吳建兵, 李靖雯, 周欣楠, 孫銀銀, 王永峰

(1.常熟理工學(xué)院 紡織服裝與設(shè)計(jì)學(xué)院,江蘇 蘇州 215500; 2.中國科學(xué)院 蘇州納米技術(shù)與納米仿生所國際實(shí)驗(yàn)室,江蘇 蘇州 215123)

癌癥已嚴(yán)重威脅人類生命健康,隨著全球老年化進(jìn)程加快,癌癥發(fā)病率和致死率都在迅速上升,給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。手術(shù)切除和放射療法是目前最直接、最有效的治療手段,但僅適用于局部和非轉(zhuǎn)移性腫瘤。早期癌癥具有隱匿性,當(dāng)病人出現(xiàn)不適癥狀時(shí)已發(fā)展到中晚期,只能依靠化學(xué)療法控制[2]?？拱┗熕幬镌谌梭w分布具有隨機(jī)性,癌細(xì)胞被殺傷的同時(shí)也會(huì)損傷正常細(xì)胞。除此之外,抗癌藥物存在血液循環(huán)清除快、易脫靶,生物利用度低等問題[3]。因此化學(xué)療法的弊端逐漸顯現(xiàn),包括給藥次數(shù)多,周期長,且對(duì)器官毒副作用大,易誘發(fā)神經(jīng)病變、自身免疫系統(tǒng)及泌尿生殖系統(tǒng)功能障礙。從而導(dǎo)致其療效不佳,病人順應(yīng)性差[4]。如何針對(duì)中晚期癌癥病人,靈活選擇對(duì)患者順應(yīng)性高、抗毒副作用低、生物利用度高、耐受性好的治療方法是目前醫(yī)學(xué)界亟須解決的關(guān)鍵問題。利用腫瘤組織與正常組織環(huán)境的差異,包括血管密度、滲透性及細(xì)胞外基質(zhì)中特異性蛋白等來設(shè)計(jì)多功能靶向給藥系統(tǒng),使得藥物能在較長時(shí)間內(nèi)滯留在腫瘤微環(huán)境中,促使癌細(xì)胞徹底凋亡且不再復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是抗癌藥物精準(zhǔn)高效治療的有效策略。

抗癌藥物遞送系統(tǒng)是將抗癌藥物裝載在無機(jī)或有機(jī)高分子聚合物基質(zhì)中,通過不同給藥途徑進(jìn)入人體,再經(jīng)血液循環(huán)將藥物遞送至癌變部位,在較長時(shí)間內(nèi)維持藥物治療濃度,充分發(fā)揮藥物療效的技術(shù)[5]。因此,在穩(wěn)定藥物活性、精準(zhǔn)靶向給藥、控制藥物釋放、降低藥物毒性、提高藥物療效等方面具有突出優(yōu)勢(shì)。遞送載體尺寸決定了給藥方式,納米級(jí)一般經(jīng)靜脈注射后通過全身血液循環(huán)到達(dá)腫瘤部位[6];而微米級(jí)需要通過局部給藥鎖定在靶向?qū)嶓w瘤中,長時(shí)間不斷地向腫瘤微環(huán)境中釋放藥物,維持藥物濃度[7]。相比于微米級(jí)載體,納米級(jí)可直接經(jīng)被、主動(dòng)方式進(jìn)入癌變細(xì)胞內(nèi),靶向更精準(zhǔn),可顯著提高藥物生物利用度[8]。被動(dòng)靶向是指遞送載體能在血液循環(huán)中利用腫瘤組織與正常組織中的血管密度及滲透性差異自發(fā)滯留,或作為異物被免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞吞噬等途徑進(jìn)入細(xì)胞中;主動(dòng)靶向是指在遞送載體表面先修飾靶向分子,再與腫瘤微環(huán)境中的特異性受體結(jié)合后經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞中,完成藥物釋放,促使癌細(xì)胞凋亡,作用方式如圖1[9]所示。

抗癌藥物在靶向遞送過程中,存在一系列問題,包括易與血漿蛋白之間發(fā)生非特異性吸附,易被腎臟排泄或被肝臟中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial system, RES)攝取,使得靶器官中的藥物濃度低,生物利用度差。將抗癌藥物負(fù)載在納米脂質(zhì)體中減少腎排泄較易被實(shí)現(xiàn)[10],而如何減少并避免藥物被肝臟RES攝取仍是重大挑戰(zhàn)。目前使用高分子聚合物納米顆粒進(jìn)行藥物遞送是解決該問題的高效方法之一[11]。載體材料的穩(wěn)定性和生物相容性是抗癌藥物遞送系統(tǒng)研究的前提和基礎(chǔ)。作為抗癌藥物遞送的納米顆粒在制備及功能化設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮四條原則:1) 穩(wěn)定抗癌藥物活性、降低抗癌藥物在血液循環(huán)中的損失及對(duì)正常組織的毒副作用;2) 需對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾,避免直接被人體代謝器官例如肝臟中的免疫細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等清除,延長其在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間;3) 充分利用腫瘤微環(huán)境促使納米微粒透過內(nèi)皮富集作用,加快其透過血管內(nèi)皮,再滲透至靶向部位;4) 持久可控釋放,加快腫瘤細(xì)胞凋亡同時(shí)降低耐藥性風(fēng)險(xiǎn)[12]。目前載體材料來源主要包括天然聚合物和合成聚合物兩種。合成聚合物主要以聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)[13],聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)[14],聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone,PCL)[15],聚乙醇酸(Polyglycolic acid,PGA)[16],聚乳酸羥基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)[17]為主,盡管合成聚合物在抗癌藥物遞送系統(tǒng)中的研究取得突破進(jìn)展,但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在問題。如PLGA等聚合物材料體內(nèi)降解時(shí)的酸性產(chǎn)物會(huì)與大分子抗癌藥物發(fā)生?；磻?yīng)[18];在藥物制劑高溫滅菌過程中,PLGA等會(huì)發(fā)生降解,無法對(duì)抗癌藥物起到穩(wěn)定和保護(hù)。另外,在納米顆粒制備過程中添加有機(jī)溶劑、引發(fā)劑等化學(xué)物質(zhì),藥物制劑存在安全隱患[19]。相比合成聚合物,天然聚合物可塑性強(qiáng),可通過物理或化學(xué)方法靈活、高效負(fù)載抗癌藥物,穩(wěn)定抗癌藥物活性的同時(shí),實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的可控、精準(zhǔn)釋放,且能在自然環(huán)境中進(jìn)行酶降解,降解產(chǎn)物對(duì)人體和環(huán)境均無害[20]。基于此,本文重點(diǎn)對(duì)作為天然聚合物熱點(diǎn)材料之一的絲蛋白,從絲蛋白的結(jié)構(gòu)與性能、絲蛋白納米顆粒(Silk fibroin nanoparticles,SF NPs)的制備方法機(jī)理及優(yōu)缺點(diǎn)、理化性能(粒徑、表面電荷、穩(wěn)定性)對(duì)抗癌藥物裝載、釋放的影響及其用于被、主動(dòng)靶向中的具體研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)闡述,為發(fā)展基于SF NPs負(fù)載抗癌藥物實(shí)現(xiàn)高效遞送及治療研究提供思路。

1 絲蛋白的結(jié)構(gòu)與性能

國內(nèi)外已有多項(xiàng)研究證實(shí),蠶絲或蜘蛛絲中的絲蛋白具有優(yōu)異的生物相容性、極低的免疫原性,且已經(jīng)作為生物材料被廣泛運(yùn)用[21-22]。蜘蛛絲力學(xué)和防水性能優(yōu)異,但同類相食,產(chǎn)量低、成本高,來源受限[23]。目前,家蠶和柞蠶是絲蛋白最主要的兩類來源(圖2)[24]。蠶絲蛋白由18種氨基酸組成,基本結(jié)構(gòu)是由相對(duì)分子質(zhì)量約為350 kDa的重鏈、25 kDa的輕鏈及起連接作用的二硫鍵構(gòu)成的二聚體。蠶絲蛋白(Silk fibroin,SF)由疏水結(jié)晶區(qū)和親水非結(jié)晶區(qū)交替構(gòu)成(圖3)[24],其中,結(jié)晶區(qū)由α-螺旋、β-折疊(亞穩(wěn)定狀態(tài)正交晶系的Silk Ⅰ-平行β-折疊、穩(wěn)定狀態(tài)單斜晶系的Silk Ⅱ-反平行β-折疊)兩種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。

圖2 絲蛋白的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)特性Fig.2 Key advantageous properties of silk proteins

相比無定形態(tài)和Silk Ⅰ,Silk Ⅱ的構(gòu)象最穩(wěn)定(圖4)[25]。SF二級(jí)結(jié)構(gòu)可相互轉(zhuǎn)換,全水相下的SF以無規(guī)卷曲為主,其在外界因素影響下,例如溫度[26]、濕度[27]、pH值[28]、剪切力[29]、金屬離子[30]、溶劑種類[31]等條件可促使無規(guī)卷曲向β-折疊轉(zhuǎn)變。因此利用這些特性可調(diào)控SF中無定形、Silk Ⅰ、Silk Ⅱ三者之間的比例,增加SF NPs中Silk Ⅱ的比例有助于疏水性抗癌藥物,包括姜黃素、紫杉醇裝載效率的提升[12],且載體基質(zhì)的穩(wěn)定性、降解性、抗癌藥物的負(fù)載及釋藥性能均可調(diào)控。總而言之,SF在抗癌藥物遞送方面具有顯著優(yōu)勢(shì):1) 具有優(yōu)異的生物相容性、生物安全性,免疫原性低;2) 高度重復(fù)的疏水晶體與親水非晶體交替排列,可形成納米微纖網(wǎng)絡(luò),有利于小分子抗癌藥物的高效負(fù)載并實(shí)現(xiàn)可控釋放;3) 具有豐富的活性氨基酸,例如酪氨酸、賴氨酸、精氨酸等,可為抗癌藥物的共價(jià)耦聯(lián)或化學(xué)修飾提供足夠的反應(yīng)位點(diǎn),有助于主動(dòng)靶向遞送;4) 可在全水相下自組裝形成納米顆粒,避免了有機(jī)溶劑添加對(duì)多肽、蛋白質(zhì)等具有生物活性抗癌藥物穩(wěn)定性的影響[9],藥物療效和生物安全性得到保證;5) 明膠等高分子材料易在高溫下發(fā)生變性交聯(lián)反應(yīng)和降解,而SF作為結(jié)構(gòu)蛋白,可與多種滅菌方法兼容,作為抗癌活性藥物制劑的穩(wěn)定劑和保護(hù)劑;6) 可被細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解后補(bǔ)充天然組織的營養(yǎng)成分,能滿足載體降解的關(guān)鍵要求。因此SF可成為理想的抗癌藥物遞送載體材料。

圖3 蠶絲蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的示意Fig.3 Schematic diagram of the relationship between primary and secondary structure of silk fibroin

圖4 桑蠶絲蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Secondary structure of mulberry silk protein

2 SF納微米顆粒的形成原理及制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)

SF由親水氨基酸(如谷氨酸)和疏水氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)組成,其分子間的親/疏性鏈段排列交替且規(guī)整,SF在選擇性溶劑中能發(fā)生自組裝而形成膠束[32]、聚集體[33]等不同結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定形態(tài),也可通過油相[34],電壓[35],超臨界CO2[36]、直接噴霧[37]等不同途徑先獲得SF液滴,再在外界刺激下(溫度[38]、濕度[39]、離子強(qiáng)度[40]、變性劑[41])誘導(dǎo)SF的構(gòu)象發(fā)生改變(從無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變到β-折疊),進(jìn)而形成穩(wěn)定的水不溶的SF納微米顆粒。根據(jù)SF的雙親性和自組裝特性,可將SF納微米顆粒的形成原理分為“從小到大”和“從大到小”兩種。

2.1 “從小到大”

SF納微米顆?！皬男〉酱蟆钡男纬稍硎荢F先由分子自組裝形成納米晶核,緊接著形成多晶核的聚集體顆粒。具體過程是全水相的SF溶液在變性劑[41]、pH值[42]、低溫[32]等條件下先誘導(dǎo)SF形成納米晶核,再在氫鍵、離子鍵、疏水作用力等作用下進(jìn)一步自組裝形成穩(wěn)定的納米顆粒,其中SF的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)從不穩(wěn)定的無規(guī)卷曲向穩(wěn)定的β-折疊轉(zhuǎn)變,該原理涉及的制備方法主要包括鹽析法、反溶劑法等(圖5)[21]。

圖5 制備絲蛋白納米顆粒方法的示意Fig.5 Schematic summary of techniques for the preparation of silk nanoparticles

2.2 “從大到小”

“從大到小”的形成原理又細(xì)分為兩種,一種是從SF溶液出發(fā),SF溶液先均勻分散成納微米小液滴,再去水固化。干燥過程包括瞬間高溫固化[37]、60 ℃烘箱緩慢干燥[43]及在常溫液中干燥等[41],此時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主,需再經(jīng)甲醇[41]、水蒸氣[39]等后處理才能形成穩(wěn)定的SF納微米球(高β-折疊含量),也可通過添加化學(xué)交聯(lián)劑(京尼平[44]、戊二醛[45])使液滴固化成球,制備方法主要包括靜電噴霧干燥法、超臨界流體法、微乳化法(圖5)[21]。另外一種是從蠶絲纖維出發(fā),將蠶絲纖維直接通過“攪拌球磨”[46]或“氣流粉碎碾磨”[47]等方式獲得粒徑較大、β-折疊含量較高(>60%)的SF微米顆粒,但形貌規(guī)整性差,顆粒之間黏連嚴(yán)重,粒徑分布范圍較廣。除了機(jī)械粉碎法外,“從小到大”和“從大到小”的形成原理有關(guān)鍵共同點(diǎn),先選擇合適的分散劑促使SF分子形成納米晶核或者液滴,再通過外界刺激誘導(dǎo)SF分子構(gòu)象進(jìn)一步發(fā)生轉(zhuǎn)變,形成水不溶的β-折疊,進(jìn)而賦予SF納微米球良好的穩(wěn)定性和分散性。

2.3 制備方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

在SF納微米球形成原理分類的基礎(chǔ)上,詳細(xì)比較了用于抗癌藥物遞送SF NPs的制備方法及各自的優(yōu)缺點(diǎn),如表1所示。靜電噴霧干燥、機(jī)械破碎及微乳法得到的是較大粒徑的SF微米顆粒(>1 μm),易被肺、肝臟、腎臟等器官代謝。而“從小到大”的鹽析法、反溶劑法,在制備方法、工藝參數(shù)及SF NPs的理化性能,對(duì)疏水性抗癌藥物的裝載及釋放等方面更具有優(yōu)勢(shì),因此在抗癌藥物裝載和遞送應(yīng)用中研究較多[9,21]。

表1 不同方法制備絲蛋白納米顆粒的原理分類及優(yōu)缺點(diǎn)Tab.1 Mechanism classification and merits and demerits of silk nanoparticles prepared by different methods

3 SF NPs理化性能對(duì)抗癌藥物療效的影響

SF NPs的尺寸、電荷分布、β-折疊含量、分散性、穩(wěn)定性及化學(xué)可修飾性等性能,對(duì)抗癌藥物的選擇、裝載、釋放及療效均有至關(guān)重要的影響。

3.1 尺寸與電荷分布

在靶向納米顆粒的藥物遞送體系中,腫瘤組織中納米顆粒的含量及抗癌藥物對(duì)癌細(xì)胞的療效需重點(diǎn)考慮,而納米顆粒的尺寸是靶向體系中的關(guān)鍵控制因素。另外,納米顆粒的表面電荷對(duì)于細(xì)胞內(nèi)化和抗癌藥物的遞送也具有重要作用。相比于帶正電荷的納米顆粒(非特異性吸附強(qiáng),腎臟過濾快),帶負(fù)電荷和中性電荷的納米顆粒對(duì)延長血液循環(huán)耐受性及提升腫瘤吞噬和穿透能力更具有優(yōu)勢(shì)[52]。Seib等[48]利用去溶劑法制備了粒徑為98 nm、電位為(-33.6±5.8) mV的SF NPs(PdI為0.109)。在此基礎(chǔ)上,通過靜電吸附將正電荷的阿霉素(Doxorubicin,Dox)裝載到負(fù)電荷的SF NPs中(Silk fibroin-doxorubicin nanoparticles,SF-Dox NPs,裝載量為40 ng/μg),裝載效率超過95%,且可通過pH值調(diào)控Dox的體外釋放速率(pH 4.5>6.0>7.4)。另外對(duì)MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)的體外研究表明,SF-Dox NPs相比于Dox的抗癌療效更顯著。Chen等[50]利用乙醇凍融法制備了粒徑分布為270～520 nm、電位為-17.0～-26.8 mV的絲蛋白-紫杉醇納米顆粒(Silk fibroin-paclitaxel nanoparticles,SF-Ptx NPs)。紫杉醇(Paclitaxel,Ptx)的包埋率和載藥率最高分別達(dá)到100%和6.9%,封裝率、載藥率、體外釋放速率受絲蛋白濃度、SF NPs的粒徑、絲蛋白β-折疊含量及Ptx的含量影響。在此研究基礎(chǔ)上,Wu等[53]制備了粒徑更小的SF-Ptx NPs(約130 nm),通過細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn),相比于SF NPS,Ptx的加載增強(qiáng)了其對(duì)BGC-823、SGC-7901(胃癌細(xì)胞)的毒性。此外,SF-Ptx NPs在裸鼠體內(nèi)抑制胃癌腫瘤生長和減少腫瘤質(zhì)量的療效均優(yōu)于Ptx。因此其基本規(guī)律是:在保證相同載藥量的前提下,SF NPs的粒徑小于100 nm更具有優(yōu)勢(shì)。Wu等[54]進(jìn)一步地聯(lián)合疏水性的Ptx和親水性的Dox兩種藥物,通過乙醇析出法制備了雙載藥SF NPs,通過改變?cè)偕z蛋白溶液和乙醇的濃度進(jìn)而調(diào)控載藥納米球的粒徑(100～600 nm),隨后將其通過靜脈注射應(yīng)用于淋巴化療,研究發(fā)現(xiàn)雙載藥SF NPs中Ptx和Dox的藥物釋放可持續(xù)超過7 d。此外,雙載藥SF NPs可通過內(nèi)吞作用表現(xiàn)出高細(xì)胞攝取。重要的是,相比于相同濃度的單一藥物SF NPs或游離藥物,雙載藥SF NPs在當(dāng)Ptx/Dox比為1︰1時(shí),表現(xiàn)出更高效的抑制HeLa(宮頸癌細(xì)胞)、HepG-2(肝癌細(xì)胞)生長。因此制備粒徑可控的雙載藥SF NPs可能對(duì)聯(lián)合化療具有重要的臨床意義。Rahmani等[55]利用丙酮析出法優(yōu)化了制備負(fù)載5-氟尿嘧啶(5-Fu)的SF NPs的最佳配方(質(zhì)量比為1︰1),粒徑和電位分別為220 nm和-32 mV時(shí),包埋率和裝載率達(dá)到最高,分別為52.3%和34.3%,且體外釋放速率與5-Fu在SF NPs中的分布形式及相互作用(氫鍵、范德華力)有關(guān)。與游離藥物相比,SF-5-Fu NPs對(duì)MCF-7和HT-29(人結(jié)腸癌細(xì)胞)的毒性明顯增強(qiáng)?？偠灾?SF NPs的尺寸及電荷分布直接決定其能否通過主被動(dòng)靶向方式順利進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi),是影響抗癌藥物療效發(fā)揮的核心指標(biāo)。

3.2 β-折疊含量

通過改變pH值調(diào)控SF分子中的電荷分布,也能改變SF NPs中的β-折疊含量,進(jìn)而調(diào)控抗癌藥物的裝載量和體內(nèi)藥代釋放動(dòng)力學(xué)[49]。SF中的疏水結(jié)晶區(qū)和親水無定形區(qū)可高效裝載親疏水性抗癌藥物,并提高疏水性抗癌藥物的水溶性,且SF NPs中無定形、Silk Ⅰ、Silk Ⅱ三者之間的比例可決定抗癌藥物的體內(nèi)釋放速率。Coburn等[56]將Dox包埋在絲素蛋白膜中,并系統(tǒng)深入研究了不同結(jié)晶度絲蛋白膜對(duì)Dox體外釋放動(dòng)力學(xué)的影響,研究結(jié)果證實(shí)了相比于結(jié)晶度低的絲蛋白膜,結(jié)晶度高的(高β-折疊含量)更能緩釋Dox,β-折疊含量高的絲蛋白膜更致密且擴(kuò)散更慢,這也為后期制備裝載其他小分子抗癌藥物的SF NPs提供了研究思路。在此基礎(chǔ)上,Wu等[57]利用絲素蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)與姜黃素的疏水性苯酚基團(tuán)相互作用,制備了負(fù)載姜黃素的SF NPs,顯著提高了姜黃素的水溶性,使其口服生物利用度提高了17倍。

3.3 分散性及穩(wěn)定性

SF NPs的分散性及穩(wěn)定性對(duì)癌細(xì)胞的攝取有影響,其分散性和穩(wěn)定性分別受電荷分布和肽段間氫鍵維系的β-折疊片層結(jié)構(gòu)和二硫鍵等化學(xué)鍵的影響。Xiao等[58]優(yōu)化了蠶絲的溶解體系,通過改變溴化鋰與甲酸的混合比例對(duì)脫膠絲進(jìn)行溶解(維持絲蛋白分子間的弱氫鍵相互作用),經(jīng)透析純化直接得到粒徑分布為100～200 nm、以無規(guī)卷曲為主要構(gòu)象的絲蛋白納米顆粒(SNPs-F),分散性和穩(wěn)定性比有機(jī)溶劑析出法(SNPs-A)進(jìn)一步提升。Dox的裝載效率受兩者(絲蛋白與Dox)之間的比例調(diào)控(10%～100%),裝載量比前人進(jìn)一步提高,達(dá)到100 ng/μg。另外,弱酸性條件(pH 4.5)可加快Dox的體外釋放(8 d累計(jì)釋放速率大于45%)。隨后,通過細(xì)胞攝取和毒性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),SNPs-F比SNPs-A更易被MCF-7細(xì)胞吞噬內(nèi)化,且對(duì)癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性,這可能與納米顆粒的粒徑和穩(wěn)定性(SNPs-F不易聚集)有關(guān)。Li等[59]利用去溶劑法制備平均粒徑為217 nm的含5-Fu和Cur雙藥的SF NPs,且5-Fu和Cur的裝載率分別為45%和15%。與游離5-Fu和Cur相比,裝載在SF NPs中的雙藥的生物利用度明顯提高。另外,當(dāng)應(yīng)用雙重載藥制劑時(shí),可以增加活性氧水平,進(jìn)而在體外誘導(dǎo)4T 1(乳腺癌細(xì)胞)凋亡。動(dòng)物研究表明,注射該SF NPs制劑后,腫瘤可明顯減少。

3.4 化學(xué)可修飾性

SF NPs表面可修飾性是提高其靶向性的關(guān)鍵,經(jīng)改性后的SF NPs具有很多優(yōu)勢(shì),包括提高SF NPs的穩(wěn)定性,延長抗癌藥物的半衰期,提高抗癌藥物的生物利用度等。Wongpinyochit等[60]將PEG共價(jià)接枝到SF NPs表面上,提高SF NPs分散性和穩(wěn)定性的同時(shí),表現(xiàn)出高效的藥物負(fù)載能力(心得安封裝效率達(dá)到了93%)和持久的釋放能力(長達(dá)14 d),且對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制效果顯著(更有利于細(xì)胞攝取且積聚到溶酶體中)。進(jìn)一步地,Hudit?等[61]將5-Fu負(fù)載在PEG修飾的SF NPs中,經(jīng)靜脈注射研究發(fā)現(xiàn),該遞送載體在降低5-Fu對(duì)正常血紅細(xì)胞毒性的同時(shí)可提高對(duì)HT-29腫瘤細(xì)胞的殺傷能力,能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲潛力的影響。Yang等[62]制備了粒徑為140nm,且負(fù)載吲哚菁綠(Indocyanine green,ICG)和阿霉素的SF NPs,ICG是一種臨床認(rèn)可的光敏劑。它是熱療治療中的一種光熱輔助劑,可使體內(nèi)癌細(xì)胞的熒光可視化。此外,顆粒表面被MnO2礦化(SF@MnO2/ICG/Dox)。在近紅外(NIR)照射下,與未使用NIR的阿霉素釋放相比,表現(xiàn)出強(qiáng)烈而可控的光熱反應(yīng)和快速藥物釋放。隨后利用SF@MnO2/ICG/Dox對(duì)4T1乳腺腫瘤小鼠進(jìn)行照射后,與未照射的SF@MnO2/ICG/Dox顆?；蚣す庵委煹挠坞xDox或ICG相比,小鼠腫瘤大小明顯減小,且生存期提高,表現(xiàn)出良好的抗腫瘤療效。

4 在抗癌藥物遞送中的研究進(jìn)展

4.1 被動(dòng)靶向遞送

被動(dòng)靶向是指納米顆粒可根據(jù)實(shí)體瘤組織與正常組織的微血管結(jié)構(gòu)不同(腫瘤組織主要表現(xiàn)為血管充血、血管結(jié)構(gòu)異常、淋巴管引流不足),引起自發(fā)滯留,或作為異物被免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞吞噬等途徑進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中的一種不自主行為。受到該作用機(jī)制啟發(fā),充分利用腫瘤微環(huán)境促使SF NPs透過內(nèi)皮富集作用,滲透至腫瘤組織內(nèi)部,為抗癌藥物長時(shí)間釋放爭(zhēng)取更多時(shí)間,提高抗癌療效。Gupta等[63]通過毛細(xì)管微點(diǎn)法分別制備了粒徑小于100 nm的負(fù)載姜黃素(Curcumin,Cur)的SF和SF殼聚糖共混物的納米顆粒(SF-Cur NPs和SF/CS-Cur NPs)。相比于SF/CS-Cur NPs,SF-Cur NPs的裝載效率(>90%)和釋放量均最高(0.32～0.68 μg),且使MCF-7和MDA-MB-453的細(xì)胞活力明顯降低。該研究結(jié)果表明,SF-Cur NPs對(duì)乳腺癌細(xì)胞顯示出更高的療效并可作為體內(nèi)乳腺腫瘤長效治療的遞送載體。Montalbán等[64]采用物理吸附法和共沉淀法分別制備了平均粒徑為166 nm和171 nm的SF-Cur NPs。對(duì)Hep3B(人肝癌細(xì)胞)和Kelly均具有細(xì)胞毒性,同時(shí)不會(huì)降低hBMSCs(人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的活力。另外,SF-Cur NPs在對(duì)Kelly的細(xì)胞毒性方面表現(xiàn)出比Hep3B更高的療效。Xie等[65]利用超臨界CO2溶液增強(qiáng)分散(SEDS)制備了粒徑可控的SF-Cur NPs(<100 nm)。與游離的5-Fu相比,質(zhì)量濃度高于10 μg/mL的SF-Cur NPs對(duì) HCT-116(結(jié)腸癌細(xì)胞)顯示出更強(qiáng)的抗癌作用(>94%),抗癌機(jī)制可能與誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞相關(guān)的G0/G1和G1/M期的細(xì)胞周期停滯有關(guān)。另外,在相同質(zhì)量濃度下,與5-Fu相比,SF-Cur NPs對(duì)NCM-460(正常結(jié)腸細(xì)胞)的毒副作用降低。上述研究均證實(shí)了SF NPs在抗癌藥物的遞送過程中具有增強(qiáng)其被動(dòng)靶向的能力。進(jìn)一步地,為了延長SF NPs在血液中的循環(huán)時(shí)間,避免SF NPs與血漿蛋白發(fā)生非特異性吸附,Wongpinyochit等[60]通過丙酮析出法制備了SF NPs,并利用聚乙二醇(PEG)對(duì)其表面進(jìn)行修飾,盡可能使更多納米顆粒經(jīng)被動(dòng)靶向進(jìn)入腫瘤組織。研究結(jié)果證實(shí),相比于SF NPs,經(jīng)PEG修飾的SF NPs的電位發(fā)生明顯升高(從-56 mV增加到-47 mV),一方面提高了其在水中的分散性和穩(wěn)定性(28 d),另外一方面在酸性條件下(pH 4.5),提高了Dox的釋放量(14 d內(nèi)提高2倍)。經(jīng)PEG修飾的SF NPs能被MCF-7高效吞噬,表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗癌活性。因此對(duì)納米顆粒表面改性增強(qiáng)其被動(dòng)靶向能力,延長其血液循環(huán)時(shí)間并持續(xù)發(fā)揮抗癌藥物療效是開發(fā)納米藥物載體的有效策略。另外,將對(duì)光、熱、磁場(chǎng)、電場(chǎng)、超聲波等具有刺激響應(yīng)的物質(zhì)裝載在SF NPs中,提高其被動(dòng)靶向的能力和含量,從而實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的精準(zhǔn)遞送和高效治療,是目前納米腫瘤新制劑的研究熱點(diǎn)[66]。如將磁性的氧化鐵或四氧化三鐵和抗癌藥物裝載在SF NPs形成穩(wěn)定的藥物劑型,靜脈注射后在外磁場(chǎng)的作用下使納米顆粒順利通過血液循環(huán)到達(dá)并富集在腫瘤組織部位,然后改變藥物的釋放外環(huán)境,包括調(diào)控酶的活性,改變pH、滲透壓及溫度等生理?xiàng)l件,使抗癌藥物在腫瘤組織中緩慢釋放[67]。Song等[68]利用鹽析法制備了具有磁性的SF-Cur NPs,對(duì)MDA-MB-231進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),具有磁性的小粒徑的SF-Cur NPs(90 nm)中Cur的細(xì)胞攝取明顯高于大粒徑的SF-Cur NPs(350 nm)和游離姜黃素(高達(dá)80%),且明顯降低了MDA-MB-231的活性。因此,具有磁性的SF-Cur NPs提供了外部進(jìn)行癌癥靶向的可能性。

4.2 主動(dòng)靶向遞送

被動(dòng)靶向遞送最大的挑戰(zhàn)是SF NPs無法實(shí)現(xiàn)在癌變組織中的高濃度富集,且無法到達(dá)組織深處,藥物療效難以充分發(fā)揮。近十年中的被動(dòng)靶向遞送研究數(shù)據(jù)表明,僅有0.7%的納米抗癌藥物制劑有效也充分佐證了這點(diǎn)[69]。將特異性配體或抗體通過化學(xué)修飾到SF NPs的表面使之對(duì)腫瘤組織具有更好的主動(dòng)靶向性是SF納米抗癌制劑當(dāng)前研究的重點(diǎn)方向。目前在SF NPs中應(yīng)用較多的靶向分子配體包括葉酸,RGD多肽,乳鐵蛋白、透明質(zhì)酸等。為了對(duì)癌細(xì)胞提供特異性識(shí)別,可提高SF NPs的主動(dòng)靶向性。Subia等[70]通過丙酮析出法先制備了SF NPs,再將葉酸(Folic acid,FA)通過共價(jià)接枝到SF NPs表面,然后將Dox物理吸附得到粒徑小于200 nm的FA-SF NPs-Dox,在酸性條件下持久釋放長達(dá)21 d。與非功能化的SF NPs-Dox相比,經(jīng)FA修飾的SF NPs-Dox的主動(dòng)靶向能力增強(qiáng),能被MDA-MB-231細(xì)胞高效內(nèi)化吸收,且釋放的Dox顯著降低了癌細(xì)胞活力。考慮到Dox的藥物劑量低,難以持續(xù)發(fā)揮抗癌療效,進(jìn)一步地,Sun等[71]首先通過鹽析法制備了負(fù)載Dox的SF NPs(SF NPs-Dox),再將FA通過共價(jià)接枝到(FA-SF NPs-Dox)的表面,作為腫瘤細(xì)胞葉酸受體的靶標(biāo)。此外,相比于FA-SF NPs-Dox((19.63±0.27) μg/mg),二次物理裝載Dox的納米顆粒(FA-SF NPs-Dox-Dox)的載藥能力提升到(30.71±0.41) μg/mg,且依然具有球形多孔結(jié)構(gòu)(粒徑約為530 nm,孔徑為17.84 nm)。體外釋放結(jié)果表明,低pH值、高離子強(qiáng)度及高酶濃度均可加快Dox從FA-SF NPs-Dox-Dox中釋放(30 h)。此外,與SF NPs-Dox-Dox相比,FA-SF NPs-Dox-Dox可加快被HeLa內(nèi)化,且對(duì)HeLa具有更高的細(xì)胞毒性。iRGD是一種環(huán)狀的腫瘤歸巢肽,可增加腫瘤組織微環(huán)境中的血管和組織通透性。Bian等[72]通過反溶劑法誘導(dǎo)SF自組裝制得負(fù)載Ptx的納米顆粒(Ptx-SF-NPs),隨后用碳二亞胺將納米顆粒與抗表皮生長因子(Epidermal growth factor receptor,EGFR)-iRGD納米體進(jìn)行耦聯(lián)結(jié)合(A-Ptx-SF-NPs)。經(jīng)功能化的A-Ptx-SF-NPs平均尺寸約為186 nm。藥物包封率和載藥率分別為52%和10%。動(dòng)物體內(nèi)影像學(xué)結(jié)果表明,與非耦聯(lián)的Ptx-SF-NPs相比,A-Ptx-SF-NPs能顯著抑制HeLa癌細(xì)胞中EGFR的高表達(dá)。Roy等[73]通過斬切、碾磨和噴霧干燥等步驟制得載乳鐵蛋白的SF NPs。與純SF NPs相比,載乳鐵蛋白的SF NPs在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化率顯著升高。Gou等[74]將具有線粒體靶向功能的IGC類似物(NIR770)和阿霉素通過鹽析法裝載在SF NPs中,并利用透明質(zhì)酸(HA)對(duì)其表面進(jìn)行功能化修飾。通過細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與表面未經(jīng)HA修飾的SF NPs-Dox相比,腫瘤細(xì)胞對(duì)HA表面修飾Dox納米顆粒(HDNPs)具有更高的吞噬效率。而當(dāng)在培養(yǎng)基中加入游離HA分子后,細(xì)胞對(duì)HDNPs的吞噬效率顯著下降。綜合表明,SF NPs表面具有豐富的反應(yīng)位點(diǎn),可為靶向分子共價(jià)耦聯(lián)或化學(xué)修飾創(chuàng)造有利條件,便于納米抗癌制劑的主動(dòng)靶向遞送和高效治療。

5 結(jié) 論

絲蛋白具有生物相容性優(yōu)異、生物安全性高、免疫原性低、可塑性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),是制備納米藥物遞送載體的理想材料來源。腫瘤組織比較復(fù)雜,僅將SF NPs作為抗癌藥物的被動(dòng)靶向遞送載體,療效甚微。而SF NPs的制備方法簡(jiǎn)單,其尺寸、電荷、β-折疊含量、分散性、穩(wěn)定性可控,尤其是其表面具有豐富的活性位點(diǎn),可為特異性配體或抗體、抗癌藥物等通過共價(jià)耦聯(lián)或化學(xué)修飾創(chuàng)造有利條件,使之對(duì)腫瘤組織具有更好的主動(dòng)靶向性和抗癌療效。因此,經(jīng)功能化修飾的SF NPs在延長血液循環(huán)耐受性、腫瘤細(xì)胞吞噬、向腫瘤組織深層次穿透及對(duì)抗癌藥物的精準(zhǔn)遞送和提高療效等方面,都展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

盡管SF NPs具有諸多優(yōu)勢(shì),但其在納米抗癌藥物遞送體系的靶向治療研究處于起步階段,仍面臨著制備方法受到外源因素制約,且100 nm以下尺寸較難控制,結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定,難以在靶向組織中富集,藥物有效治療濃度持續(xù)時(shí)間短,療效差等問題。因此科研工作者需在開發(fā)功能化、智能化SF NPs的制備技術(shù)、提升其理化性能(粒徑可控、穩(wěn)定性優(yōu)異、載藥量高效、靶向性準(zhǔn)確)及抗癌療效(精準(zhǔn)、長效、可控)等方面進(jìn)行大量探索與研究。

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