(duì)易受感染的胚胎（紅線）加強(qiáng)免疫，直到發(fā)育維持加強(qiáng)免疫，見圖2。PPV 感染胎兒感染的結(jié)果隨母豬妊娠的進(jìn)展而變化，有研究發(fā)現(xiàn)胎兒（妊娠開始時(shí)）受到透明帶的保護(hù)，不易被PPV 感染。在胚胎階段PPV 感染（直到大約妊娠35天）導(dǎo)致胚胎死亡和再吸收。胎兒（妊娠第35 天）骨骼開始骨化，胎兒器官發(fā)生基本完成，PPV 感染通常導(dǎo)致胎兒死亡，隨后木乃伊化。最后，在妊娠第70天之后，感染的胎兒能夠建立有效的免疫反應(yīng)并消除病毒，通常會(huì)在感染后存活，小豬出生時(shí)帶有抗PPV抗體[32]，見圖2。

圖2 豬細(xì)小病毒（PPV）感染和免疫反應(yīng)的主要時(shí)間點(diǎn)

PPV 感染后各項(xiàng)指標(biāo)的變化，豬在初次感染后5～10d 內(nèi)可觀察到中度和短暫的淋巴細(xì)胞減少，與性別和年齡無關(guān)[1]。PPV 感染最常見以胚胎死亡以及隨后的體液和軟組織吸收為主要病變，其中病變還包括不同程度的充血、水腫和出血，并伴有體腔內(nèi)漿液血性液體積聚。胎兒死亡后，由于出血導(dǎo)致皮膚變色，使胎兒膚色變暗。最后，組織的逐漸脫水導(dǎo)致木乃伊化。胎盤可能脫水，顏色從褐色變?yōu)榛疑?，胎外液量減少[33]。

在胎兒的組織病理學(xué)變化廣泛存在于不同的組織中，并且主要導(dǎo)致發(fā)育器官的細(xì)胞壞死，出血出現(xiàn)在皮下組織和肌肉塊中，壞死和僵化常見于肺、腎和骨骼肌特別是在肝臟和心臟中[34]。在存活胎兒變得具有免疫活性后，顯微鏡下的損傷主要是子宮內(nèi)膜肥大和單核細(xì)胞浸潤(rùn)[32,35]。妊娠晚期分娩的PPV 感染的活胎兒或死產(chǎn)小豬，出現(xiàn)腦膜腦炎的特征是在血管周圍出現(xiàn)增生的外膜細(xì)胞、組織細(xì)胞和一些漿細(xì)胞，這些細(xì)胞存在于大腦和軟腦膜的灰質(zhì)和白質(zhì)中[36]。

母畜在PPV 感染后病理學(xué)病變包括鄰近子宮內(nèi)膜和固有層深層的單核細(xì)胞的局灶性積聚，以及大腦、脊髓和眼睛脈絡(luò)膜中漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的顯著血管周聚集[34]。跨胎盤屏障的PPV 感染可導(dǎo)致妊娠母豬子宮內(nèi)膜炎、上皮細(xì)胞死亡和胎兒感染，尤其是引起內(nèi)皮組織損傷[37]。

3 小結(jié)

20 世紀(jì)初期我國(guó)以及國(guó)際對(duì)PPV 的研究主要集中于病原學(xué)、理化性質(zhì)、防治等方面，21 世紀(jì)以來各國(guó)的研究者逐漸加強(qiáng)了關(guān)于PPV 分子結(jié)構(gòu)和基因組學(xué)等方面研究。目前，針對(duì)PPV 結(jié)構(gòu)研究可以通過3D模型技術(shù)進(jìn)行反應(yīng)。其中轉(zhuǎn)錄和翻譯圖譜技術(shù)的應(yīng)用為PPV 分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。目前針對(duì)PPV研究得還不夠深入，仍然有許多工作亟待進(jìn)行。我國(guó)關(guān)于PPV 的分子生物結(jié)構(gòu)學(xué)和基因組學(xué)方面的研究少之又少，目前還是不清楚胎兒如何通過胎盤屏障感染該病毒的機(jī)制，這也給我國(guó)獸醫(yī)科技工作者提出了一個(gè)新的課題。