蒲科源，丘嘉敏，劉柏霖，童永祺，程子彬，劉誠，林艷，吳坤明*

1(汕頭大學(xué) 化學(xué)系 廣東省有序結(jié)構(gòu)材料的制備與應(yīng)用重點實驗室，廣東 汕頭，515063) 2(汕頭大學(xué) 生物系，廣東 汕頭，515063)3(汕頭大學(xué) 計算機(jī)科學(xué)與技術(shù)系，廣東 汕頭，515063) 4(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東 汕頭，515041)

肉類和肉制品摻假問題已成為世界各地的共同問題，2014年歐洲報道的“馬肉丑聞”更是揭露了多國肉制品的摻假現(xiàn)象[1]。牛肉造假的主要原因是部分商家為節(jié)省成本，通過添加牛肉香精、染料等化學(xué)物質(zhì)，將價格較低的豬雞鴨等肉全部或部分代替價格較高的牛肉。牛肉造假主要分為生牛肉造假、牛肉生制品造假(如肥牛卷、調(diào)制牛排等)以及牛肉熟制品造假(如牛肉干、牛肉丸等)。由于摻假過程不標(biāo)明摻假成分，從而導(dǎo)致消費(fèi)者面臨接觸病原體和過敏原等健康風(fēng)險[2-3]。因此，發(fā)展牛肉制品的摻假測定及真?zhèn)舞b別等安全檢測手段對于規(guī)范肉類市場秩序及震懾不法分子具有重要的意義，更是對習(xí)總書記要求保護(hù)民眾“舌尖上的安全”的踐行。

常見的肉類鑒別技術(shù)主要有免疫學(xué)檢測方法[4]、光譜技術(shù)[5]及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)[6]。其中，免疫學(xué)檢測基于抗原抗體特異結(jié)合的原理，具有靈敏性高的特點，但測試過程耗時長、操作繁瑣，難以實現(xiàn)待檢測物質(zhì)的高通量鑒別[7]；光譜技術(shù)檢測基于被檢測原子或分子在激發(fā)狀態(tài)下發(fā)射特征光譜的原理，雖然能夠快速、無損地進(jìn)行肉制品摻假鑒別，但是由于光譜數(shù)據(jù)容易受到外加添加劑的干擾，存在不法分子借此逃過檢查的可能，且模型的穩(wěn)定性易受光譜采集參數(shù)和環(huán)境因素影響[5]，因此重現(xiàn)性差；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)依靠核酸來鑒別肉及肉制品是否摻假，具有穩(wěn)定性高、靈敏度高的特點，檢測更準(zhǔn)確[8]，但是反應(yīng)耗時較長、步驟復(fù)雜、成本較高，易出現(xiàn)假陽性的風(fēng)險[9]。最重要的是，經(jīng)過熟加工，由于蛋白質(zhì)、脂肪、核酸受熱變性，食品添加劑(如調(diào)味料、防腐劑、色素)的加入，上述方法對熟肉制品進(jìn)行檢測的成本與難度隨之增大。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI TOF-MS)是一種生物質(zhì)譜技術(shù)，具有高靈敏度、高通量、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點[10-12]，利用軟電離，能在保持大分子完整性的前提下得到質(zhì)譜圖。由于其能快速、無損地獲得分析物質(zhì)譜圖，因此常被用于非靶向性分析，通過綜合多個特征峰完成鑒別，具有高穩(wěn)定性、高抗污染性的優(yōu)點，且相較于其他手段，質(zhì)譜能直接獲得樣品信息，使得造假行為難以遁形。目前，該項技術(shù)已在癌癥[13]、心血管疾病[14]等臨床領(lǐng)域研究和食品微生物檢測[15]中取得顯著進(jìn)展。近年來在肉類的鑒別中也有了初步探索，如對豬、牛、馬、雞的鮮肉和烹制后肉制品，以及魚類肉制品進(jìn)行MALDI TOF-MS表征后，利用聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)進(jìn)行了鑒別[16-17]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用肉類樣品(牛、豬、雞和鴨)，汕頭鮀浦當(dāng)?shù)厥袌?；硫脲、尿素、三羥基氨基甲烷(Tris)、乙腈，均為色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氟乙酸(質(zhì)譜級)，芥子酸(98%)、MD25-1000型透析袋，Sigma-Aldrich；有機(jī)相濾頭(PVDF, 0.45 μm)，津隆;一次性針器注射器，江蘇治宇醫(yī)療器械。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-SFJ-10手持勻質(zhì)勻漿機(jī)，上海力辰科技有限公司；autoflex speed飛行時間質(zhì)譜儀，布魯克(北京)科技有限公司；TGL-16Gr臺式冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3E酸度計，上海儀電科學(xué)儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品信息

肉類樣品從當(dāng)?shù)厥袌鲑彽煤罅⒓捶湃氡?，轉(zhuǎn)入4 ℃下冷藏保鮮。測試前，隨機(jī)切取10.0 g肌肉部位組織，避免切入筋膜及脂肪。樣品切碎混勻后，稱取0.50 g肉樣，共收集到如表1所示136個樣本。

1.3.2 肉類樣品蛋白質(zhì)提取與純化

0.50 g肉類樣品放入玻璃勻漿器，加入10 mL蛋白質(zhì)提取液(6 mol/L尿素， 1 mol/L硫脲, 50 mmol/L Tris，pH=8.2)[19]，8 000 r/min勻漿2 min至無明顯組織，4 ℃、12 000×g離心1 min，取上清液于0.45 μm 濾頭過濾，將濾液裝入透析袋，用100倍體積蒸餾水透析2 h。

表1 本實驗所用的肉類樣品信息(共136個鮮肉樣品)Table 1 Different tissue from 4 meat species adopted in the study (136 fresh meat samples)

1.3.3 MALDI-TOF MS表征

按照V(乙腈)∶V(0.1%三氟乙酸)=3∶7的比例配制TA30溶液，將透析除鹽后的蛋白質(zhì)溶液與TA30飽和芥子酸溶液等比例混合，取2.5 μL點在靶板上，每個樣品重復(fù)點3次，干燥后用MALDI-TOF MS采集數(shù)據(jù)。平行實驗2次。MALDI-TOF MS具體參數(shù)如下：激光頻率為500 Hz，能量為99.6%，在正離子線性模式下掃描范圍為4 000～22 000 Da。

周愷的嘴唇抖動著，想說什么，卻最終沒有說出口。孟麗拿起水杯，說：“什么都不用說了，回來就好，先喝了這杯水，我去給你弄吃的?！敝軔鸷鴾I，接過來一飲而盡……

1.3.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

利用R語言MALDIquant[18]包完成質(zhì)譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理，包括平滑、基線矯正、峰對齊、峰提取等，最終將質(zhì)譜圖譜轉(zhuǎn)化為二維數(shù)據(jù)矩陣，之后利用基于Microsoft Excel 的歸一化方法(MS total useful signal, MSTUS)[20]對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行歸一化處理。

1.3.5 隨機(jī)森林算法分析

隨機(jī)森林算法是以決策樹為基礎(chǔ)構(gòu)建的，與決策樹類似，隨機(jī)森林算法是通過多個“節(jié)點”，實現(xiàn)多次二分類，直至不能再分裂，而隨機(jī)森林通過數(shù)據(jù)和特征的隨機(jī)抽取構(gòu)建多個彼此間不相關(guān)的決策樹，共同完成分類預(yù)測，其隨機(jī)性使得模型的泛化能力和抗過擬合性均得到了很大提升[21]。

利用R語言中的Random forest包[22]對所得的272個數(shù)據(jù)進(jìn)行分類建模，訓(xùn)練集占比為80%(217)，測試集占比為20%(55)，篩選生或熟狀態(tài)下均能代表牛肉、雞肉、鴨肉或豬肉的重要變量。通過在質(zhì)譜圖中確認(rèn)重要變量對應(yīng)離子峰存在(信噪比>3)，則確認(rèn)其為特征蛋白質(zhì)，并在Uniprot(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)中比對檢索特征蛋白質(zhì)。隨后將特征蛋白質(zhì)作為新的變量進(jìn)行隨機(jī)森林分類模型的構(gòu)建，以判斷所篩選特征蛋白質(zhì)的有效性。R語言版本為4.1.2，Random forest包的版本為4.6～14。通過一系列建模實驗確定模型的參數(shù)ntree=50，mtry=24。

1.3.6 PCA和HCA

PCA將多元變量投影分布到幾個不相關(guān)的主成分上，以達(dá)到數(shù)據(jù)降維的目的，實現(xiàn)同類數(shù)據(jù)的聚集和不同類數(shù)據(jù)的分離，同時實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。將隨機(jī)森林算法篩選的特征蛋白質(zhì)作為PCA的新變量，構(gòu)建4種肉的分類模型，隨后通過HCA以驗證分類模型，最后通過鑒別包括生熟的雞肉、鴨肉和豬肉分別以25%、50%、75%質(zhì)量比與牛肉混合制備的摻假樣品，完成對模型鑒別能力的驗證。PCA和HCA利用SIMCA-P14.1 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種肉的MALDI -TOF MS圖譜

牛雞鴨豬4種肉蛋白質(zhì)的代表性MALDI-TOF MS圖譜如圖1所示，4個物種間質(zhì)譜圖離子峰存在較大差異，說明存在可以區(qū)分4種肉的特征蛋白質(zhì)；而相同物種的肉在經(jīng)過烹煮后，離子峰總數(shù)目均增大，同時也伴隨一些離子峰的消失，說明在烹煮過程中，部分熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)發(fā)生水解。烹煮前后存在許多重合的離子峰，說明存在一些不易水解、性質(zhì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，具有作為能區(qū)分生熟狀態(tài)下4種肉類特征蛋白質(zhì)的潛力。

a-牛肉；b-雞肉；c-鴨肉；d-豬肉圖1 4種肉(生熟)的MALDI-TOF MS圖譜Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of 4 species meats (including fresh and cooked)注：重合數(shù)代表同種肉生肉和熟肉間重合峰的數(shù)目

2.2 重要變量的篩選

在R語言中利用Random forest包在ntree=50、mtry=24進(jìn)行分類模型的構(gòu)建。通過這種方法建立的模型分類正確率為100%，袋外誤差為0；在訓(xùn)練集內(nèi)部與測試集的準(zhǔn)確率均為100%, 受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve， ROC)下與坐標(biāo)軸圍成的面積(area under curve， AUC)值均為1，表示訓(xùn)練集內(nèi)部數(shù)據(jù)與測試集數(shù)據(jù)均能被正確分類。證實隨機(jī)森林模型具有很好的分類能力，篩選出的重要變量可信度較高。

調(diào)用該模型的變量重要性輸出，選取變量重要性較大的前11個變量(圖2)作為重要變量。最終選取的變量為4 850.9、5 342.1、6 191.3、8 414.6、8 475.4、8 579.3、9 445.1、10 164.5、16 568.8、17 109.9及18 922.9。通過判斷其在MALDI-TOF MS譜圖中對應(yīng)的離子峰的存在，確認(rèn)這11個重要變量均為特征蛋白質(zhì)。隨后，通過在Uniprot中比對檢索，如表2所示，共找到7個特征蛋白質(zhì)。

圖2 隨機(jī)森林算法的前11個重要變量Fig.2 The 11 important variables of random forest

將上述11個特征蛋白質(zhì)作為新的變量進(jìn)行隨機(jī)森林分類模型的構(gòu)建。超參數(shù)設(shè)定為ntree=50、mtry=3, 訓(xùn)練集占比為80%(217)，測試集占比為20%(55)。在新的模型中，用于構(gòu)建模型的訓(xùn)練集被100%正確分類，袋外誤差率為0，同時在訓(xùn)練集內(nèi)部預(yù)測正確率為100%、AUC值為1、95%置信區(qū)間為(0.988 1，1)，且對于4種肉的特異度、敏感度均達(dá)到了1；在測試集預(yù)測中，分類的正確率為100%、AUC值為1、95%置信區(qū)間為(0.952 6，1)，特異度和敏感度均為1。所得到的模型仍然具有較好的分類能力。由此，可以驗證選取的特征蛋白質(zhì)具有很好的區(qū)分4種肉類的能力。

2.3 摻假判別模型的構(gòu)建

2.3.1 PCA與HCA

4種肉質(zhì)譜數(shù)據(jù)所有變量的PCA得分如圖3-a所示，前2個主成分的積累貢獻(xiàn)為R2=23.0%，說明模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較差。各種肉間均有一定的聚類趨勢，而牛肉和豬肉之間、鴨肉和雞肉之間比較接近，反映了物種間親緣關(guān)系的接近程度。將隨機(jī)森林算法篩選得到的11個特征蛋白質(zhì)作為變量進(jìn)行PCA，其得分如圖3-b所示，前2個主成分積累貢獻(xiàn)率為R2=69.0%，模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較好，特征蛋白質(zhì)的選擇使得主成分對變量變異性的解釋能力得到了很大的提高。各物種肉均有明顯的聚類趨勢，能在2個主成分下得到分離。

a-生熟4種肉;b-11個特征蛋白質(zhì)作為變量下的生熟4種肉圖3 四種肉類樣品的PCA得分圖Fig.3 PCA scoring plot of four species meats

通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA，結(jié)果顯示不同物種的肉被正確地分為4類(圖4)，驗證了PCA的可信性。

圖4 十一個特征蛋白質(zhì)作為變量下的生熟4種肉的HCAFig.4 HCA using the 11 characteristic proteins of the four species meats (including fresh and cooked)

2.3.2 牛肉摻假樣品驗證

包括生熟的雞肉、鴨肉和豬肉分別以25%、50%、75%質(zhì)量比與牛肉混合制備的摻假樣品被用于鑒別模型的驗證。其結(jié)果如圖5所示，摻假樣品均能與純?nèi)夥蛛x，且隨著3種摻假肉加入牛肉的比例增大，摻假牛肉樣品逐漸從純牛肉向?qū)?yīng)摻假純?nèi)獾姆较蛞苿?。該結(jié)果表明模型能較好地完成對生熟牛肉摻假樣品的定性檢驗。

圖5 生熟純?nèi)夂碗u肉、鴨肉和豬肉與牛肉混合制備的摻假樣品PCA得分圖Fig.5 PCA scoring plot of pure beef, chicken, duck and pork meats, and adulterated beef samples

3 結(jié)論

通過對牛、雞、鴨和豬的不同食用部位的肉樣，分別在生熟狀態(tài)下進(jìn)行簡單、快速的蛋白質(zhì)提取，并通過 MALDI-TOF MS進(jìn)行表征，得到了4種肉的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。經(jīng)預(yù)處理后得到的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行隨機(jī)森林算法分析，共找到11個能代表生熟4種肉的特征蛋白質(zhì)，其中7個在Uniprot中得到表征，將這些特征蛋白質(zhì)作為PCA的變量以構(gòu)建牛肉摻假鑒別模型。最后通過HCA和牛肉摻假樣品的鑒別驗證了該模型，說明通過本方法，可以完成摻假牛肉的初步篩查。依托于MALDI-TOF MS的高通量、簡便等優(yōu)勢，可在3 h內(nèi)完成對384個樣品的檢測，證明該方法可應(yīng)用于市場及海關(guān)等檢測現(xiàn)場，維護(hù)肉制品市場的安全與秩序。