李艾元, 施心雨, 劉夢(mèng)斐, 李 誠(chéng), 宣智宏, 岳萬(wàn)福

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,杭州 311300)

蠶絲作為一種多用途的高分子聚合物,在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用得到了廣泛的探索[1]。絲素蛋白是從蠶絲提取的纖維蛋白[2]。絲素蛋白由一條重(H)鏈和一條輕(L)鏈組成,通過(guò)二硫鍵相連,形成HL復(fù)合物[3]。這種HL復(fù)合物還通過(guò)疏水作用以6︰1的比例結(jié)合形成一種糖蛋白(P25),三者構(gòu)成基本膠束單元[4]。除了絲素蛋白外,蠶絲中還存在絲膠蛋白[5],當(dāng)蠶結(jié)繭時(shí),絲膠蛋白起到膠水的作用,絲膠蛋白將絲素蛋白結(jié)合在一起,絲膠蛋白占蠶絲的重量近30%[6]。絲素蛋白是一種生物相容性材料,因?yàn)樗粫?huì)引起長(zhǎng)期或持久的炎癥反應(yīng)[7]。當(dāng)植入人體內(nèi)時(shí),它會(huì)引起輕微的初始炎癥反應(yīng),并隨時(shí)間消退,表明絲素蛋白具有免疫相容性,與其他常見(jiàn)生物材料相比,絲素蛋白的免疫原性較低[8]。

湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具備分化成湖羊肌肉組織的能力,與本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象湖羊來(lái)自同源,不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。肌肉損傷和老化是人體肌肉主要的疾病形式[9]。肌肉損傷的修復(fù)過(guò)程首先需要激活肌肉衛(wèi)星細(xì)胞,因?yàn)樾录∪饫w維或原發(fā)性肌纖維的形成始于肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的激活[10]。其次是肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化階段,形成肌細(xì)胞。最后通過(guò)肌細(xì)胞融合形成肌纖維,并整合到現(xiàn)有的肌肉中,完成肌肉的自我修復(fù)[11]。盡管肌肉具有與生俱來(lái)的再生能力,但某些條件下自我修復(fù)最終達(dá)不到健康的肌肉組織的標(biāo)準(zhǔn),反而導(dǎo)致萎縮、發(fā)病和功能喪失[12]。例如,嚴(yán)重的車禍和大面積燒傷等意外中,肌肉組織的大量損失會(huì)阻礙修復(fù)過(guò)程并妨礙肌肉的功能恢復(fù)[13]。此外,某些肌肉萎縮疾病也可以阻止正常的肌肉組織再生過(guò)程[14]。肌肉衛(wèi)星細(xì)胞療法是增強(qiáng)肌肉修復(fù)的一種新的手段,采用自體或同種異體干細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)自身肌肉修復(fù)的能力[15]。

組織工程技術(shù)尚未生產(chǎn)出用于治療肌肉損傷的可靠產(chǎn)品,市面上人工合成物質(zhì)在人體內(nèi)難以降解并會(huì)引發(fā)免疫排斥反應(yīng),因此絲素蛋白水凝膠逐漸進(jìn)入人們的視野[16],絲素蛋白水凝膠能夠?yàn)榧?xì)胞提供附著點(diǎn)和與細(xì)胞發(fā)生特異性作用,可調(diào)節(jié)的物理支撐,連接水凝膠內(nèi)外的孔隙結(jié)構(gòu),進(jìn)行氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子的交換[17],因此非常適合作為肌肉組織再生的細(xì)胞支架[18-19]。利用水凝膠進(jìn)行肌肉組織工程已成為一種有希望的治療方案。例如,將絲素蛋白水凝膠用作封裝肌肉細(xì)胞的遞送載體,發(fā)現(xiàn)絲素蛋白水凝膠能夠促進(jìn)肌肉細(xì)胞的增殖和分化,絲素蛋白水凝膠能夠促進(jìn)肌肉細(xì)胞整合,同時(shí)保護(hù)移植細(xì)胞免受移植手術(shù)加劇的慢性炎癥環(huán)境的影響[20]。鑒于絲素蛋白水凝膠的多功能性,絲素蛋白水凝膠構(gòu)成了獨(dú)特的生物材料,廣泛用于組織工程研究及許多肌肉疾病和損傷病理學(xué)[21]。

圖1為DMPG誘導(dǎo)的絲素蛋白水凝膠制作工藝。首先將絲素蛋白溶解,得到絲素蛋白溶液,再將DMPG溶液加入到絲素蛋白溶液中,混合均勻后將細(xì)胞懸液加入到混合溶液中,然后用注射器將處于溶膠狀態(tài)的絲素蛋白水凝膠注射到動(dòng)物體內(nèi)[22]。期望通過(guò)這種方式獲得一種生物相容性良好的絲素蛋白水凝膠,能夠?yàn)槿祟愒偕t(yī)學(xué)植入治療肌肉損傷奠定基礎(chǔ)。

圖1 絲素蛋白水凝膠制作工藝示意Fig.1 Schematic diagram of silk fibroin hydrogel making process

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試 劑

PBS緩沖液(杭州浩克生物技術(shù)有限公司),碳酸氫鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、膠原酶Ⅳ、CCK-8試劑盒、DAPI溶液、4%多聚甲醛、曲拉通Triton X-100(北京索萊寶科技有限公司),溴化鋰(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),透析袋(上海索橋生物科技有限公司),F12培養(yǎng)基(杭州昊鑫生物科技有限公司),MYHC一抗、DESMIN一體、FITC標(biāo)記的二抗(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司),活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司),100 μm細(xì)胞篩網(wǎng)(康寧(上海)有限公司)。

1.2 儀 器

烘箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司),載玻片及蓋玻片(江蘇匯達(dá)醫(yī)療器械有限公司),SI-A256渦旋儀(秒生科技有限公司),MC2掌上離心機(jī)(上海吉泰生物科技有限公司),ECLIPSE E100顯微鏡、ECLIPSE C1熒光顯微鏡(NIKON),KE003068移液槍(Dragon公司),SU8010臺(tái)式掃描電子顯微鏡(日本松下公司),凍干機(jī)(香港力康發(fā)展有限公司),磁力攪拌器、iS50 FTIR傅里葉紅外測(cè)譜儀、純水儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司),KS-600D超聲波水域鍋(寧波海曙超聲科技設(shè)備有限公司)。

1.3 絲素蛋白的制備

參照文獻(xiàn)[23]的脫膠方法,利用絲素蛋白與絲膠蛋白溶解度不同來(lái)獲得絲素蛋白,首先將蠶絲用剪刀剪為2～4 cm長(zhǎng)度,按1︰200的浴比放入0.5%的碳酸氫鈉溶液中煮沸30 min,期間每隔15 min用玻璃棒翻一次,煮好后用去離子水洗脫3次,此時(shí)絲膠蛋白溶解在0.5%碳酸氫鈉溶液中;蠶絲煮好后用去離子水清洗6次,最后將脫膠的蠶絲放入烘箱,溫度設(shè)置為37 ℃,干燥12 h后放入通風(fēng)干燥處保存,即可得到絲素蛋白。

1.4 絲素蛋白溶液的制備

參照文獻(xiàn)[23]的溶解方法,首先配置摩爾濃度為9.3 mol/L的溴化鋰溶液。即1 L的燒杯中稱取807.7 g無(wú)水溴化鋰,加入600 mL超純水溶解,使用磁力攪拌器使溴化鋰完全溶解,冷卻后加水到1 000 mL,使用循環(huán)水真空泵過(guò)濾溶液至澄清,得到澄清的9.3 mol/L的溴化鋰溶液。將脫膠干燥后的絲素蛋白撕扯成蓬松的棉花狀,事先將溴化鋰溶液放入60 ℃的烘箱中預(yù)熱30 min,之后將絲素蛋白與溴化鋰溶液按照1︰4的溶質(zhì)比溶解,絲素蛋白完全沒(méi)入溴化鋰溶液后再放入60 ℃恒溫烘箱中繼續(xù)溶解2 h,期間每隔15 min拿出來(lái)攪拌一次,溶解完畢后得到黃色的絲素蛋白—溴化鋰混合溶液。將混合溶液放入透析袋中透析3 d,紗布過(guò)濾之后低溫高速離心機(jī)7 000 r/min離心20 min,上清液用0.22 μm針頭濾器過(guò)濾后放入4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的獲取

湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離采用膠原酶消化法:1) 無(wú)菌條件下,剝離湖羊胎兒后肢腿部肌肉組織,用75%乙醇輕微浸泡消毒后立即用PBS沖洗2次,放入盛有PBS的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中;2) 利用眼科剪將肌肉組織剪碎,加入適量Ⅳ型膠原酶后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化15 min,每隔5 min取出吹打一次,共3次;3) 消化結(jié)束后,加入2倍體積A培養(yǎng)基(F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清)終止消化,用100目細(xì)胞篩過(guò)濾并收集細(xì)胞懸液至15 mL離心管中,低速離心機(jī)室溫1 200 r/min離心15 min,棄上清液;4) 加入B培養(yǎng)基(F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗)重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液接種至100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。正常傳代培養(yǎng)凍存,生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,后續(xù)用于注射湖羊體內(nèi)。

1.6 湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的傳代與凍存

將湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞傳至P2—P5代,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),在細(xì)胞密度至少達(dá)到1×106mL時(shí),進(jìn)行傳代培養(yǎng),按照1︰3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的凍存液采用“現(xiàn)配現(xiàn)用”的原則,將胎牛血清與二甲基亞砜(DMSO)按照10︰1的比例進(jìn)行配比,在細(xì)胞密度達(dá)到1×106mL進(jìn)行凍存。具體步驟為:在無(wú)菌條件下,首先用PBS洗去培養(yǎng)基,加入1 mL的胰酶進(jìn)行消化,消化結(jié)束后,加入2倍體積A培養(yǎng)基(F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清)終止消化,低速離心機(jī)室溫1 200 r/min離心5 min,棄上清液,加入1 mL凍存液重新懸浮細(xì)胞,放入2 mL凍存管中,將凍存管放入凍存盒中,-80 ℃保存24 h后放入液氮長(zhǎng)期保存。

1.7 湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定

1) 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至70%～80%密度;

2) 移除培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS緩沖液洗5次,每孔加入200 μL的4%多聚甲醛,將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入冰上,固定15 min;

3) 移液槍移除多聚甲醛,用PBS洗5次,每孔加入200 μL 0.25% Triton X-100對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化10 min;

4) 移除0.25% Triton X-100,之后用PBS洗5次,每孔加入200 μL封閉液(含0.25% Triton X-100的PBS),放入4 ℃過(guò)夜;

5) 移除封閉液,用PBS洗5次,按照1︰100的比例稀釋一抗,每孔加入100 μL一抗稀釋液,4 ℃孵育24 h;

6) 移除一抗,用PBS洗5次,按1︰50的比例稀釋二抗,每孔加100 μL二抗稀釋液,室溫避光孵育1 h;

7) 移除二抗稀釋液,用PBS洗5次,每孔加入100 μL DAPI染液,避光孵育15 min,PBS洗5次,徹底洗去DAPI染液,使用熒光顯微鏡觀察。

1.8 絲素蛋白水凝膠的制備

制備的方法采用物理混合的方法,將絲素蛋白溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%),分別與三種摩爾濃度DMPG溶液混和。具體過(guò)程為:首先將DMPG與去離子水水和,然后超聲波水浴加熱30 min,將絲素蛋白溶液烘干稱重(一般為6%),兩者混合后保持DMPG的終摩爾濃度依次為5、10、15 mmol/L,絲素蛋白終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,制得三種摩爾濃度的膠塊,放入4 ℃以便后續(xù)測(cè)定使用。

1.9 水凝膠結(jié)構(gòu)測(cè)試

取適量?jī)龈珊蟮乃z樣品于研缽中,加入溴化鉀研磨均勻,壓片并在傅里葉紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)試。儀器的分辨率為4 cm-1,掃描32次,檢測(cè)范圍為4 000～400 cm-1。譜圖的采集和分析均使用Thermo Fisher公司的OMNIC 8.0軟件,并將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Prism 8.0中進(jìn)行繪制。

1.10 細(xì)胞活力影響測(cè)定

選擇生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞,使用浸提液的方法測(cè)定絲素蛋白水凝膠對(duì)細(xì)胞毒性的影響。具體步驟為:1) 將絲素蛋白水凝膠材料用75%乙醇浸洗5 min,然后用磷酸緩沖溶液PBS浸洗5 min,反復(fù)3次后加入純培養(yǎng)基直至沒(méi)過(guò)材料,靜置24 h后作為浸提液備用;2) 在96孔板中接種湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞懸液,在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃、5% CO2),更換細(xì)胞培養(yǎng)液,然后加入10 μL先前制備好的絲素蛋白水凝膠浸提液,不加浸提液作為空白組;3) 將培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～48 h,取出湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)板,向板的每個(gè)孔中加入110 μL CCK-8培養(yǎng)基混合液,將細(xì)胞板在培養(yǎng)箱中孵育30 min后取出,然后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔吸光度,取平均值并通過(guò)對(duì)照組評(píng)定材料的細(xì)胞毒性。

1.11 Masson切片染色及分析

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(P2—P5代)的湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞,細(xì)胞密度控制在1×105mL,終摩爾濃度DMPG為10 mmol/L,絲素蛋白終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%,分裝低溫運(yùn)送至羊場(chǎng),無(wú)菌混合后,10 min后注射入湖羊耳朵,無(wú)細(xì)胞組作為對(duì)照,每組加一個(gè)不做處理的空白,做好標(biāo)記歸圈飼養(yǎng)。采集不同天數(shù)的湖羊組織耳朵組織進(jìn)行Masson染色,先將石蠟切片脫蠟至水,再將切片放入無(wú)水乙醇和二甲苯等量混合溶液中15 min,接著在二甲苯溶液中處理20～40 min;然后在100%無(wú)水乙醇中處理10 min,95%無(wú)水乙醇中處理5 min,90%無(wú)水乙醇中處理5 min,80%無(wú)水乙醇中處理5 min,70%無(wú)水乙醇中處理5 min;最后使用蒸餾水洗。重鉻酸鉀媒染劑過(guò)夜,切片脫蠟至水后,重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液常溫過(guò)夜(約17 h)。Masson染色試劑盒內(nèi)麗春紅酸性品紅液染5～10 min,蒸餾水快速漂洗。

磷鉬酸處理:Masson染色試劑盒內(nèi)磷鉬酸水溶液處理1～2 min。苯胺藍(lán)染色:不用水洗,直接用Masson染色試劑盒內(nèi)苯胺藍(lán)液復(fù)染5 s。分化:三缸1%冰醋酸依次處理5～10 s。脫水封片:三缸無(wú)水乙醇、正丁醇分別快速脫水15～30 s,二甲苯透明,中性樹(shù)脂膠封片。顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

染色結(jié)果:膠原纖維、黏液、軟骨呈藍(lán)色;肌纖維、纖維素和紅細(xì)胞呈紅色。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

從圖2可以看出,湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具備了分化為肌肉細(xì)胞的能力。將分離得到的湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),將P2代(圖2(a))湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞放在顯微鏡下觀察,湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞增殖能力強(qiáng),細(xì)胞相互之間聚集但未發(fā)生融合,復(fù)合肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的特征;將P5代(圖2(b))湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞放在顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)肌肉細(xì)胞相互融合,而且細(xì)胞形態(tài)向成熟的肌細(xì)胞發(fā)生改變,細(xì)胞增殖能力下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證湖羊肌肉細(xì)胞是否為肌肉細(xì)胞,在P2代(圖2(c))做免疫熒光染色,P2代湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞未檢測(cè)到Myod1細(xì)胞表面標(biāo)志物(綠色熒光)的表達(dá),只表達(dá)了細(xì)胞核的藍(lán)色熒光;將培養(yǎng)至P5代(圖2(d))做免疫熒光,檢測(cè)到Myod1細(xì)胞表面標(biāo)志物(綠色熒光)的表達(dá),說(shuō)明湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)了肌肉相關(guān)的表面標(biāo)志物。提取的湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具備了分化為肌肉細(xì)胞的能力,且細(xì)胞活力較好。

圖2 湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.2 Hu sheep muscle satellite cell identification results

2.2 絲素蛋白水凝膠紅外光譜圖

從圖3結(jié)果可以看出,絲素蛋白水凝膠支撐結(jié)構(gòu)主要是β折疊。紅外結(jié)果顯示,DMPG并沒(méi)有改變絲素蛋白水凝膠的結(jié)構(gòu),加快凝膠的原理是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)之間的靜電和或疏水相互作用,誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。各個(gè)摩爾濃度的紅外光譜如圖3(b)所示,可以看出10 mmol/L和15 mmol/L的絲素蛋白水凝膠在波長(zhǎng)為1 632 cm-1(酰胺Ⅱ譜帶)、1 523 cm-1(酰胺Ⅱ譜帶)、2 930 cm-1(C—H伸縮振動(dòng))3 280 cm-1(—COOH)處出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的特征吸收峰;5 mmol/L的DMPG蛋白特征峰不明顯。DMPG誘導(dǎo)的絲素蛋白水凝膠的蛋白質(zhì)特征峰未發(fā)生偏移,保留了主要的酰胺Ⅱ結(jié)構(gòu)中的β折疊結(jié)構(gòu)。

圖3 傅里葉紅外結(jié)果Fig.3 Fourier infrared results

2.3 絲素蛋白水凝膠生物相容的測(cè)定

從圖4可以看出,DMPG誘導(dǎo)的絲素蛋白水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性。本文分別選取了不同摩爾濃度DMPG,依次為5、10、15 mmol/L,絲素蛋白濃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。從圖4(a)可以看出,加入絲素蛋白浸提液12 h后,三組OD值幾乎沒(méi)有差異,最高的是10 mmol/L絲素蛋白水凝膠處理組;從圖4(b)可以看出,10 mmol/L的絲素蛋白水凝膠與細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,OD值幾乎沒(méi)有任何變化,其余處理組OD值降低,其中空白處理組高于5 mmol/L和15 mmol/L處理組;從圖4(c)可以看出,10 mmol/L的絲素蛋白水凝膠與細(xì)胞培養(yǎng)36 h后,OD值升高,空白對(duì)照組OD值與24 h的OD值沒(méi)有發(fā)生變化;從圖4(d)的結(jié)果可以看出,細(xì)胞與絲素蛋白水凝膠浸提液共培養(yǎng)48 h后,只有10 mmol/L的OD值保持在2.0左右的水平,其余處理組均徘徊在1.0～1.2。結(jié)果反映出了不同摩爾濃度之間的絲素蛋白水凝膠對(duì)細(xì)胞的影響,其中10 mmol/L處理組的隨著與細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加OD值逐漸增加,OD值反映了細(xì)胞活力的大小,細(xì)胞活力越大,OD值越高,10 mmol/L的絲素蛋白水凝膠是3種摩爾濃度中細(xì)胞相容性最好的。

圖4 不同摩爾濃度的絲素蛋白水凝膠浸提液對(duì)細(xì)胞OD值影響的結(jié)果Fig.4 Results of the effect of the silk filament hydrogel extract of different mol concentrations on the cell OD value

2.4 肌肉生成與支架降解的分析

從圖5可以看出,絲素蛋白水凝膠能夠在湖羊體內(nèi)凝結(jié),并且使水凝膠內(nèi)的湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化為新的肌肉組織,最后隨著植入天數(shù)的增加,絲素蛋白水凝膠逐漸降解。從圖5(a)可以看出,絲素蛋白水凝膠在第11天時(shí)基本降解完成;從圖5(b)可以看出,絲素蛋白水凝膠(含湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞)在湖羊體內(nèi)凝結(jié),藍(lán)色區(qū)域?yàn)槟z原纖維,即絲素蛋白水凝膠;從圖5(c)可以看出,絲素蛋白水凝膠(不含湖羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞)在湖羊體內(nèi)凝結(jié),藍(lán)色區(qū)域比含細(xì)胞的水凝膠較小;從圖5(d)可以看出,正常肌肉組織的狀態(tài),與植入水凝膠的肌肉組織形成鮮明的對(duì)照。圖5(e～g)則直觀地顯示了絲素蛋白水凝膠在植入湖羊體內(nèi)1～11 d過(guò)程中水凝膠發(fā)生降解和肌肉再生,Masson染色將絲素蛋白水凝膠染成藍(lán)色,藍(lán)色部分隨著植入湖羊體內(nèi)的天數(shù)逐漸降解;同時(shí),Masson染色將肌纖維染成紅色,紅色部分隨著植入的天數(shù)增加逐漸成熟,肌纖維數(shù)量更多而且直徑變粗。

圖5 不同天數(shù)水凝膠層Masson染色結(jié)果Fig.5 Masson staining result of hydrogel layers for different days

3 結(jié) 論

通過(guò)實(shí)驗(yàn),本文獲得了一種高效、簡(jiǎn)易、無(wú)免疫原性、可降解的絲素蛋白水凝膠細(xì)胞支架。具體結(jié)果如下:

1) DMPG誘導(dǎo)絲素蛋白形成的水凝膠是一種可注射的水凝膠,且結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。

2) DMPG誘導(dǎo)的絲素蛋白水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性,其中摩爾濃度10 mmol/L的細(xì)胞相容性最好。

3) DMPG誘導(dǎo)的絲素蛋白水凝膠具有良好的生物相容性,在湖羊體內(nèi)凝結(jié)而且成功實(shí)現(xiàn)肌細(xì)胞到肌纖維再到肌肉組織的分化過(guò)程。

《絲綢》官網(wǎng)下載

中國(guó)知網(wǎng)下載