孟梓怡，羅子陽，段翰英，王超

(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

楊梅是一種亞熱帶水果，在華東和湖南、廣東、廣西、貴州等地區(qū)均有分布，全國楊梅栽培面積達(dá)30多萬hm2，年產(chǎn)量100多萬t，約占全球的90%以上[1]。楊梅富含花色苷、黃酮、酚酸、維生素和礦物質(zhì)等物質(zhì)，但貨架期極短[2]，因此楊梅深加工對減少浪費、延長保質(zhì)期、提高其附加值有重大意義。

楊梅果汁含有豐富的花色苷(例如，荸薺種的楊梅花色苷含量為64.8 mg/100 g)[3]，矢車菊素-3-葡萄糖苷占楊梅花色苷總量的95%以上[4]，因其具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病和心血管疾病等功效受到廣泛關(guān)注[5-8]。花青素在酸性pH值下穩(wěn)定，而在中性pH值下穩(wěn)定性下降，發(fā)生水合、環(huán)裂變和電離形成查爾酮[9]。因此，提高花色苷穩(wěn)定性是保證其發(fā)揮生理活性的關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)的楊梅加工方法主要包括將楊梅加工成果汁、果酒、罐頭、果脯、涼果等，雖然能延長保存期，但其活性成分損失較多。新興的微膠囊技術(shù)采用特定工藝手段，如噴霧干燥，利用壁材對生物活性物質(zhì)進行包埋，可有效提高其穩(wěn)定性[10]。利用微膠囊技術(shù)制備固體飲料，產(chǎn)品顆粒均勻一致，具有獨特濃郁的香味，在冷熱水中均能迅速溶解，色澤與新鮮果汁相似，能減少活性物質(zhì)的損失，產(chǎn)品能長期保存，便于攜帶和食用。

蛋白質(zhì)已被廣泛用作敏感生物活性成分的壁材，以提高花青素等活性成分的穩(wěn)定性，保護花色苷在消化過程中不被降解，以及提高花色苷的抗氧化性[11-17]。豌豆蛋白含有成人所必需的8種氨基酸，氨基酸種類齊全、比例平衡，賴氨酸含量豐富，能滿足聯(lián)合國糧農(nóng)組織或世界衛(wèi)生組織的建議，具有降膽固醇、降血壓功能，相對于常用的乳清蛋白，不含致敏原，安全性更高，營養(yǎng)價值高，吸收率能達(dá)到98%以上[18-25]。目前，豌豆蛋白已經(jīng)成功用于抗壞血酸、α-維生素E和甘油三酯的包埋[26]，但未見應(yīng)用在果汁加工方面，因此具有很大的研究價值。

本研究利用微膠囊技術(shù)，以豌豆蛋白為壁材，通過高壓均質(zhì)和噴霧干燥技術(shù)將楊梅果汁包埋并加工成楊梅果汁蛋白粉固體飲料產(chǎn)品(以下簡稱楊梅-蛋白粉)，通過掃描電鏡、傅里葉紅外分析(Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)TIR)、熱重分析(thermogravimetric analysis，TG)、粒度測定和電位分析對楊梅-蛋白粉的包埋特性、穩(wěn)定性進行表征。同時利用體外模擬消化對楊梅-蛋白粉中花色苷的生物利用率進行分析，以期為開發(fā)楊梅產(chǎn)品提供新思路，同時帶動豌豆和楊梅資源的合理利用和附加值提升。

1 材料與設(shè)備

1.1 實驗材料

新鮮楊梅，中國仙居；豌豆蛋白，嘉吉食品(天津)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

CQC2-600型全液相HPP食品滅菌機，北京速原中天公司；e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Is50 FT-IR傅里葉紅外分析儀、ZetaFinder ZF400電位分析儀，美國Thermo Fisher公司；TGA 2 (SF)熱重分析儀、LE104E/02電子天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；EVO-MA15掃描電子顯微鏡，德國ZEISS公司；SPXAPV2000高壓均質(zhì)機，丹麥APV公司；Mini Spray Dryer B-200噴霧干燥機，瑞士BUCHI公司；手持糖度計，日本ATAGO公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HR2874榨汁機，荷蘭飛利浦公司；Centrifuge5810R離心機，德國Eppendorf公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 新鮮楊梅果汁的制備

冰水浴中將楊梅去核，用榨汁機擠壓得到粗果汁；用冷凍高速離心機8 000 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液，抽濾得到澄清果汁。用蔗糖調(diào)節(jié)果汁可溶性固形物至15 °Brix，用聚乙烯袋無菌包裝。

2.1.2 楊梅-蛋白粉的制備

分別取300 g新鮮楊梅果汁，40 g豌豆蛋白溶于蒸餾水中，均勻混合并定容至1 L，得到含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%楊梅果汁、4%豌豆蛋白的溶液，將溶液通過壓力為450 bar的高壓均質(zhì)機3次后按照設(shè)定的操作條件進行噴霧干燥，得到楊梅-蛋白粉，操作條件為：進風(fēng)溫度170 ℃，出風(fēng)溫度70 ℃，風(fēng)機速度 50.0 Hz，蠕動泵轉(zhuǎn)速為1 000 mL。

2.1.3 楊梅果肉粉的制備

將脫核后的楊梅果肉在-80 ℃下冷凍后，通過真空冷凍干燥機干燥48 h，收集果肉粉末，置于-20 ℃保存。

2.1.4 楊梅果汁粉

將2.1.1中制得的新鮮楊梅果汁在-80 ℃下冷凍后，通過真空冷凍干燥機干燥48 h，收集果汁粉末，置于-20 ℃保存。

2.2 楊梅-蛋白粉物理性質(zhì)的測定

2.2.1 平均粒徑(mean diameter of dominant, MDD)和粒徑分布

楊梅-蛋白粉及豌豆蛋白粉的MDD由重組飲料的MDD表征。重組飲料參照文獻[27]配制：準(zhǔn)確稱取1.000 g粉末溶解于9 g水中，攪拌至完全溶解。測定方法：采用動態(tài)激光散射技術(shù)，將制備的飲料用蒸餾水稀釋(1∶50,V∶V)以避免多次散射效應(yīng)，設(shè)定儀器測定方法和程序后直接放入樣品池測定，重復(fù)3次測定取平均值。

2.2.2 微觀形態(tài)

楊梅-蛋白粉及豌豆蛋白粉的表面顆粒形態(tài)由掃描電鏡進行評價。分別稱取約2 mg的樣品固定于貼有雙面膠的銅臺上，噴金后等待測定。選擇不同的放大倍數(shù)對粉末粒子進行掃描，在15 kV加速電壓下進行分析[28]。

2.2.3 傅里葉紅外光譜分析

樣品預(yù)處理：取 1～2 mg 的樣品在瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉末與干燥的KBr(分析純)粉末(約100 mg，粒度200目)混合均勻，裝入模具內(nèi)，在壓片機上壓制成片測試。設(shè)定掃描波數(shù)為1 500～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描32次。傅里葉紅外光譜圖采用OMNIC 9.2軟件處理，通過軟件自動修飾校正，使用 PeakFit v4.12軟件對紅外圖譜進行基線校正、高斯去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合。計算相應(yīng)波長處對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)百分比。

2.2.4 熱重分析

以25 ℃/min速率升溫，在50～700 ℃進行加熱，得到溫度與質(zhì)量關(guān)系TG曲線。

2.3 體外模擬消化

根據(jù)表1所示成分配制體外模擬消化液，對2.1中制得的楊梅-蛋白粉、楊梅果汁粉、楊梅果肉粉進行體外模擬消化實驗，消化流程如圖1所示[29]，生物利用率計算如公式(1)所示：

(1)

表1 消化液的組成成分(1 L)Table 1 Composition of digestive juice (per L)

圖1 消化步驟流程圖Fig.1 Flow chart of digestion steps

2.3.1 口腔模擬消化

分別取0.6 g楊梅-蛋白粉、楊梅果汁粉、楊梅果肉粉加入9 mL模擬唾液，充N2覆蓋頂空，蓋緊并用膜密封旋渦混勻3 min，水平放置在37 ℃、轉(zhuǎn)速60 r/min振蕩水浴5 min，立即取出冷卻，5 000 r/min離心35 min，收集上清液，通過0.45 nm聚四氟乙烯注射器過濾器進入液相小瓶，HPLC測定花色苷含量。消化后的殘渣冷凍干燥，噴金，用掃描電鏡觀察。

2.3.2 胃部模擬消化

在口腔消化殘渣中加入13.5 mL胃液，充N2覆蓋頂空，蓋緊并用膜密封，旋渦混勻3 min，水平放置在37 ℃、轉(zhuǎn)速60 r/min振蕩水浴2 h(每30 min取1次樣，結(jié)束前約15 min制備小腸液)，立即取出冷卻，5 000 r/min離心35 min，收集上清液，通過0.45 nm聚四氟乙烯注射器過濾器進入液相小瓶，測定花色苷含量。消化后的殘渣冷凍干燥，噴金，用掃描電鏡觀察。

2.3.3 腸道模擬消化

在胃部消化殘渣中加入27 mL十二指腸液和9 mL膽汁，充N2覆蓋頂空，蓋緊并用膜密封，旋渦混勻3 min，水平放置在37 ℃、轉(zhuǎn)速60 r/min振蕩水浴2 h，立即取出冷卻，5 000 r/min離心35 min，收集上清液，通過0.45 nm聚四氟乙烯注射器過濾器進入液相小瓶，測定花色苷含量。

2.4 花色苷含量測定

采用HPLC測定楊梅果汁花色苷含量變化，參照段翰英等[30]的花色苷檢測方法并稍作改進。

色譜條件：色譜柱為Waters Symmetry C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：含體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-水溶液，流動相B：含體積分?jǐn)?shù)5%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫條件：0 min(0% B)→30 min(40% B)→32 min(100% B)→38 min(0% B)；流速1 mL/min；進樣量25 μL；自動進樣器溫度4 ℃；柱溫40 ℃；掃描波長200～700 nm；檢測波長520 nm。

2.5 數(shù)據(jù)分析處理

所有實驗均進行3次平行，結(jié)果用平均數(shù)±方差表示。采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并用IBM SPSS Statistics 26軟件進行方差分析(analysis of variance，ANOVA)(P<0.05)，用Origin 2021進行柱形圖的繪制。

3 結(jié)果與討論

3.1 楊梅-蛋白粉的物理特性表征

3.1.1 楊梅-蛋白粉微觀形貌分析

豌豆蛋白粉和楊梅-蛋白粉的形貌主要以近似球狀顆粒為主(圖2)，但楊梅-蛋白粉顆粒表面光滑程度和均勻程度均優(yōu)于豌豆蛋白粉。噴霧干燥工藝對微膠囊粉末的成型性和表面形貌都有顯著影響[31-32]，豌豆蛋白粉表面出現(xiàn)裂紋和褶皺，可能是噴霧干燥過程中固體原料間相互碰撞引起的[33]。楊梅果汁蛋白飲料在噴霧前經(jīng)過高壓均質(zhì)處理，粒徑更小且均勻，減少了顆粒間碰撞等影響，從而形成更光滑表面。

3.1.2 楊梅-蛋白粉的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性與蛋白質(zhì)的功能特性密切相關(guān)，利用FTIR對豌豆蛋白粉和楊梅-蛋白粉結(jié)構(gòu)進行分析，如圖3所示，豌豆蛋白粉和楊梅-蛋白粉的光譜圖在主要特征區(qū)域1 500～4 000 cm-1吸收沒有明顯差別。3 600～3 300 cm-1處的峰強通?？梢员硎镜鞍追肿託滏I(內(nèi)部和外部)及O—H、N—H鍵的伸縮振動強度[34]，蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)中的信息對于研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)最有價值，與氫鍵作用力緊密相關(guān)。通過對FTIR去卷積、二階求導(dǎo)、曲線擬合[35]，獲得二級結(jié)構(gòu)圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)(表2)。結(jié)果表明，相比于豌豆蛋白粉，楊梅-蛋白粉的α-螺旋下降1.22%，α-螺旋是豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)中主要的有序結(jié)構(gòu)，通過分子內(nèi)氫鍵維持，約占總結(jié)構(gòu)的18%[36]，凝膠硬度與α-螺旋含量之間呈負(fù)相關(guān)[37]。β-折疊下降1.98%，β-轉(zhuǎn)角上升3.72%，無規(guī)則卷曲下降0.52%，其原因可能是噴霧干燥導(dǎo)致氫鍵斷裂，蛋白質(zhì)部分分子空間構(gòu)象改變，β-折疊或無規(guī)則卷曲的多肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了180°的反轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[38]。

圖3 楊梅-蛋白粉與豌豆蛋白粉傅里葉紅外分析圖Fig.3 FTIR of protein-bayberry powder and pea protein powder

表2 蛋白二級結(jié)構(gòu)相對百分比 單位：%

熱學(xué)性質(zhì)是物質(zhì)的一種重要物理性質(zhì)，通過測量物質(zhì)在程序升溫或冷卻過程中的物理、化學(xué)性質(zhì)的變化，可以對物質(zhì)的性質(zhì)有更深入的了解。本實驗利用TG測量豌豆蛋白包埋楊梅果汁前后的熱學(xué)性質(zhì)。由圖4可見，2種粉末均有2個質(zhì)量損失階段。第一個階段是在30～100 ℃。這是由物質(zhì)中的結(jié)合水蒸發(fā)所引起的，但楊梅-蛋白粉下降幅度稍緩慢一些，推測是因為噴霧干燥后粉末水分含量有所降低導(dǎo)致的[39]。第二個階段是質(zhì)量完全損失階段，可以看到在接近750 ℃時，2種粉末均完全分解?？傮w來看，噴霧干燥前后樣品熱穩(wěn)定性無明顯變化，表明了蛋白-楊梅復(fù)配并沒有改變豌豆蛋白原有的熱穩(wěn)定性。

圖4 楊梅-蛋白粉與豌豆蛋白粉的熱重圖Fig.4 TG figure of protein-bayberry powder and pea protein powder

3.1.3 楊梅-蛋白粉重組飲料的穩(wěn)定性分析

由圖5可見，豌豆蛋白重組飲料MDD為0.718 μm，楊梅蛋白重組飲料為0.476 μm，高壓均質(zhì)后，溶液粒徑分布范圍變窄，粒子分散更均勻，并且向小粒徑液滴偏移。這是因為高壓下，飲料中高速運動的物料自相碰撞，從而產(chǎn)生粒徑更小的溶液且分布更加集中和均勻，有效提升蛋白飲料口感[40]。Zeta電位方面來看，豌豆蛋白重組飲料Zeta電位為-18 mV，楊梅蛋白重組飲料為-45 mV，復(fù)配飲料電位絕對值更大，飲料具有更高的液體穩(wěn)定性，這與高壓均質(zhì)處理會使溶液成分分布更均勻相關(guān)。

a-豌豆蛋白重組飲料；b-楊梅蛋白重組飲料圖5 楊梅-蛋白粉與豌豆蛋白重組飲料的粒徑、Zeta電位分布圖Fig.5 Distribution diagram of particle size and Zeta potential of protein-bayberry powder and pea protein recombinant beverage

3.2 楊梅-蛋白粉花色苷生物利用率分析

本文通過體外模擬消化實驗來探究花色苷生物利用率。經(jīng)口腔消化后，楊梅-蛋白粉、楊梅果汁、果肉粉的生物利用率分別為4.86%、99.10%、8.60%，可見包埋后的楊梅-蛋白粉中的花色苷釋放非常少。3種樣品在進入胃液消化30 min后(圖6)，楊梅-蛋白粉和果肉中花色苷的生物利用率分別為74.98%和91.23%，均低于果汁含量99.31%，推測是因為楊梅-蛋白粉微膠囊壁材在短時間內(nèi)還未被完全消化，部分楊梅果汁還被包埋在球狀結(jié)構(gòu)中，而果肉組是因為部分花色苷還存在于果肉組織當(dāng)中，并未被完全釋放至胃液中。60～120 min，楊梅-蛋白粉與果肉花色苷逐漸釋放至胃液，并發(fā)生降解。由于果汁中花色苷不存在釋放過程，所以在90～120 min時出現(xiàn)了含量突然下降的情況。最終，在胃液中消化120 min后，3種樣品花色苷生物利用率基本一致(65%～75%)。在經(jīng)過腸液消化后，HPLC并未檢測到花色苷的存在，這可能是在胃液的強酸性環(huán)境中，花色苷能以2-苯基苯并陽離子形式穩(wěn)定存在，但當(dāng)?shù)竭_(dá)腸道時，由于pH突變上升至中性，花色苷分子迅速降解轉(zhuǎn)化為醌式結(jié)構(gòu)、半縮酮和查兒酮等形式，穩(wěn)定性顯著下降，含量大大減少[9]。文獻表明，90%的葡萄花青素在胃腸道消化后丟失[41]。楊梅中的花青素對消化過程非常敏感，經(jīng)胃腸消化后，生物利用率為40%～65%[41-43]，而FLORES等[17]則發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷在乳清蛋白包埋前后的胃腸道消化率為60%～80%，與本實驗中的數(shù)據(jù)相符。

圖6 胃部消化過程中花色苷的生物利用率Fig.6 Changes of anthocyanin bioaccessibility during gastric juice digestion

2種粉末經(jīng)口腔和胃液消化后的微觀圖像見圖7。可以觀察到在經(jīng)過口腔消化后，粉末表面出現(xiàn)明顯褶皺，推測這與干燥粉末進入唾液后，水分活度增大，吸水收縮有關(guān)。經(jīng)胃液消化后，粉末顆粒球狀結(jié)構(gòu)被破壞，呈現(xiàn)碎片狀，是因為豌豆蛋白會被胃蛋白酶消化所致。

a、b-楊梅-蛋白粉口腔消化后；c、d-楊梅-蛋白粉胃液消化后圖7 楊梅-蛋白粉體外消化后的掃描電鏡圖像Fig.7 Scanning electron image of protein-bayberry powder and pea protein powder after in vitro digestion

因此，利用豌豆蛋白為壁材沒有顯著提高楊梅果汁花色苷生物利用率(P>0.05)。其他一些研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。OIDTMANN等[44]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白包埋的花色苷在胃液前20 min快速釋放，1 h后，包埋和未包埋的花色苷濃度相同。FLORES等[17]利用乳清蛋白制備花色苷粉末并評價生物利用率，結(jié)果顯示，消化后包埋和未包埋的花色苷釋放量相等，但微膠囊包埋后比未包封的果渣提取物顯示出更大的抗氧化能力。

4 結(jié)論

利用豌豆蛋白作為壁材將楊梅果汁加工成楊梅-蛋白粉是一種新型果蔬深加工方法的探討。楊梅-蛋白粉形貌圓潤，近似球形，與豌豆蛋白粉相比更加光滑，粒徑更小且均勻，F(xiàn)TIR和TG分析表明，楊梅果汁與豌豆蛋白復(fù)配后，對豌豆蛋白二級結(jié)構(gòu)有一定的影響，α-螺旋下降1.22%，β-折疊下降1.98%，β-轉(zhuǎn)角上升3.72%，無規(guī)則卷曲下降0.52%，且較好地保留了豌豆蛋白熱穩(wěn)定性。楊梅-蛋白粉Zeta電位為-45 mV，比豌豆蛋白粉的穩(wěn)定性顯著提高。體外消化結(jié)果表明，在口腔中楊梅-蛋白粉的生物率只有4.86%，說明只有微弱釋放。在胃液中消化30 min后，楊梅-蛋白粉中花色苷的生物利用率為74.98%，低于果肉(91.23%)和果汁(99.31%)，推測由于微膠囊壁材未被完全消化，花色苷被包埋未能完全釋放至胃液中。60～120 min，楊梅-蛋白粉與果肉花色苷逐漸釋放至胃液，同時花色苷發(fā)生降解。在胃液中消化120 min后，楊梅-蛋白粉、果肉、果汁中花色苷生物利用率基本一致(65%～75%)，但花色苷由于在中性條件下發(fā)生降解經(jīng)腸道消化后未檢出。雖然楊梅-蛋白粉產(chǎn)品并未有效提高花色苷生物利用率，有研究表明相比于未經(jīng)包埋的，包埋后的花色苷具有更高的抗氧化活性[17]，這將是下一步研究的方向。通過本文楊梅-蛋白粉產(chǎn)品的探討，可為楊梅的開發(fā)及花色苷穩(wěn)定性研究提供理論依據(jù)和新思路。