王華瑜，沈朝璐，袁玥，武曉麗，管婧，艾方彬

1(江西中醫(yī)藥大學 藥學院，江西 南昌，330004)2(江西中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，江西 南昌，330004)

多孔淀粉(porous starch, PS)又稱微孔淀粉，色白，呈粉末狀，外觀與原淀粉類似。它是由天然淀粉經(jīng)過酶處理、化學/物理處理或酶與化學/物理處理相結(jié)合的方法得到的一種淀粉改性產(chǎn)物[1]，與天然淀粉相比，多孔淀粉的形狀呈多孔性蜂窩狀，表面仍為圓形狀，但其內(nèi)部具有大量的孔隙結(jié)構(gòu)或凹陷，從淀粉表面延伸至中心，導致其具有較大的比容積和比表面積，因而表現(xiàn)出較強的吸附性能。由于其良好的生物相容性、生物降解性、吸附性和廉價易得等優(yōu)點，多孔淀粉已被廣泛應用于化學[2]、制藥業(yè)[3]、食品[4]、醫(yī)療[5]和環(huán)境[6]行業(yè)領域。

姜黃素(curcumin, Cur)又稱姜黃色素，是常用的天然黃色色素，有特殊芳香味道。它是一個多酚類化合物，主要從姜科植物姜黃、莪術、郁金等傳統(tǒng)中藥材根莖[7]中提取，已被廣泛應用于色素、食品添加劑及調(diào)味品中。實驗證明姜黃素具有抗腫瘤、抗突變、降壓、保肝等廣泛的藥理活性[8-11]。然而姜黃素還存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)釋放緩慢、半衰期短、在腸道中吸收率低等不足[12]，這些不足導致其在人體內(nèi)生物利用度較低，限制了它的實際應用。如何改善姜黃素在應用方面的缺點、提高體內(nèi)生物利用度已經(jīng)成為研究者們亟需解決的問題。近年來，新型姜黃素緩釋載體的研究逐漸受到重視，其主要載體類型包括固體分散體[13]、脂質(zhì)體載體[14]、納米粒載體[15]、自微乳載體[16]、緩釋微球載體[17]、線性糊精載體[18]等。其中，緩釋微球載體具有制備簡易、穩(wěn)定性好、能提高難溶性藥物的生物利用率等優(yōu)點，受到了廣泛關注。

目前已報到的姜黃素-多孔淀粉類微球，其載體主要有海藻酸鹽和多孔淀粉復合凝膠[19]、多孔大米淀粉與黃原膠混合物[20]、多孔淀粉與β-環(huán)糊精混合物[21]等。但是這些報道并沒有對玉米多孔淀粉作為載體展開優(yōu)化制備、體外釋放率等詳細研究。基于此，本文選取姜黃素為模型藥物、以玉米多孔淀粉為載體，制備得到負載姜黃素的多孔淀粉微球，考察微球的最佳制備條件、表征和性質(zhì)，以及微球在模擬人體胃腸條件下的釋放情況，為提高難溶性姜黃素在食品領域的生物利用率提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

姜黃素，國藥集團化學試劑有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥95%，批號20190305；玉米多孔淀粉(酶法制備)，遼寧立達生物科技有限公司；無水乙醇(分析純)、鹽酸(分析純)，西隴科學股份有限公司；K2HPO4(分析純)、KH2PO4(分析純)，天津市永大化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉(分析純SDS)，西隴科學股份有限公司；胰蛋白酶(1∶250，豬胰臟)、胃蛋白酶(1∶3 000，豬源)，西亞試劑有限公司。

1.2 儀器設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；GT10-1型高速臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；ZWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；(2487型紫外檢測器)高效液相色譜儀，美國Waters；掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)，美國FEI INSPECT公司；全自動比表面及孔隙度分析儀(Brunauer-Emmett-Teller, BET)，麥克ASAP 2020；460 ATR型傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infteared inspectroscopy, FT-IR)，美國NICOLET；D8 ADVANCE型X射線衍射儀(X-Ray diffraction, XRD)，布魯克；STA 449C差示量熱掃描儀(differential scanning calorimetry-thermogravimetric analysis, DSC-TG)，德國耐馳。

1.3 實驗方法

1.3.1 負載姜黃素的多孔淀粉微球的制備

準確稱取100 mg姜黃素溶于100 mLV(二氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶1溶液中，按照不同的質(zhì)量配比(姜黃素與多孔淀粉質(zhì)量比1∶1～1∶5)加入適量的多孔淀粉，將混合體系密封、在室溫下超聲30 min后，置于恒溫加熱水浴鍋中，在37 ℃下攪拌吸附2 h。每組實驗重復3次。吸附完成后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷-甲醇混合液體，用上述混合液體洗滌除去微球表面的姜黃素，得到均勻的黃色固體。真空干燥、研磨、過80目篩，即得到負載姜黃素的多孔淀粉微球，置于干燥器備用。

1.3.2 負載姜黃素的多孔淀粉微球的優(yōu)化

1.3.2.1 最佳投藥質(zhì)量濃度的確定

參考文獻[22]的方法，燒杯中加入100 mLV(二氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶1混合溶液，分別按姜黃素原藥的投藥質(zhì)量濃度為40、50、60、70、80、90、100 mg/mL投入吸附體系中，再分別加入相應的多孔淀粉(按姜黃素原藥與多孔淀粉質(zhì)量比1∶5投藥)，將體系密封室溫中超聲30 min后，置于恒溫加熱水浴鍋中，在37 ℃下磁力攪拌吸附2 h。每組實驗重復3次。吸附完成后分別取樣置入離心管內(nèi)8 000 r/min離心10 min后，取上清液再次以8 000 r/min離心10 min后過濾，用HPLC法[23]檢測上清液姜黃素含量。根據(jù)差減法，原始的姜黃素投入量減去上清液中所含的姜黃素的質(zhì)量，即為理論上被多孔淀粉負載的姜黃素的質(zhì)量。姜黃素的載藥量和包封率如公式(1)(2)所示：

(1)

(2)

根據(jù)最大載藥量與包封率時的姜黃素質(zhì)量濃度來確定最佳投藥質(zhì)量濃度。

1.3.2.2 最佳投料比例的測定

在燒杯中加入100 mLV(二氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶1混合溶液，計算出上述步驟得到的最佳投藥濃度的姜黃素原藥質(zhì)量，將其分別投入幾個吸附體系中，再依次加入相應配比質(zhì)量的多孔淀粉(姜黃素原藥與多孔淀粉質(zhì)量配比設置在1∶1.50、1∶2.00、1∶2.50、1∶3.00、1∶3.50、1∶4.00)。重復上述實驗步驟，吸附完成后分別取樣置入離心管內(nèi)8 000 r/min 離心10 min后，用HPLC法檢測上清液中含有的姜黃素的含量。同上，依次計算出包封率，根據(jù)最大的包封率來探究最佳投料比例。

參照文獻[22]還可以依據(jù)化學動力學來推算出單位質(zhì)量多孔淀粉中最多可以吸附姜黃素原藥的量。根據(jù)Langmuir吸附方程推導出載藥量計算公式(3)：

A=Qe(1+Qe)

(3)

式中：A，載藥量；Qe，多孔淀粉的吸附率。

Ce為上清液中所含姜黃素的濃度。根據(jù)1/Ce與1/Qe的曲線可以得出線性回歸方程y=kx+b。根據(jù)常數(shù)k=1/(Kd·Qmax)，b=1/Qmax，可分別計算出Kd、Qmax的值。Qmax即為每克多孔淀粉中最多可以吸附姜黃素原藥的量，Kd為吸附常數(shù)。

1.3.2.3 探究吸附時間的影響

在確定最佳姜黃素投藥濃度和最佳吸附比例后，在100 mLV(二氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶1混合溶液中投入上述得到的最佳投藥濃度姜黃素及多孔淀粉。將吸附體系在室溫下超聲30 min后，置于37 ℃水浴鍋中分別攪拌吸附2、5、10、15、20、30、45、60、120 min，并設置未攪拌吸附的空白作為對照。每組實驗重復3次。吸附完成后分別取樣置入離心管內(nèi)8 000 r/min離心10 min，再次離心過濾后，取上清液用HPLC檢測。對照標準品所繪制的回歸方程曲線得到樣品上清液中的姜黃素濃度。同上，依次計算出載藥量和吸附率，根據(jù)最大的載藥量和吸附率，來探究最佳吸附時間。

1.3.3 含量測定

1.3.3.1 色譜條件

姜黃素的含量可以通過高效液相色譜法[23]來測定，色譜條件如下：檢測器：紫外檢測器；色譜柱：Thermo Hyperil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相:質(zhì)量分數(shù)0.5%磷酸溶液-乙腈(體積比52∶48)；流速1 mL/min；檢測波長431 nm；進樣量20 μL；柱溫35 ℃。

1.3.3.2 模擬體外釋放評價

為了進一步考察微球在模擬體外腸胃液中的釋放性能，根據(jù)2020版《中國藥典》第四部目錄中通用技術要求之指導原則第9013條“緩釋、控釋和遲釋制劑指導原則”，本文體外釋放實驗采用一定pH值的PBS作為釋放液，其中加入質(zhì)量分數(shù)0.5%的SDS作為溶出介質(zhì)。參考文獻[24]，模擬腸液的釋放實驗如下：分別精密稱取姜黃素微球10.0 mg，放入具塞離心管中，分別加入上述含0.5%SDS的60 mL pH 8.0的PBS溶液，加入0.60 g胰蛋白酶搖勻，恒溫(37±0.5)℃氣浴振蕩(100 r/min)。在預定的時間內(nèi)取4 mL上清液，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后，按上面的色譜條件進樣，測定樣品、計算釋放率。并同時加入等體積的新鮮釋放液，搖勻繼續(xù)進行體外釋放實驗。除了加入不同pH值的緩沖溶液和酶，即加入pH 1.2的PBS溶液和0.20 g胃蛋白酶，模擬胃液實驗步驟同上。

1.3.4 表征

1.3.4.1 SEM檢測

取少量樣品涂布在帶有雙面黏附膠的玻璃片上，操作電壓為20 kV，并在Ar環(huán)境下噴金，放大不同倍數(shù)進行觀察。

1.3.4.2 BET檢測

采用全自動比表面及孔隙度分析儀，用低溫液氮(-196 ℃)吸附法測定。相對壓力(P/Po)范圍0.01～1.0，稱量樣品0.06 g，測定前樣品在300 ℃下脫氣10 h。氮吸附法以BET吸附公式為測定依據(jù)，通過BET法測定比表面積。

1.3.4.3 傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared，F(xiàn)T-IR)檢測

分別稱取2 mg樣品和200 mg KBr，同時放入瑪瑙研缽中研磨均勻，烘干后的樣品即可用紅外壓片模制片，在4 000～500 cm-1掃描。

1.3.4.4 XRD分析

電壓與電流分別為40 kV和30 mA，掃描速度為4°/min，掃描范圍為5°～85°。

1.3.4.5 DSC和TG檢測

DSC檢測：準確稱取淀粉樣品3 mg與蒸餾水以m(淀粉樣品)∶m(蒸餾水)=1∶3在坩堝中混合并密封，置于4 ℃下平衡24 h，以10 ℃/min的速度由30 ℃加熱至250 ℃，另取空坩堝作為空白對照。TG檢測：分別取3 mg樣品置于樣品池后，以10 ℃/min升溫速度從30 ℃升溫到800 ℃。

1.3.4.6 粒徑分析

分別將0.5 g未載藥的微球與載藥微球分散在10 mL去離子水中，超聲形成混懸液。以去離子水作為分散劑，在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下將混懸液滴加到去離子水中。設置參數(shù)如下：0.1～5 000 nm進行掃描，水的折射率1.33，淀粉的折射率1.52，吸收率為0.01。

1.4 統(tǒng)計分析

所有的測試結(jié)果均為3次，結(jié)果均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳投料質(zhì)量濃度的測定

如圖1所示，當姜黃素的投藥量為90 mg/mL時，載藥量和吸附率達到最大，分別為17.85%和21.73%，且當投料質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，載藥量和吸附率趨于平衡，不再增大，甚至出現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于多孔淀粉的吸附作用在90 mg/mL時已出現(xiàn)飽和，所以可以看出姜黃素的最佳投料質(zhì)量濃度為90 mg/mL。

圖1 姜黃素不同投藥質(zhì)量濃度下的載藥量和吸附率Fig.1 Drug loading and adsorption rate under different dosage concentrations of curcumin

2.2 最佳投料比例的測定

參照文獻[22]，圖2為根據(jù)1/Ce與1/Qe所得的線性回歸方程Y=19.54X+2.584，r2=0.99的等溫吸附曲線。根據(jù)常數(shù)k=19.54=1/(KdQmax)，b=2.58=1/Qmax，可計算出Qmax=0.39 mg/mg，即每毫克多孔淀粉可負載0.39 mg姜黃素。

圖2 多孔淀粉對姜黃素的等溫吸附曲線Fig.2 Porous starch adsorption isotherm curve of curcumin

如圖3所示，當姜黃素原藥與多孔淀粉的投藥比例在1∶2.50附近時，包封率達到最大為(90.70±0.12)%，且當投料比例繼續(xù)增大時，包封率趨于平衡，不再增大，甚至出現(xiàn)下降趨勢。這與上面得到的結(jié)論“每毫克多孔淀粉可負載0.39 mg姜黃素”相一致，由此可以推出最佳吸附配比為：姜黃素900 mg、多孔淀粉2 250 mg，即兩者最佳質(zhì)量投料比例為1∶2.50。

圖3 吸附體系不同投料比例時的包封率Fig.3 Encapsulation efficiency of the adsorption system with different feeding ratios

2.3 探究吸附時間對姜黃素負載的影響

根據(jù)上述實驗確定的最佳投藥質(zhì)量與吸附比例，應在10 mLV(二氯甲烷)∶V(甲醇)=3∶1混合溶液中分別投入姜黃素900 mg，多孔淀粉2 322 mg。在相同的吸附體系下吸附不同時間，根據(jù)不同時間下的載藥量和吸附率繪制曲線方程，結(jié)果如圖4所示。在吸附時間達到20 min時，載藥量和吸附率均出現(xiàn)最大值，分別為(35.22±0.46)%和(54.37±0.51)%，之后的2 h內(nèi)吸附過程趨于平衡狀態(tài)，其載藥量和吸附率的曲線也趨于平衡。因此，綜合考慮載藥量和吸附率，負載姜黃素的最佳吸附時間確定為20 min。

圖4 不同吸附時間的載藥量和吸附量Fig.4 Drug loading and adsorption rate for different adsorption time of adsorption system

2.4 表征結(jié)果

2.4.1 SEM檢測

為了觀察姜黃素的負載情況，本文對多孔淀粉負載前后進行了形貌表征。圖5-a為原生多孔淀粉形貌圖，多孔淀粉粒徑約5.00～8.00 μm，呈不規(guī)則球狀，表面具有多孔連通結(jié)構(gòu)，孔徑小于1.00 μm。圖5-b為負載姜黃素的多孔淀粉，孔隙被姜黃素填充滿，大部分姜黃素被吸附在多孔淀粉空隙中，少量姜黃素分布在表面。這表明多孔淀粉成功負載姜黃素，形成了負載姜黃素的多孔淀粉微球。

a-多孔淀粉；b-負載姜黃素的多孔淀粉圖5 多孔淀粉，負載姜黃素的多孔淀粉的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of porous starch, curcumin loaded porous starch microspheres

2.4.2 BET檢測及粒徑分析

多孔淀粉屬于無定形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒徑小、表面多孔，而姜黃素原藥具有晶體結(jié)構(gòu)。在制備過程中，多孔淀粉吸附姜黃素原藥，使姜黃素的粒徑變小。孔徑結(jié)果如表1所示,原生多孔淀粉的平均孔徑為5.80 nm，姜黃素多孔淀粉微球樣品的平均孔徑為1.06 nm，比負載前減少了81.72%；比表面積測定結(jié)果顯示，多孔淀粉比表面積為16.76 m2/g，負載姜黃素的多孔淀粉微球樣品比表面積為3.50 m2/g，比負載前減少了79.12%。而負載姜黃素的多孔淀粉微球樣品和多孔淀粉的粒徑基本變化不大，這表明姜黃素已成功負載于多孔淀粉載體內(nèi)，多孔淀粉孔隙被姜黃素填充。

表1 比表面積和粒徑分析Table 1 BET and particle size analysis

2.4.3 FT-IR檢測

圖6 多孔淀粉、姜黃素和負載姜黃素的多孔淀粉微球的FT-IR檢測圖譜Fig.6 Infrared spectrum of porous starch, curcumin and curcumin loaded porous starch microspheres

2.4.4 XRD分析

如圖7所示，多孔淀粉樣品分別在2θ15.12°、17.13°和23.25°表現(xiàn)出微弱的峰值，這是A型淀粉的典型特征，表明以無定形態(tài)形式存在。姜黃素圖譜中的衍射峰，分別在2θ8.98°、12.28°、14.69°、17.50°、23.52°、24.66°、25.66°和27.52°有明顯衍射峰，證明姜黃素具有晶體結(jié)構(gòu)并以晶體形式存在。在負載姜黃素的多孔淀粉微球的圖譜上仍舊可以看到姜黃素的部分特征衍射峰(14.71°、17.84°、23.81°、25.84°、27.53°)，只是與姜黃素相比，這些峰的強度有所減弱，說明大部分姜黃素被分散，少量以晶體形式存在。對比多孔淀粉，負載姜黃素的多孔淀粉微球圖譜在2θ14.71°和23.32°也出現(xiàn)了相似的很弱衍射峰，這說明，多孔淀粉起到了載體分散作用，姜黃素結(jié)晶度降低，以微晶狀態(tài)分散于載體孔道和表面。這與FT-IR的測試結(jié)果相一致。

圖7 多孔淀粉、姜黃素和負載姜黃素的多孔淀粉微球的XRD檢測圖譜Fig.7 XRD spectrum of porous starch, curcumin and curcumin loaded porous starch microspheres

2.4.5 DSC和TG檢測

如圖8所示，多孔淀粉主要以無定形態(tài)存在，68 ℃出現(xiàn)一個熔點峰。姜黃素原藥在177 ℃處顯示出一個很明顯的吸熱峰，該峰為其熔點特征峰，表明姜黃素原藥以晶體形式存在。多孔淀粉微球也出現(xiàn)同樣較小的吸熱峰，而其峰強度明顯降低，這說明大部分的姜黃素已經(jīng)被多孔淀粉吸附在內(nèi)部空隙中，只有少量吸附在多孔淀粉微球的表面，這與XRD的檢測結(jié)果是一致的。

圖8 多孔淀粉、姜黃素和負載姜黃素的多孔淀粉微球的DSC檢測圖譜Fig.8 DSC spectrum of porous starch, curcumin and curcumin loaded porous starch microspheres

根據(jù)圖9的TG數(shù)據(jù)結(jié)果分析，多孔淀粉從30 ℃開始出現(xiàn)少量熱失重，到100 ℃左右基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，100～300 ℃時質(zhì)量損失不明顯，300 ℃開始迅速失重，在350 ℃時只剩余20%。姜黃素原藥也在300 ℃左右開始迅速失重，直至400 ℃時已經(jīng)熱分解50%，而微球也從30 ℃開始熱分解，30～100 ℃時質(zhì)量損失不明顯，而當溫度升高到300 ℃后開始出現(xiàn)較為迅速的質(zhì)量損失。這一現(xiàn)象說明在多孔淀粉微球中，2種物質(zhì)幾乎同時受熱分解。值得注意的是，在400 ℃時，多孔淀粉微球的質(zhì)量損失比多孔淀粉少30%，而這一結(jié)果和測得的載藥量(35.22±0.46)%也是接近的。

圖9 多孔淀粉、姜黃素和負載姜黃素的多孔淀粉微球的熱重檢測圖譜Fig.9 TG spectrum of porous starch, curcumin and curcumin loaded porous starch microspheres

2.5 體外釋放實驗

為了證明負載姜黃素的多孔淀粉微球的緩釋行為，除了對比姜黃素原藥、負載姜黃素的多孔淀粉微球(質(zhì)量配比為1∶2.50)，還進行了姜黃素與多孔淀粉(質(zhì)量配比同上)的物理混合物在磷酸緩沖溶液的體外釋放研究。圖10為體外釋放曲線，通過觀察可以發(fā)現(xiàn)與物理混合物和姜黃素相比，多孔淀粉微球的姜黃素釋放率顯著提高。模擬胃液的釋放率如圖10-a所示，在2.5 h內(nèi)，物理混合物的釋放率比姜黃素提高了2.10%，然而負載姜黃素的多孔淀粉微球比純姜黃素提高了16.10%。

模擬腸液的釋放率如圖10-b所示，在4.5 h內(nèi)，物理混合物的釋放率比純姜黃素提高了1.90%，然而負載姜黃素的多孔淀粉微球比姜黃素提高了17.00%。這些結(jié)果表明：將姜黃素包裹在多孔淀粉中可以提高姜黃素在腸道中的釋放率。這可能跟多孔淀粉的親水性相關[21]，通常親水性輔料會提高藥物的溶解度，這里姜黃素溶解到有機溶劑后與多孔淀粉混合，可以防止姜黃素聚集，增加姜黃素的潤濕性，進而提高姜黃素的溶出。而物理混合物中，姜黃素沒有經(jīng)過溶解重構(gòu)過程，僅與多孔淀粉混合。

a-模擬胃液；b-模擬腸液圖10 負載姜黃素的多孔淀粉微球的體外釋放曲線模擬胃液，模擬腸液Fig.10 In vitro cumulative drug release of curcumin loaded porous starch microspheres under stimulated gastric and intestinal

3 結(jié)論

本文制備了負載姜黃素的多孔淀粉微球，表征結(jié)果表明，多孔淀粉作為載體可明顯提高姜黃素的溶出速率；其中姜黃素與多孔淀粉的質(zhì)量比為1∶2.50時，姜黃素體外釋放率達到最大；姜黃素使多孔淀粉的孔徑變小、比表面積減??；姜黃素吸附進入多孔淀粉的孔隙結(jié)構(gòu)，但是在孔隙內(nèi)部受到納米孔道的約束，姜黃素沒按晶型結(jié)構(gòu)有序排列，而大多呈無定型態(tài)或極細小的微晶態(tài)分布。這為提高難溶性姜黃素的生物利用度提供新的研究方法，也為拓寬多孔淀粉在食品領域的研究提供思路。