＊陳仲祥 林美齡 尹可欣 熊莉平

（1.重慶工信職業(yè)學(xué)院 重慶 401233 2.西南藥業(yè)股份有限公司 重慶 400038）

注射用頭孢呋辛鈉為《中國藥典》[1]收載品種，根據(jù)2020年5月14日國家藥監(jiān)局發(fā)布的關(guān)于開展化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)工作的公告（2020年第62號(hào)）[2]，對(duì)其進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)。注射用頭孢呋辛鈉為原料藥無菌分裝制得，根據(jù)本品原料合成工藝路線可能引入雜質(zhì)，對(duì)各國藥典（ChP2020、JP18、BP2020、EP10.0、進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20170207）中提及雜質(zhì)及本品穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)生雜質(zhì)進(jìn)行分析，對(duì)本品雜質(zhì)譜進(jìn)行梳理，匯總本品可能存在雜質(zhì)為：雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)8、雜質(zhì)9及雜質(zhì)11，對(duì)其進(jìn)行研究。將上述可能產(chǎn)生或存在的雜質(zhì)配制成系統(tǒng)適用性溶液篩選合適的方法，結(jié)果各國藥典方法均未能同時(shí)將上述雜質(zhì)基線分離或雜質(zhì)洗脫不完全。故在中國藥典方法上進(jìn)行優(yōu)化，延長了最終比例流動(dòng)相的洗脫時(shí)間，更好地保證流動(dòng)相的洗脫能力，取得理想的試驗(yàn)結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.材料

(1)主要儀器

XPR2電子天平（梅特勒）；ME204T/02電子天平（梅特勒）；XS105DU電子天平（梅特勒）；BT25S電子天平（賽多利斯）；KH-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)）；PB-10酸度計(jì)（賽多利斯）；LC-20AT高效液相色譜儀（島津）。

(2)試藥

注射用頭孢呋辛鈉（西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：Y200601，規(guī)格：1.5g）；西力欣（GSK，批號(hào)：PL7S，規(guī)格：0.75g）；頭孢呋辛對(duì)照品（中檢院，批號(hào)：130493-201706，純度：91.9%）；雜質(zhì)A對(duì)照品（TLC，批號(hào)：2413-038A3，純度：95.9%）；雜質(zhì)B對(duì)照品（TLC，批號(hào)：2469-088A5，純度：93.7%）；雜質(zhì)C對(duì)照品（TLC，批號(hào)：2469-066A9，純度：97.4%）；雜質(zhì)E對(duì)照品（QCC，批號(hào)：2469-066A9，純度：96.24%）；雜質(zhì)F對(duì)照品（QCC，批號(hào)：18-SEP-18-12，純度：95.53%）；雜質(zhì)G對(duì)照品（TLC，批號(hào)：3422-069A11，純度：95.2%）；雜質(zhì)H對(duì)照品（TLC，批號(hào)：2277-014A4，純度：97.9%）；雜質(zhì)I對(duì)照品（TLC，批號(hào)：2756-091A4，純度：96.8%）；雜質(zhì)8對(duì)照品（TLC，批號(hào)：3278-001A2，純度：99.0%）；雜質(zhì)9對(duì)照品（TLC，批號(hào)：3218-096A4，純度：97.5%）；雜質(zhì)11對(duì)照品（TLC，批號(hào)：2405-090A2，純度：97.8%）；甲醇、乙腈為色譜純；冰醋酸、冰乙酸、三水合乙酸鈉等其余試劑均為分析純；水為超純水。

2.方法與結(jié)果

(1)色譜條件

色譜條件用辛烷基硅烷鍵合硅膠柱為填充劑（推薦Agilent Zorbax SB-C8柱，4.6mm×150mm，5μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱）；流動(dòng)相A為醋酸鹽緩沖液（取醋酸鈉0.68g，冰醋酸5.8g，加水稀釋至1000mL，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.4）；流動(dòng)相B為乙腈；流速為每分鐘1.5mL，按表1進(jìn)行線性梯度洗脫；檢測波長為273nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣體積20μL。

表1 有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫

(2)溶液的配制

溶劑：水。供試品溶液：含頭孢呋辛鈉約0.5mg/mL的溶液。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液適量，用水定量稀釋制成每lmL中含1μg的溶液。

雜質(zhì)儲(chǔ)備液：精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、雜質(zhì)G、雜質(zhì)H、雜質(zhì)I、雜質(zhì)8、雜質(zhì)9、雜質(zhì)11對(duì)照品各適量，分別置10mL量瓶，加90%乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。

雜質(zhì)定位溶液：分別精密量取上述雜質(zhì)儲(chǔ)備液1mL，分別置不同的20mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

雜質(zhì)與樣品混合溶液：精密稱取頭孢呋辛對(duì)照品約5mg置50mL量瓶中，精密加入上述雜質(zhì)母液：雜質(zhì)A（0.8mL）、雜質(zhì)B（0.8mL）、雜質(zhì)C（0.4mL）、雜質(zhì)E（0.8mL）、雜質(zhì)F（0.9mL）、雜質(zhì)G（0.8mL）、雜質(zhì)H（0.8mL）、雜質(zhì)I（0.2mL）、雜質(zhì)8（0.4mL）、雜質(zhì)9（1.0mL）、雜質(zhì)11（0.2mL），加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)與樣品混合溶液。

(3)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取稀釋劑、上述雜質(zhì)定位溶液、雜質(zhì)與樣品混合溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1，結(jié)果顯示各雜質(zhì)能有效分離，空白溶劑不干擾測定，專屬性符合要求。

圖1 方法專屬性色譜圖

(4)檢測限和定量限

用溶劑逐步稀釋各已知雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，獲得的色譜圖中，信噪比約為10∶1時(shí)，確定為定量限；信噪比約為3∶1時(shí)，確定為檢測限。各雜質(zhì)定量限遠(yuǎn)低于控制限度要求，表明本方法能滿足雜質(zhì)檢測靈敏度的要求，具體詳見表2。

表2 定量限和檢測限結(jié)果

續(xù)表

(5)線性和校正因子

在定量限到150%限度水平配制線性溶液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，并按以下公式計(jì)算校正因子，校正因子=頭孢呋辛線性方程的斜率/雜質(zhì)線性方程的斜率。線性范圍和校正因子考察結(jié)果詳見表3。

表3 線性范圍和校正因子考察結(jié)果

(6)精密度

由試驗(yàn)員A在A時(shí)間采用A儀器，平行測定6份供試品，作為重復(fù)性結(jié)果。由試驗(yàn)員B在B時(shí)間采用B儀器平行測定6份供試品，合并重復(fù)性樣品共12份樣品作為精密度結(jié)果。12份RSD值評(píng)價(jià)不超過20%，精密度良好，結(jié)果詳見表4。

表4 精密度考察結(jié)果

未知雜質(zhì)3 0.024 0.024 0.024 0.025 0.025 0.025 6 0.024 1.46 0.027 0.029 0.027 0.027 0.028 0.028 12 0.026 6.86未知雜質(zhì)4 0.031 0.031 0.029 0.033 0.032 0.031 6 0.031 3.96 0.032 0.034 0.032 0.034 0.031 0.031 12 0.032 4.46雜質(zhì)E 0.154 0.155 0.149 0.150 0.151 0.152 6 0.152 1.51 0.150 0.149 0.149 0.147 0.147 0.145 12 0.150 1.95雜質(zhì)C 0.043 0.042 0.041 0.042 0.042 0.041 6 0.042 1.78 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 0.041 12 0.042 1.37未知雜質(zhì)5 0.067 0.072 0.067 0.072 0.072 0.069 6 0.070 3.32 0.070 0.071 0.071 0.069 0.068 0.069 12 0.070 2.57雜質(zhì)H 0.083 0.082 0.081 0.082 0.081 0.080 6 0.082 1.37 0.087 0.088 0.087 0.086 0.084 0.084 12 0.084 3.23未知雜質(zhì)6 0.027 0.028 0.029 0.029 0.029 0.029 6 0.028 2.23 0.027 0.028 0.029 0.029 0.030 0.030 12 0.029 3.07

(7)加樣回收率

精密稱取注射用頭孢呋辛鈉（Y200601批，1.5g）內(nèi)容物約12.5mg，置25mL量瓶，稱取9份，分別加入雜質(zhì)限度50%、100%、150%的雜質(zhì)對(duì)照溶液，加水稀釋至刻度，搖勻（臨用新制）；分別精密量取20μL，注入液相色譜儀。記錄色譜圖，平均加樣回收率在98.75%～109.1%范圍內(nèi)，RSD在1.29%～4.81%范圍內(nèi)，表明本方法準(zhǔn)確度良好，詳見表5。

表5 回收率考察結(jié)果

(8)耐用性

耐用性實(shí)驗(yàn)中對(duì)流速（±0.1mL/min）、柱溫（±2℃）、色譜柱批號(hào)、初始流動(dòng)相比例（±2）、pH（±0.05）、波長（±2nm），微調(diào)色譜條件后，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度大于1.5，各相鄰雜質(zhì)間均可有效分離；柱溫在23～25℃，樣品溶液中雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)及檢出量基本一致，即建議柱溫控制在此溫度范圍內(nèi)；流速在1.4～1.5mL/min時(shí)，樣品溶液中雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)及檢出量基本一致，即建議流速控制在此范圍內(nèi)；pH在3.35～3.40范圍內(nèi)，樣品溶液中雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)及檢出量基本一致，即建議流動(dòng)相pH控制在此范圍內(nèi)；有機(jī)相比例變動(dòng)±2%、波長變動(dòng)±2nm及更換不同批次色譜柱時(shí)，樣品溶液中雜質(zhì)檢出個(gè)數(shù)及檢出量基本一致，上述各條件下方法均耐用。

表6 樣品中有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

(9)樣品測定

采用擬定標(biāo)準(zhǔn)測定6批自制樣品和1批參比制劑，均符合規(guī)定。結(jié)果詳見表6。

3.結(jié)論

圖2 樣品與雜質(zhì)混合溶液在擬定條件、LC-MS/MS條件色譜圖

圖3 Y200601批加速6月樣品擬定條件、LC-MS/MS條件色譜圖

根據(jù)破壞性試驗(yàn)、影響因素試驗(yàn)和穩(wěn)定性考察可知雜質(zhì)A、雜質(zhì)E、雜質(zhì)H為降解雜質(zhì)，其中有一雜質(zhì)（RRT=0.3）在穩(wěn)定性考察過程中增加超過0.2%，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行鑒定和安全性評(píng)估。注射用頭孢呋辛鈉進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)中GSK1685761A雜質(zhì)限度為不大于1.0%，標(biāo)準(zhǔn)中附有其結(jié)構(gòu)式和分子量，此雜質(zhì)對(duì)照品無法獲得，多方定制合成失敗。根據(jù)穩(wěn)定性結(jié)果推測RRT=0.3處的雜質(zhì)即為GSK1685761A雜質(zhì)。對(duì)此雜質(zhì)采用LC-MS/MS進(jìn)行定性研究。將擬定條件中醋酸鈉更換為醋酸銨，其他色譜條件不變，作為MS條件。配制樣品與雜質(zhì)混合溶液在擬定條件、上述MS條件下檢測，圖譜如圖2所示，將擬定條件流動(dòng)相中醋酸鈉更換為醋酸銨后，樣品及各雜質(zhì)保留時(shí)間基本一致。加速6月樣品Y200601批（0.75g，倒置）在擬定條件及MS條件下檢測，圖譜如圖3所示，說明更換緩沖鹽，樣品中雜質(zhì)檢出一致。因此可在MS條件下對(duì)RRT0.3處的雜質(zhì)進(jìn)行定性分析。

對(duì)Y200601批（0.75g，倒置）加速6月樣品中RRT=0.3處雜質(zhì)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜研究。一級(jí)質(zhì)譜解析預(yù)測分子量和分子式同GSK1685761A，二級(jí)質(zhì)譜裂解示意圖顯示其裂解方式符合雜質(zhì)GSK1685761A的結(jié)構(gòu)特征。因此可以確定擬定條件下RRT=0.3的化合物為GSK1685761A。同進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)，將其限度定為1.0%。