王中華，張輝紅，常瀘尹，郭 慷，張昊鑫，牛 兵，姜 瑛

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450002）

花生(Arachis hypogaea Linn.)是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，玉米(Zea mays L.)是集糧食、飼料和工業(yè)原料為一體的優(yōu)勢作物，花生與玉米生產(chǎn)在保障糧食安全以及提高家畜養(yǎng)殖的生產(chǎn)效率等方面具有重要的作用和前景[1–2]。在作物的栽培過程中，采取科學(xué)的間作套種等種植模式，有利于提高作物對(duì)自然資源的利用率、高產(chǎn)性和抗逆性[3–4]?；ㄉ衩组g作是河南省黃泛區(qū)一種常見的種植模式，兩者間作能夠增加作物生物多樣性，提高土地、光、水和養(yǎng)分等資源的利用能力[5–6]，在共生固氮系統(tǒng)作用下花生可以向玉米轉(zhuǎn)移氮素，進(jìn)而緩解豆科作物生物固氮的“氮阻遏”作用，同時(shí)促進(jìn)玉米對(duì)磷素的吸收，同樣玉米也可以改善花生的鐵鋅營養(yǎng)狀況[7–10]。常見的間作模式玉米∶花生∶玉米的行數(shù)為3∶8∶3[11–12]、2∶6∶2 和 2∶4∶2[13]。然而，在一塊田地里同時(shí)種植兩種作物的管理比單一作物更加復(fù)雜，不同的作物對(duì)土壤養(yǎng)分往往有著不同的需求，常規(guī)施肥下往往難以同時(shí)滿足兩種作物對(duì)養(yǎng)分的最適需求。同時(shí)，不合理的施肥反而會(huì)導(dǎo)致減產(chǎn)，也會(huì)對(duì)農(nóng)田環(huán)境造成負(fù)面影響，引起農(nóng)業(yè)面源污染[14]。我國人均資源偏低、自然災(zāi)害嚴(yán)重，如何優(yōu)化這一模式，進(jìn)而提高花生玉米產(chǎn)量和質(zhì)量是亟待研究的問題。

植物根際促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進(jìn)植物生長及其對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌類[15]。通常具有生物固氮、溶磷、解鉀、分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、鐵載體等促生特性[16]。根際促生菌作為微生物肥料肥效均衡、綠色無污染，并且在土壤肥力的保持、生態(tài)系統(tǒng)平衡的維護(hù)上有重要作用。目前關(guān)于根際促生菌的篩選、鑒定及其作用機(jī)理也有較為深入的研究[17–19]。但有關(guān)根際促生菌在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中的研究往往停留在實(shí)驗(yàn)室或原生作物條件下，能夠有效定植在根際環(huán)境中并發(fā)揮優(yōu)異促生性能，同時(shí)兼具廣譜性的優(yōu)質(zhì)微生物資源仍比較稀缺[20]。已有相關(guān)研究將根際促生菌應(yīng)用在茴香(Foeniculum vulgare Mill.)/菜豆 (Phaseolus vulgaris Linn.)和大豆 [Glycine max (Linn.) Merr.]/玉米間作條件下，均取得了較好的應(yīng)用效果[21–22]。然而在花生/玉米間作條件下的應(yīng)用研究卻鮮有報(bào)道。當(dāng)下針對(duì)間作環(huán)境下養(yǎng)分分配不均衡，化學(xué)肥料利用率低等問題，主要通過改善間作模式、施肥配比等手段來探究最佳土地當(dāng)量比[23–24]。在花生玉米間作模式下施用根際促生菌能否提高土壤有效養(yǎng)分含量，同時(shí)對(duì)兩種作物產(chǎn)生促生作用，以達(dá)到化肥“減施增效”的目的，值得深入探討。

本研究從砂質(zhì)潮土花生根際土中篩選一株具有產(chǎn)IAA能力，同時(shí)兼具溶有機(jī)磷、解鉀等多種促生功能的根際促生菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化、花生盆栽促生試驗(yàn)，并在玉米花生間作條件下研究該菌對(duì)土壤養(yǎng)分、花生和玉米產(chǎn)量、品質(zhì)等指標(biāo)的影響。以期獲得一株優(yōu)異微生物資源，同時(shí)為間作條件下根際促生菌的應(yīng)用開拓新的視野，提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

試驗(yàn)所用土樣取自河南省鄭州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北小麥–玉米輪作營養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測試驗(yàn)站。選取幾株長勢良好的花生，采集根系附近土樣，取樣深度為0—20 cm，去除石塊、枯枝落葉等雜質(zhì)，過2 mm篩，分裝為兩份：一份用于多功能促生菌的篩選，另一份用于土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)的測定，均在4℃下儲(chǔ)存。土壤基本性狀如下：有機(jī)碳1.91 g/kg、全磷0.29 g/kg、有效磷 3.44 mg/kg、全鉀 19.56 g/kg、速效鉀 20.42 mg/kg、pH 7.39。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，氯化鈉 10.00 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.00～7.20，115℃ 滅菌 30 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加瓊脂20.00 g/L，其它條件同上。

蒙金娜培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，硫酸銨0.50 g，七水硫酸鎂 0.30 g，氯化鈉 0.30 g，氯化鉀 0.30 g，硫酸亞鐵0.03 g，一水硫酸錳0.03 g，蒸餾水1000 mL，115℃ 滅菌 30 min。

有機(jī)磷培養(yǎng)基：在蒙金娜培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加酵母膏 0.40 g，卵磷脂 0.20 g。

解鉀液體培養(yǎng)基：蔗糖10.00 g，酵母膏0.50 g，硫酸銨 1.00 g，磷酸氫二鈉 2.00 g，七水硫酸鎂 0.50 g，碳酸鈣 1.00 g，鉀長石粉 1.00 g，蒸餾水 1000 mL，115℃ 滅菌 30 min。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，硫酸銨2.00 g，磷酸二氫鈉0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，七水硫酸鎂 0.20 g，二水氯化鈣 0.10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.00，115℃ 滅菌 30 min。

1.3 多功能促生菌的篩選及功能鑒定

1.3.1 菌株的分離純化 將l0.00 g供試土壤加入裝有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，于30℃條件下150 r/min振蕩20 min，取出后靜置10 min，得到濃度為0.1 g/mL土壤菌懸液。對(duì)此菌懸液依次進(jìn)行稀釋，得到濃度為 10?2、10?3、10?4、10?5、10?6g/mL 的菌懸液。分別吸取 100 μL 稀釋梯度為 10?4、10?5、10?6g/mL 的菌懸液均勻涂于 LB 固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，挑取不同類型典型單個(gè)菌落，經(jīng)平板純化后，編號(hào)，4℃保存。1.3.2 菌株分泌IAA能力的測定 將分離純化后的細(xì)菌調(diào)節(jié)至OD600(表征細(xì)菌的生長情況)為1的菌懸液，按1% (V/V)接種量，接種于含有L-色氨酸 (100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng) 24 h。

1)定性測定[25]：取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加 50 μL Salkowski比色液 (50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3)。加入 50 μL 50 mg/L 的吲哚乙酸比色液作為陽性對(duì)照。白色陶瓷板于室溫避光放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA。

2)定量測定[26]：對(duì)初篩測出的具有分泌IAA能力的細(xì)菌進(jìn)行定量測定。將10 mL菌懸液在10000 r/min條件下離心10 min，取2.5 mL上清液備用。采用分析純IAA配置濃度依次為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的IAA標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1∶1的體積比與Salkowski比色液混合，室溫避光靜置30 min，測定OD530(以不接菌的液體培養(yǎng)基與Salkowski比色液的1∶1混合溶液為空白對(duì)照)。以IAA的濃度為橫坐標(biāo)，OD530為縱坐標(biāo)繪圖，即得IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各待測液IAA濃度。

1.3.3 菌株溶磷解鉀能力的測定 將調(diào)節(jié)至OD600為1的供試菌懸液，按1% (V/V)接種量分別接種于盛有50 mL有機(jī)磷液體培養(yǎng)基和盛有50 mL解鉀液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，30℃，180 r/min培養(yǎng)72 h 后，各取培養(yǎng)液 10 mL，6000 r/min 離心 20 min，用鉬藍(lán)比色法測定有機(jī)磷培養(yǎng)基上清液中可溶磷含量[27]，用火焰分光光度法測定解鉀液體培養(yǎng)基上清液中所解鉀含量[28]。

1.4 多功能促生菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選得到的多功能促生菌采用劃線法接種到LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察其單菌落的大小、形狀、顏色、光滑度、透明度等。將菌株進(jìn)行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)[29]。將菌株接入液體培養(yǎng)基，37℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，用冷凍干燥法制成電鏡樣品，進(jìn)行電鏡(日立S-3400N)掃描觀察[30]。

1.4.2 生理生化指標(biāo)鑒定 革蘭氏染色、好氧性、接觸酶、甲基紅(M.R)、二乙酰(V-P)、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用等試驗(yàn)方法均參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[29]。

1.4.3 16S rDNA分子學(xué)鑒定 將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，離心收集菌體，采用SDS-CTAB法提取總 DNA[31]，采用 16S rDNA 通用引物 27f (5'?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3')和 1492r(5'?GGTTACCTTGTTACGACTT?3')對(duì) 16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳定量，由北京美億美生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，根據(jù)獲得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列，通過MEGA 7.0軟件，以鄰接法(Neighbor?Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分子序列提交GenBank，獲得登錄號(hào)。

1.5 菌株促生條件優(yōu)化

按照表1對(duì)含有L-色氨酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、裝液量、碳源、氮源進(jìn)行調(diào)節(jié)，將OD600為1的菌懸液按1% (V/V)的接種量接種，30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h后，測定其生長情況(OD600值)，并按定量測定的方法測定培養(yǎng)基中IAA含量。

表1 菌株生長及產(chǎn)IAA能力條件優(yōu)化Table 1 Optimized conditions for HS3 strain growth and IAA production capacity

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇菌株生長的最佳溫度，最佳培養(yǎng)時(shí)間，分別選取初始pH、裝液量、碳源、氮源4因素中菌株生長最優(yōu)的3個(gè)水平，采用L9(34)正交表設(shè)置正交試驗(yàn)，將OD600為1的菌懸液按1% (V/V)的接種量接種，分別探究影響菌株產(chǎn)IAA、溶有機(jī)磷、解鉀的最優(yōu)條件組合。

1.6 盆栽試驗(yàn)

花生盆栽試驗(yàn)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)(鄭州)進(jìn)行，采集自然條件下砂質(zhì)潮土0—20 cm土層的新鮮土壤，過 5 mm 篩，每盆裝土 700 g?；ㄉ?(豫花 9719)種子進(jìn)行20%雙氧水表面消毒20 min，無菌水沖洗多次，保持25℃，濕度90%，催芽2天，選取發(fā)芽一致的幼苗移植到土壤之中。將菌懸液4000 r/min離心10 min，去除上清液，用無菌水重懸，反復(fù)離心重懸3次，將菌株制成1011CFU/mL的菌水劑，以108CFU/g的接種量接種至土壤，以接種滅菌菌水劑為對(duì)照處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，調(diào)節(jié)含水量至田間持水量的60%[32]。每天澆無菌水以保持土壤含水量。30天后，采集土壤樣品用高效液相色譜(HPLC)法測定IAA含量[33]，鉬藍(lán)比色法測定有效磷含量，火焰分光光度法測定速效鉀含量。采集植株樣品測定相對(duì)葉綠素含量 (soil and plant analyzer develotrnent，SPAD)值、鮮重、株高、植株全氮磷鉀含量[34]。用根系掃描儀(LA1600+ scanner，Canada)掃描獲得根系圖像后，用根系分析軟件(Winrhizo2003b，Canada)進(jìn)行相關(guān)根系指標(biāo)分析。

1.7 田間試驗(yàn)

大田試驗(yàn)于河南省鄭州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北小麥玉米輪作營養(yǎng)與施肥科學(xué)觀測試驗(yàn)站進(jìn)行，將供試菌株用無菌水反復(fù)離心重懸3次，以滅菌骨粉為載體，將菌水劑制成有效活菌數(shù)為1011CFU/g的微生物菌劑。玉米供試品種為‘豫單9953’，花生供試品種為‘豫花9719’，玉米花生以2∶4∶2模式間作，玉米行間距為40 cm，花生行間距為30 cm，花生玉米間距為60 cm。試驗(yàn)設(shè)置10個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為50 m2，施用 N 15%、P2O515%、K2O 15% 的復(fù)合肥作基肥，施用量650 kg/hm2，不追肥。微生物菌劑撒施，每個(gè)小區(qū)施用量為40.0 kg/hm2，對(duì)照處理為滅活的以滅菌骨粉為載體的微生物菌劑，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。于收獲期采用5點(diǎn)取樣法，分別采集玉米側(cè)和花生側(cè)0—20 cm土壤樣品，混合后備用，測定土壤pH、IAA、有效氮、有效磷、速效鉀含量；玉米、花生均取2 m雙行，測定生物產(chǎn)量，各小區(qū)均取花生5株，測定單株飽果數(shù)、單株秕果數(shù)、單株飽果重、單株秕果重；取玉米3株測定穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重、單穗重、穗禿頂長。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)采用 Microsoft Office 2016、SPSS 23.0進(jìn)行相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)，采用Origin 2017和Metabo Analyst作圖，單因素方差分析采用LSD法檢驗(yàn)處理間的差異顯著性(P<0.05為差異顯著)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多功能促生菌的篩選

通過對(duì)根際土壤中細(xì)菌的分離與篩選，獲得一株命名為HS3的菌株，將其以O(shè)D600為1的菌懸液按1% (V/V)接種，培養(yǎng)24 h后，其產(chǎn)IAA能力達(dá)到45.82 mg/L；將其以O(shè)D600為1的菌懸液按1%(V/V)接種，培養(yǎng)72 h后，溶有機(jī)磷能力達(dá)到2.86 mg/L，解鉀能力達(dá)到19.88 mg/L。

2.2 促生菌形態(tài)及生理生化特性鑒定

通過平板劃線法獲得HS3單菌落，可見HS3菌落小暗色，扁平，表面干燥，不光滑，不透明，邊緣光滑(圖1A)。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性(圖1B)。菌體大小為(1.23～2.57) μm×(0.50～0.65) μm (圖 1C)。生理生化指標(biāo)測定顯示該菌株為兼性厭氧菌，除接觸酶試驗(yàn)為陰性，其他均為陽性(表2)。

表2 HS3菌株的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of HS3 strain

圖1 菌株HS3的菌落圖(A)，革蘭氏染色圖(B)及電鏡圖(C)Fig. 1 Colony diagram (A), gram staining diagram (B) and electron microscope diagram (C) of HS3 strain

根據(jù)16S rDNA的測序結(jié)果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株HS3與Bacillus acidiceler CBD 119 (DQ374637)同源性達(dá)到99%，運(yùn)用N-J方法構(gòu)建HS3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)合菌株形態(tài)與生理生化特征，鑒定菌株HS3為酸快生芽孢桿菌(Bacillus acidiceler)，將其序列上傳至NCBI，獲得登錄號(hào)KP743120。

圖2 HS3菌株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of HS3 strain

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株促生能力的影響

不同培養(yǎng)條件對(duì)HS3生長和產(chǎn)IAA能力的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃、接種時(shí)間為32 h、初始pH為6、裝液量在100 mL/250 mL、碳源為果糖、氮源為酵母粉條件下，HS3生長和產(chǎn)IAA能力均達(dá)到最大(圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)條件下HS3菌株的產(chǎn)IAA能力和生長狀況(OD600)Fig. 3 The IAA production capacity and growth status (OD600) of HS3 strain under different cultural conditions

基于HS3生長的單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選擇pH(6、7、8)，裝液量 (75、100、150 mL/250 mL)，碳源(果糖、蔗糖、葡萄糖)，氮源(酵母粉、尿素、蛋白胨)對(duì)HS3的不同促生功能進(jìn)行正交試驗(yàn)。極差R值比對(duì)結(jié)果表明，各因素對(duì)菌株HS3產(chǎn)IAA、溶有機(jī)磷、解鉀能力影響大小依次分別為碳源>pH>氮源>裝液量、pH>碳源>氮源>裝液量、碳源>pH>裝液量>氮源。綜合4個(gè)因素的均值(k值)和直觀分析比較，HS3產(chǎn)IAA、解鉀的最佳條件組合為pH=6、裝液量100 mL/250 mL、果糖、酵母粉，溶有機(jī)磷的最佳條件組合為pH=6、裝液量100 mL/250 mL、蔗糖、尿素(表3)。

表3 菌株促生能力培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal test on the culture conditions of the growth-promoting ability of HS3 strain

2.4 接種多功能促生菌對(duì)花生盆栽試驗(yàn)促生效果的影響

在接種HS3菌株30天后，接菌處理長勢明顯優(yōu)于對(duì)照處理(圖4A)。與對(duì)照處理相比，土壤IAA含量增加80.95%，土壤速效磷含量增加14.24%，土壤速效鉀含量增加70.59% (表4)。與對(duì)照相比，花生鮮重、株高、SPAD、全氮、全磷、全鉀分別顯著增加45.06%、15.28%、7.87%、24.73%、95.32%、32.78% (圖4B)。花生根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)、根分枝數(shù)分別顯著增加61.88%、46.65%、75.00%、100.89%、52.25%，根平均直徑增加6.15%(圖 4C)。

表4 接種菌株HS3培養(yǎng)30天后土壤IAA及有效磷、速效鉀含量 (mg/kg)Table 4 Soil IAA and available P and K contents after 30 days of inoculating HS3 strain

圖4 接種HS3對(duì)花生幼苗生長和養(yǎng)分含量的影響Fig. 4 Effects of HS3 inoculation on the growth and nutrient content of peanut seedlings

2.5 花生幼苗及土壤中各指標(biāo)之間的主成分分析、熱圖分析、相關(guān)矩陣以及隨機(jī)森林分析

主成分分析結(jié)果顯示，PC1和PC2在幼苗和土壤指標(biāo)的整體變異中分別占了91.7%和6.4%(圖5A)；CK和HS3處理顯著分離(圖5B)；PC1和PC2顯著影響了根分枝數(shù)、根表面積、植株全鉀、根平均直徑、總根長、植株氮(圖5C)。隨機(jī)森林(圖5D)分析結(jié)果表明，對(duì)于土壤營養(yǎng)指標(biāo)，平均精度下降值由大到小依次為速效鉀、有效磷、IAA；對(duì)于地下部指標(biāo)，平均精度下降值由大到小依次為根尖數(shù)、根體積、總根長、根平均直徑、根表面積、根分支數(shù)；對(duì)于地上部指標(biāo)平均精度下降值由大到小依次為植株鉀、植株氮、株高、鮮重、SPAD值和植株磷。

圖5 花生盆栽土壤及花生各指標(biāo)變化的主成分分析 (A、B、C) 和隨機(jī)森林圖 (D)Fig. 5 Principal component analysis (A, B, C) and random forest map (D) of potted peanut soil and peanut indexes under HS3 treatment

相關(guān)性分析結(jié)果(表5)表明，土壤中IAA含量與根長、根體積、根尖數(shù)、鮮重、株高、SPDA、植株氮、植株磷、植株鉀呈顯著正相關(guān)。土壤中速效磷濃度與根體積、株高、SPAD、植株氮、植株磷呈極顯著正相關(guān)，與根長、植株鉀呈顯著正相關(guān)；土壤中速效鉀濃度與根長、根體積、根尖數(shù)、鮮重、SPAD、植株氮、植株磷、植株鉀呈極顯著正相關(guān)，與根表面積、株高呈顯著正相關(guān)。

表5 花生生長指標(biāo)與土壤IAA和有效態(tài)磷鉀含量的相關(guān)性(r）Table 5 Correlation of peanut plant indexes with soil IAA and available P and K contents

2.6 促生菌田間試驗(yàn)的促生效果

相比于不接種供試菌對(duì)照，施用菌劑花生土壤IAA、有效氮、有效磷、速效鉀含量分別顯著提高49.06%、22.64%、24.01%、52.89% (圖 6A)?；ㄉ鷨沃觑豕麛?shù)和單株秕果重分別顯著下降了54.26%和47.90%，增產(chǎn)率達(dá)到9.87% (圖6B)。土壤IAA含量和有效氮與花生產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，有效磷和速效鉀與花生產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)(表6)。

圖6 田間土壤接種HS3菌劑與對(duì)照處理的花生側(cè)土壤(A)和花生產(chǎn)量(B)比較Fig. 6 Comparison of soil and peanut yield between HS3 inoculation and the control

與對(duì)照相比，施用HS3菌劑使玉米土壤IAA、有效磷、速效鉀含量分別顯著提高67.83%、22.94%、14.17%，土壤有效氮提高了3.37%，但差異不顯著(圖7A)。玉米穗長、行粒數(shù)、單穗重分別顯著增加7.87%、23.49%、9.38%，穗禿頂長下降27.30%，增產(chǎn)率達(dá)到18.56% (圖7B)。土壤IAA、有效磷和速效鉀與玉米產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)(表6)。

圖7 田間土壤接種HS3菌劑與對(duì)照處理的玉米側(cè)土壤(A)和玉米產(chǎn)量(B)比較Fig. 7 Comparison of soil and maize yield between HS3 inoculation and the control

表6 大田試驗(yàn)土壤養(yǎng)分及花生玉米產(chǎn)量指標(biāo)變化相關(guān)性Table 6 Correlation of soil nutrients and yield indexes of peanut and maize under field trail

3 討論

植物根際作為一個(gè)特殊區(qū)域，是植物、微生物和土壤相互之間作用最為密切的區(qū)域，其中根際微生物扮演著重要的角色，是土壤肥力形成和持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵動(dòng)力，對(duì)植物的生長有著重要的影響[35–36]。本研究在花生根際所篩選得到的酸快生芽孢桿菌HS3同時(shí)兼具產(chǎn)IAA、溶磷、解鉀能力，并且能同時(shí)在花生盆栽以及花生玉米間作大田應(yīng)用中改善土壤養(yǎng)分環(huán)境，促進(jìn)植株生長，表現(xiàn)出優(yōu)異的生產(chǎn)價(jià)值及廣譜性。目前針對(duì)酸快生芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的研究較少，且主要集中在其生防作用上[37–38]，針對(duì)其促生作用的研究也只是停留在單一作物溫室環(huán)境下[39]。本研究所篩選得到的菌株在間作這種更為復(fù)雜應(yīng)用環(huán)境中，對(duì)兩種作物均表現(xiàn)出優(yōu)異的促生作用，而目前大多數(shù)研究篩選出的菌種只停留在寄主植物和實(shí)驗(yàn)室條件下，在田間實(shí)際生產(chǎn)中往往難以達(dá)到試驗(yàn)預(yù)期[16]，本研究與之相比更具優(yōu)越性。

IAA作為對(duì)植物生長影響最重要的激素之一，低濃度外源IAA可以誘導(dǎo)植株初生根的生長，高濃度的IAA可以誘導(dǎo)側(cè)根和不定根的生長。這有利于提高植株根系與土壤的接觸面積，改善根際環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)根系對(duì)養(yǎng)分的吸收利用。提高植物生長量[40–41]。Araújo 等[39]發(fā)現(xiàn)一株分離自辣椒果實(shí)的酸快生芽孢桿菌具有溶磷、分泌蛋白、固氮能力，但并未表現(xiàn)出產(chǎn)IAA能力，與之相比本研究所篩選得到的菌株HS3具有產(chǎn)IAA能力以及解鉀能力。在盆栽試驗(yàn)中，在接種HS3的情況下，土壤中IAA含量顯著提高了80.95%，同時(shí)花生的根變得更長、更粗且有更多的分枝。張東艷等[42]在花生根際篩選到一株產(chǎn)IAA菌特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)，在對(duì)花生的盆栽促生試驗(yàn)中顯著提高了土壤中IAA含量，并且對(duì)根系的生長、發(fā)育具有顯著的促生作用，與本研究結(jié)果相符。相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤IAA含量與根長、根體積、根尖數(shù)呈顯著正相關(guān)，說明多功能促生菌HS3在施入土壤后可有效提高土壤中IAA含量，進(jìn)一步促進(jìn)花生根系的生長發(fā)育，提高其對(duì)養(yǎng)分的吸收利用。

磷、鉀元素作為植株生長必需的營養(yǎng)元素，磷是形成細(xì)胞核蛋白、卵磷脂等不可缺少的元素，能加速細(xì)胞分裂，促使根系和地上部加快生長；鉀元素的營養(yǎng)功效可以提高光合作用的強(qiáng)度，促進(jìn)作物體內(nèi)淀粉和糖的形成，增強(qiáng)作物的抗逆性和抗病能力，還能提高作物對(duì)氮的吸收利用[43]。除了產(chǎn)激素能力外，根際促生菌的溶磷能力和解鉀能力可以將土壤中植株難以吸收的固定態(tài)磷、固定態(tài)鉀轉(zhuǎn)化為植株易于吸收的可溶態(tài)磷和可溶態(tài)鉀[44]，提高土壤中養(yǎng)分的利用率，減少化學(xué)肥料不合理施用。姜瑛等[45]將一株貪噬菌屬(Variovorax sp.)接種在花生盆栽之中，其溶磷能力將土壤中有效磷含量提升了18.41%。

鄭文波等[46]在江西紅壤花生地中篩選到一株多功能促生菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，在花生盆栽試驗(yàn)中有效促進(jìn)了花生根系的生長。本研究在花生盆栽中接種多功能促生菌酸快生芽孢桿菌，使土壤中有效磷和速效鉀含量分別提高了14.24%和70.59%。同時(shí)HS3對(duì)花生根表面積、根體積和根尖數(shù)的影響效果更優(yōu)，對(duì)根系生長的促進(jìn)又進(jìn)一步提高了根系對(duì)養(yǎng)分的吸收利用，使花生鮮重、株高、全氮、全磷、全鉀含量分別增加45.06%、15.28%、24.73%、95.32%、32.78%，有效促進(jìn)了花生的生長發(fā)育，對(duì)后期花生的長勢以及產(chǎn)量的提高具有較為積極的影響。

花生玉米間作是河南省黃泛區(qū)平原常見的一種種植方式，與連續(xù)單作系統(tǒng)相比，間作系統(tǒng)在更大程度上提高了生物多樣性，提高養(yǎng)分利用效率、土壤固碳能力和土地利用效率，并降低了病原體的感染，可以更加有效利用農(nóng)田空間環(huán)境資源[47–49]。但這并不意味著可以避免化學(xué)肥料的過量施用，并且在單一地塊上同時(shí)對(duì)兩種作物施用配比合適的化學(xué)肥料反而是困難的。在傳統(tǒng)的間作實(shí)踐中，過多施肥和過度灌溉導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降和環(huán)境惡化仍舊是十分常見的問題[24]。由根際促生菌制成的綠色可持續(xù)的生物肥料在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，可以減少化學(xué)肥料的施用，提高養(yǎng)分利用率，這也更符合我國綠色農(nóng)業(yè)化肥“減施增效”的發(fā)展趨勢。在間作條件下應(yīng)用根際促生菌必然要滿足菌株對(duì)兩種作物同時(shí)產(chǎn)生促生效能。目前已有相關(guān)研究表明，根際促生菌在非寄主作物條件下也能發(fā)揮作用。王歡等[50]從茶樹根際篩選得到的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)GD12應(yīng)用在白菜、空心菜、莧菜同樣也能表現(xiàn)出促生作用。李永斌等[51]在玉米、番茄、黃瓜等根際土壤中篩選到3株根際促生菌，在小麥大田應(yīng)用中也可以有效提高小麥產(chǎn)量。不過這項(xiàng)研究依舊停留在單一地塊、單一作物、單一菌種的情況下。本研究在間作條件下探究HS3在實(shí)際應(yīng)用中的效果，同時(shí)針對(duì)兩種作物，在施用菌劑HS3的情況下，土壤速效養(yǎng)分含量以及花生玉米的產(chǎn)量均得到顯著提升，花生單株秕果數(shù)顯著下降，玉米穗禿頂長顯著下降，在一定程度上改善了花生玉米的品質(zhì)。該菌株使玉米產(chǎn)量提高了18.56%，花生產(chǎn)量提升9.87%，對(duì)非寄主生物玉米也表現(xiàn)出了優(yōu)異的促生效果，也證明了該菌株在應(yīng)用生產(chǎn)中的廣譜性。Rezaei-Chiyaneh等[21]在茴香和菜豆間作條件下施用固氮(Azotobacter vinelandii + Rhizobium phaseoli)溶磷(Pseudomonas putida + Pantoea agglomerans)解鉀 (Pseudomonas koreensis + P. vancouverensis)混合菌劑，使菜豆和茴香的種子產(chǎn)量分別提高了5.0%和2.86%，香精油EO的產(chǎn)量增加39.3%，提升了兩種作物的生產(chǎn)率和質(zhì)量特性。表明根際促生菌具有在間作環(huán)境下改善土壤養(yǎng)分狀況，提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)的潛力和能力。相關(guān)研究表明在間作條件下不同作物根系間的影響更加復(fù)雜密切，花生玉米間作比單一種植的根系能產(chǎn)生更多的側(cè)根，同時(shí)玉米和花生具有明顯的根系空間分布差異，在有效降低對(duì)養(yǎng)分資源競爭的同時(shí)，花生的固氮作用還可以促進(jìn)玉米對(duì)氮素的利用[52–53]。二者間作根系在土層之中的分布更加廣泛，為根際微生物提供更加立體豐富的生存空間，能夠提高土壤生物群落多樣性，促進(jìn)根際微生物的多樣性[54]，無疑也為外源根際促生菌在間作環(huán)境下根系的定植及應(yīng)用提供了更有利的環(huán)境。

有關(guān)植物根際促生菌篩選應(yīng)用的報(bào)道已有很多，本研究將目光聚集在花生玉米間作這一應(yīng)用環(huán)境下，針對(duì)化肥的“減施增效”這一生產(chǎn)問題，在花生根際分離篩選出的酸快生芽孢桿菌HS3，兼具多種促生功能于一身，在花生盆栽和花生玉米間作試驗(yàn)中對(duì)不同的作物均表現(xiàn)出了優(yōu)異的促生性能。為微生物菌劑在花生玉米間作的應(yīng)用提供了理論依據(jù)的同時(shí)也提供了一株優(yōu)質(zhì)微生物資源。也有相關(guān)研究表明酸快生芽孢桿菌具有生防功能[38]。菌株HS3是否具有分泌蛋白等促生能力以及生防功能，在實(shí)際生產(chǎn)中針對(duì)其它作物間作，如大豆/玉米，以及在輪作狀況下，對(duì)小麥?zhǔn)欠褚灿休^好的促生效果，同樣值得進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究篩選的一株酸快生芽孢桿菌‘HS3’具有較好的產(chǎn)IAA、溶有機(jī)磷、解鉀能力。其產(chǎn)IAA和最大解鉀能力的培養(yǎng)條件為：30℃、接種時(shí)間32 h，pH 6、裝液量 100 mL/250 mL、果糖、酵母粉，實(shí)現(xiàn)最大溶有機(jī)磷能力的培養(yǎng)條件為pH 6、裝液量100 mL/250 mL、蔗糖、尿素。土壤接種‘HS3’可顯著提高速效磷、速效鉀、IAA含量。土壤IAA含量、有效磷和速效鉀含量的增加是其提高花生和玉米產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素的主要原因。