湯麗琴，徐玉娟，吳繼軍，劉昊澄，余元善，林羨，傅曼琴，彭健，溫靖*

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌，330045)2(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室 廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州，510610)

顏色是食品品質(zhì)的重要屬性，影響消費者的接受度。食品工業(yè)常用合成著色劑來增強、均質(zhì)和改變食品的色澤。近年來，天然色素逐漸引起人們的關(guān)注，研究者開始從植物原料中獲取天然食用色素。梔子是天然色素的重要來源，屬藥食同源植物[1]。梔子果實的主要成分有環(huán)烯醚萜苷、奎寧酸衍生物和類胡蘿卜素等[2]。梔子黃色素已被廣泛用作食品著色劑，如糖果、餅干、果汁、面條等[3]，其主要成分是西紅花素-1(crocin-1)，一種特殊的水溶性類胡蘿卜素。近年已有研究結(jié)果顯示西紅花素-1具有抗腫瘤、抗氧化和抗抑郁等藥理活性[4-5]。然而梔子黃色素粗提物由于京尼平苷雜質(zhì)的存在，容易使食品出現(xiàn)褪色及綠變[6]。因此，建立高效的提取純化工藝去除京尼平苷是梔子黃色素綜合利用的關(guān)鍵。此外，純化過程有望通過富集生物活性化合物來提高生物活性。目前已有研究采用膜分離法[7]、聚酰胺層析法[8]等對梔子黃色素進(jìn)行分離制備，然而尚未發(fā)現(xiàn)使用X-5大孔樹脂純化梔子黃色素粗提液的報道。大孔樹脂具有良好的理化穩(wěn)定性、易回收和吸附選擇性高等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離純化，具有工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。此外，評估天然著色劑的穩(wěn)定性對于確定食品保質(zhì)期至關(guān)重要[9]。據(jù)報道，西紅花素-1在光照、高溫條件下較不穩(wěn)定，限制了其在各領(lǐng)域的發(fā)展[10]，不同來源西紅花素-1的穩(wěn)定性可能存在差異。本研究采用X-5大孔樹脂對梔子果實中提取的梔子黃色素進(jìn)行純化工藝優(yōu)化，并分析了純化前后梔子黃色素的穩(wěn)定性，以期為梔子黃色素的開發(fā)與應(yīng)用以及保存方式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫殼梔子果實采自江西吉安；X-5大孔樹脂(比表面積500～600 m2/g；孔徑29～30 nm；粒徑0.315～1.25 nm；非極性)，源葉生物科技有限公司；西紅花素-1標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)、京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈(色譜純)，德國Meker公司；無水乙醇、MgSO4、Fe2(SO4)3、NaOH(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RLGY-600超高壓設(shè)備，溫州諾貝機械有限公司；BJ-200 多功能粉碎機，上海拜杰實業(yè)有限公司；UV-1900i型分光光度計，日本島津公司；普通層析柱(1 cm×20 cm)，上海夏美生化科技發(fā)展有限公司；FDU-2110冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 梔子黃色素粗提液的制備

原料預(yù)處理：將脫殼梔子果實在50 ℃烘箱中干燥至恒重，多功能粉碎機進(jìn)行研磨，過60目篩，得干燥梔子果實粉末，置于4 ℃黑暗環(huán)境下備用。

參照ZHANG等[11]的方法進(jìn)行梔子黃色素的提取。在前期實驗的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確稱取1.00 g梔子干粉，以料液比1∶18(g∶mL)加入50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇溶液，用真空封口機密封在聚乙烯真空袋中，于超高壓設(shè)備中以100 MPa處理115 s。超高壓處理后，收集提取液于離心管中，5 000 r/min離心10 min，收集上清液。將收集的上清液與石油醚于分液漏斗中等體積混合萃取2次，棄上層石油醚層，收集下層色素溶液。然后將下層色素溶液在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮除去乙醇及石油醚，最終得到梔子黃色素粗提濃縮液。

1.3.2 梔子黃色素的制備

1.3.2.1 泄漏曲線的繪制

大孔樹脂預(yù)處理：稱取一定量的大孔樹脂于燒杯中，加入5倍體積的乙醇浸泡過夜。

前期預(yù)實驗已經(jīng)對LX-17、XDA-1、ADS-7、ADS-21、AB-8、X-5、XDA-7、HP-20等大孔樹脂進(jìn)行了初步篩選，根據(jù)吸附及解吸量的比較，最終選擇X-5大孔樹脂進(jìn)行動態(tài)吸附實驗。準(zhǔn)確稱取干質(zhì)量2.00 g的經(jīng)預(yù)處理后的X-5大孔樹脂，濕法裝入層析柱中，并用超純水洗滌至流出液無醇味。將1.0 mg/mL的梔子黃色素粗提液，以1 mL/min的上樣流速上樣，每10 mL流出液收集1管，在440 nm處測定吸光值。根據(jù)西紅花素-1標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=53.28x+0.06,R2=0.99)計算每管流出液中梔子黃色素的含量，繪制梔子黃色素泄漏曲線。

1.3.2.2 上樣質(zhì)量濃度的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取干質(zhì)量2.00 g的樹脂，進(jìn)行濕法裝柱。配制上樣質(zhì)量濃度分別為1.50、2.00、2.50、3.00以及3.50 mg/mL的梔子黃色素粗提液，控制上樣流速為2.00 mL/min。收集不同上樣濃度色素流出液，測定梔子黃色素的含量，吸附率按照公式(1)計算。

(1)

式中：上樣量，總的上樣梔子黃色素含量，mg；泄漏量，總流出液中梔子黃色素的含量，mg。

1.3.2.3 上樣流速的優(yōu)化

梔子黃色素粗提液上樣質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL，控制上樣流速分別為1.00、1.50、2.00、2.50以及3.00 mL/min。收集不同上樣流速色素流出液，測定梔子黃色素含量，吸附率按照公式(1)計算。

1.3.2.4 洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

上樣質(zhì)量濃度2.00 mg/mL，上樣流速1.50 mL/min，待梔子黃色素吸附完成，分別用250 mL體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%以及90%的乙醇溶液以3.00 mL/min的洗脫流速對梔子黃色素進(jìn)行洗脫。收集不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液，測定梔子黃色素含量，洗脫率按照公式(2)計算。

(2)

式中：洗脫量，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫的梔子黃色素含量，mg；上樣量與泄漏量同公式(1)。

1.3.2.5 洗脫流速的優(yōu)化

上樣質(zhì)量濃度2.00 mg/mL，上樣流速1.50 mL/min，洗脫乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，控制洗脫流速分別為2.00、2.50、3.00、3.50以及4.00 mL/min。收集不同洗脫流速洗脫液，測定梔子黃色素含量，洗脫率按照公式(2)計算。

1.3.2.6 動態(tài)洗脫實驗

在確定的優(yōu)化工藝條件下進(jìn)行梔子黃色素粗提液動態(tài)洗脫實驗。參照CHEN等[12]的方法，首先采用500 mL的超純水進(jìn)行洗脫，再用20%乙醇溶液以2.5 mL/min的流速洗脫京尼平苷，每20 mL收集1管，繪制京尼平苷洗脫曲線。最后用80%乙醇溶液以3.00 mL/min的流速洗脫梔子黃色素，每6 mL收集1管，繪制梔子黃色素洗脫曲線。分別收集20%和80%乙醇洗脫液，在40 ℃下減壓濃縮除去乙醇，并于冷凍干燥機中干燥成粉末，于-20 ℃貯藏備用。

1.3.3 色價的測定

參照GB 7912—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 梔子黃》進(jìn)行色價的測定。色價按公式(3)計算：

(3)

1.3.4 紫外-可見光譜分析

梔子黃色素粗提液、梔子黃色素純化液、西紅花素-1標(biāo)準(zhǔn)品以及京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品分別用蒸餾水溶解。然后在200～800 nm進(jìn)行掃描，分析其光譜特征。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

1.3.5.2 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)的測定

采用Fe3+還原法[14]，樣品的鐵還原能力以Trolox當(dāng)量(TE)表示，單位為 mg TE/ mL。

1.3.5.3 ABTS陽離子自由基清除率的測定

參考SHANG等[15]的方法進(jìn)行測定，樣品對ABTS陽離子自由基的清除能力以TE表示，單位為 mg TE/mL。

1.3.6 穩(wěn)定性的測定

1.3.6.1 溫度穩(wěn)定性

將相同質(zhì)量濃度的梔子黃色素粗提液及純化液分裝于50 mL離心管中，分別置于4、25、50以及75 ℃的環(huán)境下，測定在0、1、2、3、4以及5 h的梔子黃色素含量，梔子黃色素?fù)p失率按公式(4)計算。

(4)

式中：ODt0，0 h時梔子黃色素的吸光值；ODti，ih時梔子黃色素的吸光值。

1.3.6.2 光照穩(wěn)定性

將相同質(zhì)量濃度的梔子黃色素粗提液及純化液分裝于50 mL離心管中，分別置于燈光、紫外光(燈光：15 W，300 lx；紫外光：15 W，40 lx)以及黑暗的環(huán)境下，測定在0、1、2、3、4以及5 h的梔子黃色素含量，梔子黃色素?fù)p失率按公式(4)計算。

1.3.6.3 金屬離子穩(wěn)定性

梔子黃色素粗提液及純化液分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的Fe2(SO4)3、MgSO4、CuSO4、ZnSO4和MnSO45種不同溶液稀釋至相同質(zhì)量濃度，測定在0、1、2、3、4以及5 h的梔子黃色素含量，梔子黃色素?fù)p失率按公式(4)計算。

1.3.6.4 pH穩(wěn)定性

梔子黃色素粗提液及純化液分別用配制好的不同pH的緩沖液(3、5、7、9和11)稀釋至相同質(zhì)量濃度，然后測定在0、1、2、3、4以及5 h的梔子黃色素含量，梔子黃色素?fù)p失率按公式(4)計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著，所有實驗均重復(fù)3次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子黃色素純化工藝優(yōu)化

2.1.1 X-5大孔樹脂動態(tài)吸附泄漏曲線

泄漏曲線是決定吸附柱操作及動態(tài)響應(yīng)的重要參數(shù)。通常，泄漏點(出口溶液的濃度達(dá)到進(jìn)口溶液的大約5%)被認(rèn)為是大孔樹脂吸附達(dá)到平衡的點[16]。在泄漏點，樹脂無法容納吸附分子，溶質(zhì)開始從樹脂中泄漏。所以，有必要對大孔樹脂進(jìn)行泄漏曲線的測定，為大孔樹脂的用量及梔子黃色素的上樣量提供實驗依據(jù)。如圖1所示，梔子黃色素在流出液達(dá)到200 mL時開始出現(xiàn)泄漏，當(dāng)?shù)竭_(dá)600 mL時，流出液的濃度與原上樣液中的梔子黃色素濃度接近，表明X-5樹脂對梔子黃色素粗提液的吸附已經(jīng)達(dá)到飽和。因此，可以確定梔子黃色素在該條件下的最大上樣量不能超過600 mL。

圖1 X-5大孔樹脂動態(tài)吸附泄漏曲線Fig.1 Dynamic adsorption leakage curve of X-5 macroporous resin

2.1.2 動態(tài)吸附及解吸條件的優(yōu)化

為優(yōu)化梔子黃色素的動態(tài)吸附與解吸過程，本研究對上樣質(zhì)量濃度、上樣流速、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和洗脫流速進(jìn)行了評估。由圖2-a可知，X-5大孔樹脂對梔子黃色素的吸附率隨梔子黃色素質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL時，吸附率達(dá)最大為79.12%。這是因為當(dāng)梔子黃色素質(zhì)量濃度較低時，增大梔子黃色素的濃度會增加與西紅花素相關(guān)活性位點數(shù)目，此外還能增加與大孔樹脂的接觸面積。然而，當(dāng)梔子黃色素質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大，會使更多的雜質(zhì)吸附在X-5大孔樹脂上以及導(dǎo)致大孔樹脂吸附飽和的提前，因此吸附率會有所下降[17]。上樣流速是影響梔子黃色素吸附率的另一個重要因素。由圖2-b可以看出，隨著上樣流速的增大，吸附率逐漸減小。這是因為過高的上樣流速導(dǎo)致梔子黃色素還未被大孔樹脂吸附便已經(jīng)泄漏，而較小的上樣流速使得梔子黃色素有足夠的時間與大孔樹脂相互作用[18]。然而，在實際操作過程中，較小的上樣流速導(dǎo)致實驗周期延長。因此，本實驗選擇1.50 mL/min的上樣流速進(jìn)行后續(xù)的實驗。由圖2-c可以看出，梔子黃色素的解吸率隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先增大后減少。當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，梔子黃色素的解析率最高。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，洗脫劑的極性越弱，而梔子黃色素的極性較小更容易被弱極性的洗脫劑洗脫。如圖2-d所示，解吸流速對解吸率有明顯影響，在解吸流速為3.00 mL/min時，解吸率最高達(dá)97.24%。解吸流速過低會導(dǎo)致解吸時間過長，解吸的雜質(zhì)增多。而過高的解吸流速會增加解吸溶液的量，增加了后續(xù)富集的工作量。

a-梔子黃色素質(zhì)量濃度對吸附率的影響；b-上樣流速對吸附率的影響；c-乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對解吸率的影響；d-洗脫流速對解吸率的影響圖2 梔子黃色素動態(tài)吸附與解吸工藝優(yōu)化Fig.2 Optimization of the dynamic adsorption and desorption process of gardenia yellow pigment

2.1.3 動態(tài)洗脫曲線

根據(jù)先前的實驗結(jié)果對梔子黃色素進(jìn)行分離制備，待梔子黃色素吸附平衡，首先用500 mL超純水以2.00 mL/min的流速洗脫大孔樹脂以除去梔子黃色素粗提液中的大部分糖、蛋白質(zhì)以及其他大分子化合物。然后參考CHEN等[12]的方法，用20%的乙醇以2.50 mL/min的流速洗脫京尼平苷，最后用80%乙醇以3.00 mL/min的流速洗脫梔子黃色素。由圖3可知，解吸曲線較尖銳，沒有出現(xiàn)拖尾，適用于京尼平苷及梔子黃色素的洗脫。此外，洗脫體積分別為800和200 mL。分別收集20%和80%洗脫液，在40 ℃下旋蒸除去乙醇，再進(jìn)行冷凍干燥即得到2種粉末產(chǎn)品(圖3)。

a-京尼平苷；b-西紅花素-1圖3 京尼平苷和西紅花素-1的動態(tài)洗脫曲線Fig.3 Dynamic elution curve of geniposide and crocin-1

2.1.4 紫外-可見光譜分析

本研究通過對京尼平苷標(biāo)準(zhǔn)品、西紅花素-1標(biāo)準(zhǔn)品以及梔子黃色素粗提物進(jìn)行200～800 nm的全光譜掃描，確定了梔子黃色素粗提物的主要化合物類型。由圖4-a～圖4-c可以看出，梔子黃色素粗提物中含有京尼平苷(238 nm)、綠原酸(325 nm)、西紅花素-1(440 nm)。由圖4-d可以看出，經(jīng)X-5大孔樹脂純化后，梔子黃色素純化液中的京尼平苷的吸收峰幾乎消失，西紅花素-1的相對峰明顯增加，結(jié)果表明，大部分的京尼平苷雜質(zhì)被去除。

a-京尼平苷；b-西紅花素-1；c-純化前梔子黃色素；d-純化后梔子黃色素圖4 京尼平苷、西紅花素-1、純化前以及純化后梔子黃色素的紫外吸收光譜圖Fig.4 UV-VIS absorption spectra of geniposide, crocin-1, before purification and after purification of gardenia yellow pigment

2.2 純化前后梔子黃色素理化特性評價

如表1所示，通過對純化前后梔子黃色素各項理化指標(biāo)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，在相同質(zhì)量濃度的梔子黃色素條件下，純化后的梔子黃色素具有更高的DPPH、ABTS抗氧化能力以及FRAP還原力，這與鄒立君[19]的研究結(jié)果一致。人體內(nèi)自由基和生物分子之間的反應(yīng)可能導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷或細(xì)胞死亡，氧自由基及其衍生物可能通過破壞DNA和細(xì)胞膜而破壞細(xì)胞。因此，梔子黃色素可作為清除人體多余自由基的營養(yǎng)保健食品原料。純化后的色價達(dá)243.43，較梔子黃色素粗提液提高了4.07倍，說明該純化工藝對梔子黃色素的分離制備是有效的。

表1 純化前后梔子黃色素理化指標(biāo)測定Table 1 Determination of physical and chemical indexes of gardenia yellow pigment before and after purification

2.3 純化前后梔子黃色素穩(wěn)定性評價

2.3.1 溫度穩(wěn)定性評價

隨著消費者健康意識的提高，植物原料提取的天然著色劑越來越受青睞。西紅花素-1是梔子黃色素的主要成分之一，具有高度不飽和結(jié)構(gòu)，這可能會在一定程度上影響其在食品中的加工應(yīng)用。因此研究梔子黃色素的穩(wěn)定性很有必要。由圖5可知，純化前與純化后的梔子黃色素的損失率均隨時間的延長及溫度的升高而增大，且純化后的梔子黃色素穩(wěn)定性均高于未純化梔子黃色素。純化前及純化后的梔子黃色素?fù)p失率在5 h，75 ℃條件下達(dá)到最高分別為12.31%，8.85%，這表明高溫加速梔子黃色素降解。WEBER等[20]報告了類似的研究結(jié)果。此外，CARMONA等[21]研究表明在較高溫度下，西紅花素的糖苷鍵斷裂，葡萄糖分子丟失。因此，梔子黃色素應(yīng)保存在較低溫度環(huán)境中，避免與高溫接觸。

a-純化前；b-純化后圖5 溫度對純化前與純化后梔子黃色素?fù)p失率的影響Fig.5 Effect of temperature on the loss rate of gardenia yellow pigment before purification and after purification

2.3.2 光照穩(wěn)定性評價

如圖6所示，純化前與純化后的梔子黃色素?fù)p失率均隨光照時間的增加而增大。在相同光照條件下，純化后梔子黃色素比未純化梔子黃色素更穩(wěn)定，這可能是因為梔子黃色素粗提物中的雜質(zhì)會加速梔子黃色素的損失。此外，相較于燈光及黑暗環(huán)境，紫外光照射對梔子黃色素的穩(wěn)定性影響較大，損失率達(dá)5.29%(純化前)和3.27%(純化后)。這與ALEHOSSEINI等[22]的研究結(jié)果一致。因此，梔子黃色素應(yīng)避光保存。

a-純化前；b-純化后圖6 光照對純化前與純化后梔子黃色素?fù)p失率的影響Fig.6 Effect of illumination on the loss rate of gardenia yellow pigment before purification and after purification

2.3.3 金屬離子穩(wěn)定性評價

從圖7中可以看出，F(xiàn)e3+對梔子黃色素穩(wěn)定性影響最大，在前1 h內(nèi)2種梔子黃色素的損失率均達(dá)到將近100%。這可能是因為梔子黃色素中的西紅花素-1成分的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)與Fe3+形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致梔子黃色素的含量降低[23]。和對照組相比，除Fe3+以外的其他金屬離子對梔子黃色素均呈現(xiàn)一定的保護(hù)作用，這可能與反應(yīng)體系中電解質(zhì)強度有關(guān)。因此，在梔子黃色素產(chǎn)品加工與運輸過程中應(yīng)避免與鐵制品接觸，可以使用安全的塑料制品進(jìn)行包裝。

a-純化前；b-純化后圖7 金屬離子對純化前和純化后梔子黃色素?fù)p失率的影響Fig.7 Effect of metal ions on the loss rate of gardenia yellow pigment before purification and after purification

2.3.4 pH穩(wěn)定性評價

圖8顯示了不同pH處理對梔子黃色素?fù)p失率的影響。

a-純化前；b-純化后圖8 pH對純化前和純化后梔子黃色素?fù)p失率的影響Fig.8 Effect of pH on the loss rate of gardenia yellow pigment before purification and after purification

梔子黃色素的損失率隨處理時間的延長而增大，與純化前梔子黃色素相比較，純化后的梔子黃色素表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。由圖8可以看出，2種梔子黃色素在pH 5～7的環(huán)境下，損失率較低，而在偏酸偏堿的環(huán)境下，損失率將近10%。酸性環(huán)境的損失可能是因為梔子黃色素中的西紅花素-1易受親電試劑H+作用而氧化為飽和烴，色素特征吸收峰向紫外區(qū)漂移，發(fā)生色移和褪色[24]。堿性環(huán)境的損失可能是因為梔子黃色素中西紅花素類成分的羥基在堿性環(huán)境容易失去氫而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

3 結(jié)論

本研究采用X-5大孔樹脂對梔子黃色素進(jìn)行分離純化，考察各因素對梔子黃色素吸附及解吸性能的影響，得到最佳工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度2.00 mg/mL、上樣流速1.50 mL/min、洗脫乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、洗脫流速3.00 mL/min。在此條件下分離純化，梔子黃色素的色價由48.51提高到243.43。此外，純化后梔子黃色素具有更高的抗氧化活性。穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明純化前后梔子黃色素受高溫、紫外光、強酸強堿以及Fe3+的影響均會產(chǎn)生一定的損失。此外，純化后梔子黃色素穩(wěn)定性強于純化前梔子黃色素。因此，梔子黃色素產(chǎn)品應(yīng)存于低溫、中性以及無Fe3+的環(huán)境中。后期有必要對梔子黃色素進(jìn)行包埋研究，以提高該色素的穩(wěn)定性，增加其應(yīng)用價值。