程茜彤，靳 婷，馬楚雯，陳永軒*

(1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)昶科生物工程有限公司，福建 廈門(mén) 361022)

近年來(lái)，抗生素濫用的情況十分普遍，細(xì)菌的耐藥速率逐漸提高，人類曾經(jīng)戰(zhàn)勝的病原菌又卷土重來(lái)。周華書(shū)從史氏鱘病灶樣品中分離出一株多重耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌JY08，耐藥基因和毒力因子分析結(jié)果顯示，菌株JY08攜帶了10大類103個(gè)抗生素耐藥基因[1]，可見(jiàn)細(xì)菌耐藥性形勢(shì)嚴(yán)峻。因此，尋找新型抗菌藥物的任務(wù)迫在眉睫。隨著陸源微生物資源的不斷消耗，人們將注意力轉(zhuǎn)向了海洋。海洋微生物與陸源微生物生活環(huán)境迥異，二者各有特性，而這種特殊的生活環(huán)境使海洋微生物蘊(yùn)含著巨大的潛能[2-3]，這大大增加了從海洋微生物資源中發(fā)現(xiàn)拮抗菌的機(jī)率。

海洋拮抗菌研究的歷史可追朔至19世紀(jì)，已有無(wú)數(shù)前人進(jìn)行過(guò)海洋拮抗菌篩選的研究。Viju N等曾經(jīng)報(bào)道過(guò)一株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)菌形成的生物膜均表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，并可以從中分離出潛在防污作用的化合物[4]。Perumal L等發(fā)現(xiàn)從孟加拉灣深海沉積物中分離到的海洋細(xì)菌具有廣譜的抗菌活性和細(xì)胞毒性，并鑒定出拮抗海洋細(xì)菌為芽孢桿菌(Bacillus)、鹽桿菌(Halobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和海洋桿菌(Marinobacter)[5]。Zhou S X等報(bào)道過(guò)Bacillussp.YB1701對(duì)魚(yú)類病原菌嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌具有抗菌作用，并可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖有機(jī)廢料的降解，是一種潛在的益生菌[6]。徐亞飛發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),這些物質(zhì)對(duì)多種病原菌具有很強(qiáng)的拮抗作用[7]。

目前，已有很多學(xué)者研究了海洋共附生真菌的抗菌活性。Liu H等在海洋紅藻細(xì)翼藻(Pterocladiellatenuis)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一株真菌(Penicilliumchermesinum) EN-480的代謝產(chǎn)物，對(duì)條件致病菌黃體微球菌(Micrococcusluteus)具有一定的抑制活性[8]。Kuvarina A E等從嗜堿真菌(Emericellopsisbasena) VKPM F1428中發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的emericellipsin A(EmiA)具有很強(qiáng)的抗真菌和細(xì)胞毒作用[9]。Thiyagarajan S等從紅樹(shù)林和河口的沉積物中發(fā)現(xiàn)一株曲霉菌EF4對(duì)甲基球菌屬(Methyloccussp.)、黃桿菌屬(Havobacteriumsp.)、海洋球菌屬(Marinococcussp.)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)均具有一定的抑制作用[10]。本研究以漁業(yè)養(yǎng)殖常見(jiàn)的革蘭陰性致病菌作為指示病原菌，采用濾紙片擴(kuò)散法研究海洋微生物的抑菌譜，旨在篩選出具有抗菌活性的海洋微生物，并探討其作為益生菌，用于制作微生態(tài)制劑并應(yīng)用于漁業(yè)養(yǎng)殖的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 海洋分離微生物

由廈門(mén)醫(yī)學(xué)院海洋藥學(xué)研究中心提供的采集自福建東山兄弟嶼的海綿、漳江口紅樹(shù)林的植株、土壤、螃蟹中分離提純的74株海洋微生物(真菌71株、放線菌2株、細(xì)菌1株)。

1.1.2 測(cè)試病原菌

鰻鱺愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellaanguillarum)A-01、A-02、A-03；遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)A-11、A-12、A-13；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)E-01、E-02、E-03、E-04；維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)E-11、E-12；副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)B-01、B-02、B-03、B-04、B-05、B-06、B-07、B-08；溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)B-11；哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)B-21；大腸桿菌(Escherichiacoli)C-01、C-02、C-03；雞白痢沙門(mén)氏菌(Salmonellapullorum)D-01、D-02。均由集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院提供，共9種27株。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

諾氟沙星藥物敏感紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。MH肉湯培養(yǎng)基(Mueller-hinton broth medium)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticase soy broth medium，TSB)購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。LB肉湯培養(yǎng)基(LB broth medium)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示病原菌的保存

將各類指示病原菌分別接種于含0.5 mL 20%甘油水溶液和1 mL對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液的凍存管中(每種菌株保存9管)，按照4℃、-20℃、-80℃的順序梯度保存。

1.3.2 樣品菌菌體萃取物的制備

樣品菌菌體萃取物的制備采用有機(jī)溶劑萃取法[11-12]，將74株平板培養(yǎng)的樣品菌用藥勺切成小塊，轉(zhuǎn)移入250 mL錐形瓶中，加入80%乙酸乙酯、15%甲醇、5%乙酸混合溶劑浸泡2～3 d，待樣品菌代謝產(chǎn)物完全溶出，進(jìn)行抽濾，取濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或氮吹儀蒸干濾液中的溶劑，再用甲醇溶解，將其移入已編號(hào)且稱量過(guò)空重的2 mL離心管中，然后用真空離心濃縮儀將甲醇蒸干，再稱量總重，計(jì)算粗產(chǎn)物凈重，最后用甲醇將其配制成10 μg/mL的濃度(以甲醇為陰性對(duì)照，未產(chǎn)生抑菌圈)。

1.3.3 指示病原菌搖瓶制備

配制各指示病原菌對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液100 mL，分別加入對(duì)應(yīng)指示病原菌凍存液200 μL，搖床培養(yǎng)24 h(32℃、200 r/min)。

1.3.4 抑菌譜的測(cè)定

采用Bauer和Kirby建立的圓紙片瓊脂擴(kuò)散法 (K-B法)對(duì)74株海洋菌株進(jìn)行篩選[13]。將指示病原菌搖瓶培養(yǎng)液按照0.1%(V/V)的接種量，待培養(yǎng)液稍冷后接種于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，充分搖勻后倒板。吸取5 μL樣品菌菌體萃取物于6 mm濾紙圓片上，待培養(yǎng)基凝固后，貼于平板相應(yīng)位置，以甲醇為陰性對(duì)照，以諾氟沙星藥敏紙片為陽(yáng)性對(duì)照，在32℃條件下，培養(yǎng)24 h。用直尺測(cè)量抑菌圈直徑，每組設(shè)3個(gè)平行。

在7種指示病原菌中，氣單胞菌采用LB培養(yǎng)基；沙門(mén)氏菌和大腸桿菌采用MH肉湯培養(yǎng)基；愛(ài)德華氏菌采用TSB培養(yǎng)基；副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌采用含2% NaCl的LB培養(yǎng)基。

抑菌圈敏感程度采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey′s多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 9軟件分析畫(huà)圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.5 最小抑菌濃度(MIC)藥敏實(shí)驗(yàn)

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定芽孢桿菌N-14對(duì)維氏氣單胞菌E-12的最小抑菌濃度[14]。配置20 480 μg/mL芽孢桿菌N-14菌體萃取物水溶液。首管芽孢桿菌N-14菌體萃取物濃度未加維氏氣單胞菌E-12菌液前為20 480 μg/mL，取初始稀釋液0.5 mL放在9支裝有0.5 mL LB肉湯的無(wú)菌試管中，依次進(jìn)行9次倍半稀釋，最后一管棄0.5 mL。同時(shí)以0.5 mL LB肉湯為空白對(duì)照，這11支管最后分別加入0.5 mL制備好的維氏氣單胞菌E-12菌液(1.5×108cfu/mL)，使各管芽孢桿菌N-14粗制發(fā)酵液的終濃度分別為10 240、2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、0 μg/mL。置于搖床中30℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，觀察各管菌體的生長(zhǎng)情況，若前一管菌未生長(zhǎng)而后一管有生長(zhǎng)，則前者管中所對(duì)應(yīng)的藥物濃度即為該溶液對(duì)該菌的最小抑菌濃度。

1.3.6 菌株種屬鑒定

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《海洋新菌的分類與鑒定方法》對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定[15-16]。采用平板劃線法，將抑菌活性明顯的菌株進(jìn)行活化并提取基因組DNA，然后以真菌的ITS4、ITS5或細(xì)菌的16S rDNA的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，并根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取近緣參考序列，通過(guò)Mega 7.0軟件采用ClustalW進(jìn)行比對(duì)，并采用鄰接法(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，選用Kimura 2-parameter 替代模型，自舉(Bootstrap)分析次數(shù)為1 000。根據(jù)Blast和進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果確定該未知菌的種或?qū)俚姆诸惖匚弧?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 各海洋菌株對(duì)各指示病原菌抑菌譜的測(cè)定與種屬鑒定

濾紙片擴(kuò)散法篩選結(jié)果顯示，74株海洋菌株中，有28株海洋菌株(編號(hào)N-1～N-28)對(duì)各指示病原菌具有不同程度的拮抗活性。28株海洋菌株對(duì)各指示病原菌的抑菌譜測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表可以看出，N-3、N-4、N-5、N-10、N-12、N-13、N-20、N-21、N-22對(duì)鰻鱺愛(ài)德華氏菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、雞白痢沙門(mén)氏菌9種指示病原菌均具有明顯的抑菌作用?；?6S rDNA分析的細(xì)菌種屬初步鑒定發(fā)現(xiàn)，這9株微生物均為真菌，N-3為曲霉屬菌(Aspergillussp.)；N-4為赭霉屬菌(Ochroconissp.)；N-5為Roussoellasp.；N-10為Hortaeasp.；N-12和N-20均為翅孢殼霉屬菌(Emericellopsissp.)；N-13為Pseudocosmosporasp.；N-21和N-22均為囊擔(dān)菌屬菌(Cystobasidiumsp.)。

此外，N-11和N-17僅對(duì)大腸桿菌或雞白痢沙門(mén)氏菌有抑菌活性，其種屬鑒定為一種放線菌(Streptomycessp.)。而N-14除了對(duì)大腸桿菌和雞白痢沙門(mén)氏菌外，對(duì)嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌也有明顯的抑菌活性。菌株N-14根據(jù)16S rDNA的基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)并繪制進(jìn)化樹(shù)(圖1)，結(jié)果表明其與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis) (ON248947)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) (HQ317166)的相似性最大(均大于99.8%)，可以確定該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)，但確定到種的分類地位還需要進(jìn)一步的生理生化和其他管家基因的鑒定。

表1 海洋菌株對(duì)各指示病原菌抑菌譜測(cè)定結(jié)果

2.2 指示病原菌屬對(duì) 9種海洋真菌的敏感程度

用抑菌圈的平均直徑來(lái)表示各指示病原菌屬對(duì)9種海洋真菌菌屬的敏感程度，經(jīng)One-way ANOVA和Tukey′s多重比較統(tǒng)計(jì)分析(圖2)， 弧菌對(duì)曲霉屬(Aspergillu)、Hortaea、Pseudocosmospora的敏感程度相對(duì)較高，且與赭霉屬(Ochroconis)、Roussoella、囊擔(dān)菌屬(Cystobasidium)有顯著差異。另外，可以看出大腸桿菌對(duì)赭霉屬的敏感程度最低。

注：One-way ANOVA分析和Tukey’s多重比較分析, *P<0.05;** P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1。

2.3 芽孢桿菌N-14對(duì)維氏氣單胞菌E-12 的最小抑菌濃度

采用芽孢桿菌N-14菌體萃取物對(duì)維氏氣單胞菌E-12進(jìn)行最小抑菌濃度藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明其最小抑菌濃度為10 240 μg/mL(圖3)。芽孢細(xì)菌的抑菌活性菌株比例較一般細(xì)菌高，且芽孢桿菌可以形成休眠的芽孢形態(tài)，具有極強(qiáng)的抗逆性，在生產(chǎn)和應(yīng)用方面?zhèn)涫芮嗖A。氣單胞菌在水環(huán)境中普遍存在，具有廣泛的致病性，能感染魚(yú)類、禽類和哺乳類，導(dǎo)致皮膚潰瘍等局部感染或敗血癥[6]。芽孢桿菌對(duì)氣單胞菌的拮抗作用，對(duì)于研發(fā)應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌或微生態(tài)制劑的意義較大。

3 討論

本研究通過(guò)濾紙片擴(kuò)散法，從海洋環(huán)境中篩選出28株對(duì)特定病原菌具有拮抗作用的海洋菌株，經(jīng)過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)9株具有明顯抑菌作用的海洋菌株都是真菌，分別屬于曲霉屬、赭霉屬、Roussoella、Hortaea、翅孢殼霉屬、囊擔(dān)菌屬和Pseudocosmospora。目前已有許多學(xué)者對(duì)這7種菌屬的抗菌活性及應(yīng)用研究發(fā)表過(guò)報(bào)道。Monggoot S等研究發(fā)現(xiàn)Aspergillussp. MFLUCC16-0845的主要抗菌成分是β-刺參素，可作為一種潛在的生物活性物質(zhì)和植物防御激活劑來(lái)源[17]。曲霉屬真菌代謝產(chǎn)物豐富，在食品發(fā)酵、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等多個(gè)重要領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[18]。Phukhamsakda C等從豬苓鐵線蓮中分離出菌株Roussoellasp.(MFLUCC 17-2059)，發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物膜形成具有抑制作用[19]。Dunia A A F等發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌Hortaeasp.可以應(yīng)用于蒽醌染料綠3的生物轉(zhuǎn)化和解毒[20]。Eugene A R等從嗜堿菌Emericellopsisalkalina的培養(yǎng)基中分離到一種新型抗菌肽emericellipsin A，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗真菌作用和細(xì)胞毒活性，可用于開(kāi)發(fā)抗真菌和抗腫瘤藥物[21]。Santos R A等發(fā)現(xiàn)從不同水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類中分離出的芽孢桿菌能夠通過(guò)群體猝滅來(lái)抑制魚(yú)類病原體群體感應(yīng)，達(dá)到抗細(xì)菌感染的作用，并且其中半數(shù)分離物能夠有效地拮抗重要的魚(yú)類病原體，包括嗜水氣單胞菌、沙門(mén)氏菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、愛(ài)德華氏菌和志賀氏菌(Shigella)等[22-23]。海洋菌株復(fù)雜多樣，其抗菌活性物質(zhì)及開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景還有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)非真菌的N-14菌株，初步鑒定為芽孢桿菌屬，其粗提物對(duì)氣單胞菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌都具有一定的抑菌作用。近年來(lái)，益生菌作為抗生素的安全替代品之一，以飼料 添加劑形式被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。芽孢桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性化能異養(yǎng)菌，好氧或兼性厭氧，在自然界中分布廣泛。芽孢桿菌能夠形成芽孢，具有較強(qiáng)的耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等特性，其生物活性在惡劣環(huán)境中也不會(huì)降低。眾多研究表明，芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能降低水體氨氮亞鹽水平，提高消化酶活性、抗氧化酶活性、免疫相關(guān)基因和應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)魚(yú)體對(duì)病原微生物的抵抗力等[24]，已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中常用的微生態(tài)制劑。芽孢桿菌保護(hù)魚(yú)類免受致病菌侵害的機(jī)制包括產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、提高宿主免疫力、競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量等，其中減少病原微生物是較為重要的益處之一[25]。不同魚(yú)類對(duì)益生芽孢桿菌的最適需求量也不同，目前益生芽孢桿菌添加量與魚(yú)體規(guī)格間還沒(méi)有具體的規(guī)定，但總體來(lái)說(shuō)，大規(guī)格魚(yú)需要添加較多劑量的益生芽孢桿菌，小規(guī)格魚(yú)對(duì)益生芽孢桿菌的劑量需求較少[26]。本研究的一個(gè)局限性在于僅通過(guò)N-14菌株的粗提物對(duì)氣單胞菌進(jìn)行了最小抑菌濃度的測(cè)試。N-14菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可能具有的較大的應(yīng)用前景有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究以東山兄弟嶼的海綿、漳江口紅樹(shù)林的植株、土壤、螃蟹中分離提純得到的74株海洋菌株為樣品菌，以6株氣單胞菌、6株愛(ài)德華氏菌、10株弧菌、2株沙門(mén)氏菌、3株大腸桿菌作為指示病原菌，利用濾紙片擴(kuò)散法篩選測(cè)定菌株的抑菌譜，發(fā)現(xiàn)9株對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、愛(ài)德華氏菌、氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌均具有明顯抑制作用的海洋真菌，通過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)N-3屬于曲霉屬；N-4屬于赭霉屬；N-5屬于Roussoella；N-10屬于Hortaea；N-12和N-20均屬于翅孢殼霉屬；N-13屬于Pseudocosmospora；N-21和N-22均屬于囊擔(dān)菌屬。研究初步鑒定N-14菌株為芽孢桿菌屬，對(duì)氣單胞菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌均具有一定的拮抗作用，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。本研究為深入探索海洋菌株抗菌活性物質(zhì)及其應(yīng)用前景提供了基礎(chǔ)資料。