王楠，楊敏，鄭杰，秦娟娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

原花青素(proanthocyanidins，PCs)是一類廣泛存在于植物中的天然多酚類化合物，分子結(jié)構(gòu)中含多個(gè)酚羥基，具有廣泛的藥理學(xué)活性，如抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病等。而且，PCs成本低、安全性高，在醫(yī)藥、食品等方面具有較高的利用價(jià)值。然而，PCs穩(wěn)定性較差，在加工過程中易受到光照、溫度、pH、氧化劑、金屬離子等因素影響。因此，提高PCs穩(wěn)定性是亟待解決的關(guān)鍵問題。目前，提高PCs穩(wěn)定性的方法主要有化學(xué)法和物理法，其中化學(xué)法存在潛在的安全問題，物理方法更為常用。物理方法主要是通過加入保護(hù)氣、輔色素、與生物大分子形成復(fù)合物等，以提高PCs的穩(wěn)定性[1]。

生物大分子負(fù)載提升PCs穩(wěn)定性是基于PCs和大分子間以氫鍵、疏水作用、靜電作用等次級鍵結(jié)合，既不會(huì)影響PCs天然結(jié)構(gòu)，又不會(huì)產(chǎn)生新的物質(zhì)，安全性高，是提高PCs穩(wěn)定性的主要手段。蛋白質(zhì)、糖類、脂類等生物大分子是負(fù)載PCs的主要基質(zhì)，負(fù)載后PCs穩(wěn)定性提升顯著，如β-環(huán)糊精添加量為2 500 mg/L時(shí)，可顯著提高紫薯花色苷的貯存穩(wěn)定性[2]；葡萄籽花色苷與磺基丁基醚-β-環(huán)糊精形成的包合物不僅提高了花色苷的溶解度和穩(wěn)定性，而且保留了花色苷的抗糖尿病作用[3]。

蛋白質(zhì)來源廣泛，價(jià)格低廉，不僅生物相容性好，而且營養(yǎng)價(jià)值高，是活性小分子主要載體；其中乳蛋白因其制備工藝簡單、成本低廉而成為蛋白質(zhì)中的首選基質(zhì)。乳蛋白主要由乳清蛋白和酪蛋白組成，有文獻(xiàn)指出，乳清蛋白-PCs復(fù)合物的熱穩(wěn)定性大于游離PCs的熱穩(wěn)定性[4]。乳清蛋白和酪蛋白在熱、氧化和光照條件下能使PCs的降解量減少，對其穩(wěn)定性有較好的改善作用[5]；α-酪蛋白和β-酪蛋白均能提高藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性，并保護(hù)其抗氧化能力[6]。由此可見，利用乳蛋白負(fù)載可提升PCs的穩(wěn)定性。

乳中，酪蛋白占總蛋白的80%，由4種不同類型的酪蛋白(αs1，αs2，β和κ，質(zhì)量比例約為4∶1∶4∶1)組成，這些酪蛋白與磷酸鈣自組裝成一種納米級復(fù)合物，稱為酪蛋白膠束(micellar casein，MC)，其結(jié)構(gòu)特殊，具有疏水內(nèi)部和親水表面[7]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，MC對活性小分子具有較高的結(jié)合能力，如在37 ℃條件下，MC與大黃素、咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的結(jié)合常數(shù)分別為5.470×104、8.12×104和8.93×106[8-9]，有利于提高疏水分子的溶解性和生物利用度。然而，MC對PCs穩(wěn)定性影響研究報(bào)道較少。

本文以MC為基質(zhì)，以PCs為配體，制備PCs-MC復(fù)合物，利用紫外-可見光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)、X-射線衍射(diffraction of x-rays，XRD)、粒徑和Zeta電位等表征復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并分析熱處理、超聲處理、添加H2O2和金屬離子對PCs-MC復(fù)合物中PCs穩(wěn)定性的影響規(guī)律及作用機(jī)制，為PCs穩(wěn)定性提升提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCs，上海麥克林生化科技有限公司；FeCl3、ZnCl2，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；香草醛，蘭州嘉特星工貿(mào)有限公司；其他試劑均為分析純。

新鮮牛乳購自蘭州天天鮮乳制品有限責(zé)任公司，離心脫脂(4 000×g，30 min)，過100 kDa有機(jī)膜，濃縮液冷凍干燥制得膠束酪蛋白，4 ℃冷藏備用[9]。

1.2 儀器與設(shè)備

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)，日本日立儀器有限責(zé)任公司；Nicolet iS50 FTIR光譜儀，美國賽默飛世爾科學(xué)公司；HX-T渦旋混合器，中國金壇百塔鑫寶儀器有限公司；XD3 X射線多晶衍射儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；STA 449 F5 TG-DSC熱分析儀，德國耐馳儀器制造有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV-1780雙光束紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器有限公司；BT-Zeta100 Zeta電位/納米粒度/分子量分析儀，丹東百特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCs-MC復(fù)合物制備

用0.05 mol/L pH 6.86磷酸鹽緩沖液溶解MC，獲得3 g/L MC溶液。將適量PCs用二甲基亞砜助溶后置于0.05 mol/L pH 6.86磷酸鹽緩沖液中，渦旋振蕩使其充分溶解，制得濃度分別為2、4、6、8 mmol/L的溶液。上述PCs溶液與MC以體積比1∶1混合，37 ℃水浴中磁力攪拌加熱20 min，制得PCs-MC復(fù)合物，備用。取一部分復(fù)合物溶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得粉末狀復(fù)合物，冷藏備用。

1.3.2 紫外-可見光譜分析

PCs-MC復(fù)合物溶液用0.05 mol/L pH 6.86磷酸鹽緩沖液稀釋30倍，用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，掃描范圍為190～500 nm。

1.3.3 熒光光譜分析

PCs-MC復(fù)合物溶液用0.05 mol/L pH 6.86磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，用熒光分光光度計(jì)測量，測量范圍為290～500 nm，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm。

1.3.4 FTIR分析

參照文獻(xiàn)[10]，將PCs-MC復(fù)合物粉末置于ATR元件，用FTIR儀測量，對酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)含量分析。

1.3.5 XRD 分析

參照QIN等[8]的方法，將PCs-MC復(fù)合物粉末用X射線多晶衍射儀在Cu Kα輻射下進(jìn)行XRD掃描。

1.3.6 粒徑和Zeta電位分析

參照LI等[11]的方法，將PCs-MC復(fù)合物溶液用0.05 mol/L pH 6.86磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，使用BT-Zeta100 粒度儀測定粒徑及電位。

1.3.7 差示掃描量熱法(thermogravimetric analysis-differential scanning calorimetry，TG-DSC)分析

參照QIN等[8]的方法，使用TG-DSC熱分析儀測定PCs-MC復(fù)合物粉末的熱穩(wěn)定性。

1.3.8 PCs穩(wěn)定性分析

1.3.8.1 PCs含量的測定

PCs含量測定參考WEN等[12]報(bào)道的方法，取0.5 mL樣品，加入4.5 mL體積分?jǐn)?shù)2%鹽酸-10 g/L香草醛乙酸溶液中，在37 ℃恒溫水浴鍋中加熱30 min后冷卻至室溫，使用紫外-可見分光光度計(jì)在500 nm處測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

a-PCs;b-PCs-MC圖1 游離PCs和PCs-MC復(fù)合物中PCs的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of free PCs and PCs in PCs-MC complexes

PCs的穩(wěn)定性用保留率表示，計(jì)算如公式(1)所示[12]：

(1)

式中：c0,PCs的初始濃度，mmol/L；ct,t時(shí)刻PCs的濃度，mmol/L。

1.3.8.2 溫度對PCs穩(wěn)定性的影響

將PCs-MC復(fù)合物溶液及相同濃度游離PCs溶液分別置于4 ℃冰箱、37、50和65 ℃水浴中恒溫60 h，每隔12 h取樣測定PCs保留率。

1.3.8.3 金屬離子對PCs穩(wěn)定性的影響

將PCs-MC復(fù)合物溶液及相同濃度游離PCs溶液分別與0.01 mol/L FeCl3和0.01 mol/L ZnCl2溶液以體積比1∶1混合均勻，室溫靜置150 min，每隔30 min取樣測定PCs保留率。

1.3.8.4 H2O2對PCs穩(wěn)定性的影響

在PCs-MC復(fù)合物溶液及相同濃度游離PCs溶液中分別加入一定量H2O2溶液，使其終體積分?jǐn)?shù)為0.006%和0.024%，室溫靜置75 min，每隔15 min取樣測定PCs保留率。

1.3.8.5 超聲處理PCs穩(wěn)定性的影響

將PCs-MC復(fù)合物溶液及相同濃度游離PCs溶液進(jìn)行超聲處理50 min，頻率為20 kHz，振幅為30%，采用間歇超聲模式(工作5 s停1 s)，每隔10 min取樣測定PCs保留率。

1.3.9 PCs降解動(dòng)力學(xué)分析

根據(jù)文獻(xiàn)[13]，采用一級動(dòng)力學(xué)模型分析PCs降解動(dòng)力學(xué)，如公式(2)所示：

lnct=-kt+lnc0

(2)

式中：c0,PCs的初始濃度，mmol/L；ct,t時(shí)刻PCs的濃度，mmol/L；k,降解速率常數(shù)，h-1或min-1；t,時(shí)間，h或min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理并用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用Origin Pro 9.0作圖，用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)間差異顯著分析采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCs-MC復(fù)合物結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 紫外-可見光譜分析

由圖2-a可知，隨著游離PCs濃度的增加， 280 nm處的吸光度逐漸增大。由圖2-b可知，隨著PCs濃度的增加，PCs-MC復(fù)合物在280 nm附近的吸收峰不斷增大，且最大吸收波長從277 nm紅移到280 nm，表明MC二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水氨基酸殘基向親水微環(huán)境轉(zhuǎn)變，證明PCs和MC發(fā)生相互作用，形成了復(fù)合物。另一方面，MC疏水性氨基酸殘基微環(huán)境發(fā)生變化，說明PCs與MC可能以疏水作用結(jié)合。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，隨著花青素濃度的增加，黑豆分離蛋白的吸光度逐漸增加，且最大吸收波長從272 nm紅移到279 nm，與本研究結(jié)果基本一致。

a-游離PCs；b-PCs-MC復(fù)合物圖2 游離PCs和PCs-MC復(fù)合物的紫外光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of PCs and PCs-MC complexes

2.1.2 熒光光譜分析

PCs-MC復(fù)合物的熒光光譜如圖3所示。MC在336.4 nm處有最大熒光值(1 682.6)；隨著PCs濃度的增加，最大熒光強(qiáng)度逐漸降低。當(dāng)PCs 濃度為4 mmol/L時(shí)，復(fù)合物的熒光強(qiáng)度降低到59.0，表明PCs使MC中色氨酸、酪氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生改變，對MC有熒光猝滅作用，再次證實(shí)PCs與MC發(fā)生相互作用，形成PCs-MC復(fù)合物。LI等[15]研究表明，PCs通過靜態(tài)猝滅抑制乳鐵蛋白的固有熒光，乳鐵蛋白和PCs之間主要由疏水作用和氫鍵形成復(fù)合物。MA等[16]發(fā)現(xiàn)，PCs B1、B2、B3和A2可通過靜態(tài)猝滅抑制β-酪蛋白的固有熒光，PCs C1可通過動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅抑制β-酪蛋白的固有熒光，PCs與β-酪蛋白的結(jié)合作用主要是疏水作用、范德華力和氫鍵?？梢?，PCs更易于與蛋白質(zhì)形成疏水作用。

圖3 PCs-MC復(fù)合物的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of PCs-MC complexes

2.1.3 FTIR分析

對酰胺I帶進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)含量分析，結(jié)果如圖4-b所示。添加PCs后，MC中β-折疊結(jié)構(gòu)含量顯著降低，轉(zhuǎn)角含量顯著增加(P<0.05)。當(dāng)PCs添加量為1～3 mmol/L時(shí)，各二級結(jié)構(gòu)含量隨PCs濃度增加變化不顯著(P>0.05)。當(dāng)PCs濃度為4 mmol/L時(shí)，復(fù)合物中轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量最高，β-折疊含量最低，且與其他樣品差異顯著(P<0.05)。由此可見，添加PCs后，MC二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這與紫外-可見光譜研究結(jié)果一致(圖2)。

a-FTIR圖；b-二級結(jié)構(gòu)含量圖4 PCs-MC復(fù)合物的FTIR圖和二級結(jié)構(gòu)含量Fig.4 FTIR spectra and secondary structure conctents of PCs-MC complexes注：不同小寫字母表示差異顯著

2.1.4 XRD分析

PCs-MC復(fù)合物的XRD如圖5所示。游離MC和PCs出現(xiàn)較寬的峰，說明二者均呈現(xiàn)無定形結(jié)構(gòu)。PCs-MC復(fù)合物在32°處出現(xiàn)一個(gè)新的晶體衍射峰，表明PCs與MC形成復(fù)合物。SHADDEL等[18]研究發(fā)現(xiàn)，加入花青素后，以明膠和阿拉伯膠為基質(zhì)的微膠囊晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成明顯的晶體衍射峰，與本研究結(jié)果一致。

圖5 PCs-MC復(fù)合物XRD圖Fig.5 XRD patterns of PCs-MC complexes

2.1.5 粒徑及電位分析

由圖6-a可知，隨著PCs濃度的增大，游離PCs和PCs-MC復(fù)合物粒徑都逐漸增大，且PCs-MC復(fù)合物粒徑小于游離PCs粒徑。由于PCs為聚合物，在水中溶解度不高，多形成團(tuán)聚體，因此粒徑較大。將PCs添加到MC溶液中后，PCs與MC以物理相互作用結(jié)合，有效改善了PCs的團(tuán)聚，使其分散為小分子，因此復(fù)合物粒徑顯著小于游離PCs(P<0.05)。由于MC為近球形粒子，PCs結(jié)合于其表面，因此隨著PCs結(jié)合量的增加，復(fù)合物粒徑略有增大。YAN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與樟仁分離蛋白相比，樟仁分離蛋白-酚復(fù)合物的粒徑更大，表明蛋白質(zhì)-酚復(fù)合物的形成，與本文研究結(jié)果一致。

a-粒徑；b-Zeta電位圖6 PCs-MC復(fù)合物的粒徑和Zeta電位Fig.6 Particle size and Zeta-potential of PCs-MC complexes注：圖中不同小寫字母表示PCs-MC樣品間差異顯著；不同大寫字母表示PCs樣品間差異顯著(下同)

由圖6-b可知，在pH 6.86的緩沖體系中，PCs帶負(fù)電荷，1 mmol/L時(shí)電位值為-8.8 mV。相同體系中，MC帶負(fù)電荷，電位值為-18.0 mV。隨著PCs濃度的增大，PCs-MC復(fù)合物的負(fù)電量有所增加，表明PCs改變了MC二級結(jié)構(gòu)，形成PCs-MC復(fù)合物，且PCs-MC復(fù)合物粒子間靜電斥力增強(qiáng)，與紅外光譜分析結(jié)果一致(圖4)。LI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兒茶素濃度增加到1.5 g/L時(shí)，復(fù)合物的電位值增大了1倍多。

2.1.6 TG-DSC分析

由圖7-a中可知，在80 ℃左右出現(xiàn)吸熱峰，是由于水分蒸發(fā)所致。PCs-MC復(fù)合物在350 ℃附近出現(xiàn)較大放熱峰，為復(fù)合物熱分解所致，與文獻(xiàn)[18]的研究結(jié)果一致。

由圖7-b可知，PCs和MC第一次失重在80 ℃附近，為水分蒸發(fā)所致；第二次失重在275～350 ℃，表明大分子熱分解。PCs-MC復(fù)合物在該階段的質(zhì)量損失低于MC，且損失率隨著PCs含量的增加而降低，說明復(fù)合物之間形成了相互作用，減緩了MC的熱分解?？梢姡琍Cs-MC復(fù)合物的熱穩(wěn)定性高于游離MC和PCs。有研究指出，微膠囊化的花色苷質(zhì)量損失更加緩慢，卡拉膠對花色苷的降解起到保護(hù)作用，與本文研究結(jié)果相似[20]。

a-DSC；b-TG圖7 PCs-MC復(fù)合物的DSC和TG曲線Fig.7 DSC and TG curves of PCs-MC complexes

2.2 溫度對PCs-MC復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

2.2.1 不同溫度下PCs保留率分析

不同溫度處理下的PCs保留率如圖8所示。

a-4 ℃；b-37 ℃；c-50 ℃；d-65 ℃圖8 不同溫度處理下PCs保留率Fig.8 Retention rate of PCs with different heat treatment

由圖8-a可知，4 ℃貯藏時(shí)，復(fù)合物中PCs保留率低于游離PCs，這可能是由于低溫下酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分β-酪蛋白析出，PCs可能進(jìn)入酪蛋白膠束內(nèi)部，從而難以檢測到[21]。另一方面，復(fù)合物中PCs濃度越大，其保留率越大，這可能是因?yàn)镻Cs之間形成π-π堆積等作用，進(jìn)而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提升[22]。由圖8-b～圖8-d可知，37、50和65 ℃處理時(shí)，MC對PCs均起到保護(hù)作用，復(fù)合物中PCs降解率明顯低于游離PCs，與QUAN等[2]的研究結(jié)果一致。由于PCs分子以特定基團(tuán)與MC形成物理相互作用，使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提升，在外界環(huán)境影響下降解減緩，從而提高了PCs的保留率。就游離PCs而言，濃度為1 mmol/L時(shí)PCs保留率最低，可見PCs分子之間的相互作用也有利于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但這種作用弱于MC與PCs之間的相互作用。與其他溫度相比，隨著貯藏時(shí)間的延長，4 ℃下游離PCs和復(fù)合物中PCs保留率最高且變化緩慢，可見低溫貯藏有利于保持PCs的穩(wěn)定性。

有文獻(xiàn)指出，β-環(huán)糊精與花青素之間的相互作用會(huì)促進(jìn)花青素的降解[23]，與本文研究結(jié)果不同，可能是由于原料間的相互作用機(jī)理不同所導(dǎo)致。綜上所述，MC與PCs結(jié)合有利于改善PCs在中高溫環(huán)境下的穩(wěn)定性。

不同溫度下PCs一級降解動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果如表1所示。不同溫度處理下，游離PCs和復(fù)合物中的PCs降解均符合一級降解動(dòng)力學(xué)，擬合度較高，與WANG等[17]報(bào)道一致。

表1 不同影響因素下PCs的一級降解速率常數(shù)(k)和相關(guān)系數(shù)(R2)Table 1 Degradation rate constants (k) and correlation coefficients (R2) of PCs under different treatment

2.2.2 PCs-MC復(fù)合物粒徑和電位分析

為了進(jìn)一步解釋MC對PCs穩(wěn)定性的保護(hù)作用，選取50 ℃下不同貯藏期的PCs-MC復(fù)合物為樣品，進(jìn)行粒徑和電位分析，結(jié)果如圖9所示。由圖9-a可知，隨著熱處理時(shí)間的延長，游離PCs粒徑減??；且濃度越小，粒徑降低幅度越大，說明PCs對溫度敏感，在熱處理下發(fā)生降解。就PCs-MC復(fù)合物而言，其粒徑隨熱處理時(shí)間延長雖呈現(xiàn)出增大趨勢，但增大幅度較小。電位方面，PCs-MC復(fù)合物電荷為-20 mV左右，是較為穩(wěn)定的體系。隨著熱處理時(shí)間的延長，游離PCs降解后，負(fù)電荷增加，而復(fù)合物的電荷變化規(guī)律性不強(qiáng)，整體變化程度較小。由此可見，MC與PCs的相互作用有效緩解了PCs的熱降解。

a-PCs-MC復(fù)合物粒徑；b-PCs-MC復(fù)合物Zeta電位圖9 50 ℃處理下PCs-MC復(fù)合物的粒徑和Zeta電位Fig.9 Particle size and Zeta-potential of PCs-MC complexes at 50 ℃

2.3 Fe3+和Zn2+對PCs-MC復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

2.3.1 PCs保留率分析

Fe3+和Zn2+處理下PCs保留率如圖10所示。由圖10-a可知，加入Fe3+后，游離PCs保留率高于復(fù)合物中PCs保留率，且PCs濃度越小，復(fù)合物中PCs保留率越低，如1 mmol/L時(shí)游離PCs和復(fù)合物中PCs保留率最低，加入Fe3+150 min后，游離PCs保留率為48.8%，而復(fù)合物中PCs保留率為37.1%。由圖10-b可知，加入Zn2+150 min后，濃度為1 mmol/L的游離PCs和復(fù)合物中PCs保留率分別為76.2%、68.8%，其變化趨勢與Fe3+的影響一致，均表現(xiàn)為MC促進(jìn)了PCs的降解，與RATANAPOOMPINYO等[24]的研究報(bào)道一致。文獻(xiàn)報(bào)道指出，金屬離子可以與PCs形成螯合物，從而增加其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[24]。與MC非共價(jià)結(jié)合后，降低了PCs與金屬離子的螯合能力，因此降低了其穩(wěn)定性。PATRAS等[25]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+提高了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在60 ℃加熱80 min的穩(wěn)定性。另外，由表1可以看出PCs在Fe3+和Zn2+存在時(shí)的降解動(dòng)力學(xué)符合一級反應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在Fe3+存在下的一級降解速率常數(shù)為0.001 53(min-1)，與本文研究結(jié)果相似[24]。

a-Fe3+對PCs保留率的影響；b-Zn2+對PCs保留率的影響圖10 Fe3+和Zn2+對PCs保留率的影響Fig.10 Effect of Fe3+ and Zn2+ on the retention rate of PCs

2.3.2 Fe3+對PCs-MC復(fù)合物粒徑和電位的影響

由圖11-a可知，加入Fe3+后，游離PCs粒徑迅速降低，可能是由于Fe3+與PCs螯合后結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子結(jié)構(gòu)更緊湊所致。然而，PCs-MC復(fù)合物在Fe3+作用下粒徑迅速增大，且隨著時(shí)間的延長粒徑越大，這可能是由于Fe3+與MC上特定的氨基酸殘基或結(jié)合于MC上的PCs產(chǎn)生了螯合作用，將MC交聯(lián)起來，形成更大的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)。

由圖11-b可知，加入Fe3+后，游離PCs體系電荷由負(fù)電變成正電，說明其與PCs產(chǎn)生了螯合作用；而PCs-MC復(fù)合物體系依然為負(fù)電體系，且?guī)щ娏侩S著時(shí)間的延長逐漸降低，說明MC間可能發(fā)生了交聯(lián)。由此可見，MC降低PCs的金屬離子穩(wěn)定性，其本質(zhì)在于阻礙了PCs與金屬離子的螯合作用，而該作用有利于穩(wěn)定PCs的醌式堿結(jié)構(gòu)不受親核試劑攻擊[25]。雖然MC與PCs的疏水作用也有利于提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但該作用效果弱于螯合作用。

a-Fe3+處理下PCs-MC復(fù)合物粒徑；b-Fe3+處理下PCs-MC復(fù)合物Zeta電位圖11 Fe3+處理下PCs-MC復(fù)合物的粒徑和Zeta電位Fig.11 Particle size and Zeta-potential of PCs-MC complexes with Fe3+

2.4 H2O2對PCs-MC復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

2.4.1 不同H2O2濃度下PCs保留率分析

如圖12所示，加入H2O2后，2種樣品中PCs保留率都隨時(shí)間的延長而降低，說明H2O2使PCs逐漸降解。

a-0.006% H2O2處理；b-0.024% H2O2處理圖12 不同濃度H2O2處理對PCs保留率的影響Fig.12 Retention rate of PCs with different concentrations of H2O2

另外，隨著H2O2濃度的增大，PCs保留率減小。與游離PCs相比，相同條件下復(fù)合物中PCs保留率均較高。MC與PCs的非共價(jià)結(jié)合，保護(hù)了PCs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，使其難以被氧化；而且，MC與 PCs結(jié)合后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能將PCs包埋在肽鏈內(nèi)部，使其不易與氧化劑接觸，從而提高了穩(wěn)定性。由此可見，MC對PCs在H2O2下的氧化降解有明顯的抑制作用，與HE等[5]的研究報(bào)道一致。

同一濃度H2O2處理下，不同濃度樣品中PCs保留率不同。其中，濃度為1 mmol/L時(shí)，H2O2處理后復(fù)合物中PCs保留率最高，濃度為2 mmol/L時(shí)PCs保留率最低，這可能是由于不同PCs濃度下，添加H2O2引起MC結(jié)構(gòu)變化程度不同所致。當(dāng)PCs濃度較低時(shí)，MC結(jié)構(gòu)變化有利于將其包裹在分子內(nèi)或分子間，從而提高其穩(wěn)定性。H2O2存在下，PCs的降解符合一級降解動(dòng)力學(xué)(表1)。有研究發(fā)現(xiàn)[26]，在H2O2處理?xiàng)l件下，藍(lán)莓花色苷降解符合一級動(dòng)力學(xué)方程，0.0%～2.0% H2O2條件下花色苷降解速率k為0.000 4～0.057 4 min-1，與本文研究相似。

2.4.2 H2O2對PCs-MC復(fù)合物粒徑和電位的影響

由圖13-a可知，加入H2O2后，雖然游離PCs粒徑隨時(shí)間延長呈減小趨勢，但粒徑較大，說明PCs 在氧化劑作用下團(tuán)聚現(xiàn)象嚴(yán)重，可能是PCs氧化聚集。PCs-MC復(fù)合物粒徑隨時(shí)間變化不大，說明體系基本沒有發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，證實(shí)體系較為穩(wěn)定。由圖13-b可知，加入H2O2后，游離PCs和PCs-MC復(fù)合物的電位變化不大。

a-0.024% H2O2處理下PCs-MC復(fù)合物粒徑；b-0.024% H2O2處理下PCs-MC復(fù)合物Zeta電位圖圖13 0.024% H2O2處理下PCs-MC復(fù)合物粒徑和Zeta電位Fig.13 Particle size and Zeta-potential of PCs-MC complexes with 0.024% H2O2

2.5 超聲處理對PCs-MC復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

2.5.1 PCs保留率分析

由圖14可知，超聲處理下，MC促進(jìn)了PCs的降解，這可能是由于超聲處理不僅削弱了PCs與MC的相互作用，而且破壞了PCs分子間作用，使其穩(wěn)定性降低。由表1可以看出，超聲處理下PCs的降解符合一級降解動(dòng)力學(xué)。

圖14 超聲處理對PCs保留率的影響Fig.14 Retention rate of PCs-MC complexes during ultrasound treatment

2.5.2 超聲處理對PCs-MC復(fù)合物粒徑和電位的影響

從圖15-a可以看出，游離PCs在超聲10 min時(shí)粒徑明顯減小(P<0.05)，但隨著超聲時(shí)間的延長粒徑逐漸增大，可能是短時(shí)間超聲促進(jìn)了PCs的溶解，而長時(shí)間超聲使其聚集。就PCs-MC復(fù)合物而言，超聲處理對其粒徑影響不大。由圖15-b可知，超聲處理對游離PCs和PCs-MC復(fù)合物的電位影響不大。可見，超聲處理主要通過改變PCs分子間及PCs與MC之間的相互作用，從而影響PCs的穩(wěn)定性。

a-超聲處理下PCs-MC復(fù)合物粒徑；b-超聲處理下PCs-MC復(fù)合物Zeta電位圖15 超聲處理時(shí)不同濃度PCs-MC復(fù)合物的粒徑和Zeta電位Fig.15 Particle size and Zeta-potential of PCs-MC complexes during ultrasound treatment

3 結(jié)論

以MC為載體，制備PCs-MC復(fù)合物，發(fā)現(xiàn) PCs對MC有顯著的熒光猝滅作用，且改變了MC的二級結(jié)構(gòu)。XRD和FTIR光譜證實(shí)，PCs與MC形成復(fù)合物。MC對PCs的熱穩(wěn)定性影響與溫度有關(guān)，其中MC降低了PCs在4 ℃時(shí)的穩(wěn)定性，而提高了其在37、50、65 ℃時(shí)的保留率。另外，MC改善了PCs在H2O2作用下的穩(wěn)定性。但是，在Fe3+、Zn2+作用下和超聲處理時(shí)，PCs-MC復(fù)合物中PCs保留率低于游離PCs，可見MC促進(jìn)了PCs的降解。綜上所述，MC對PCs的穩(wěn)定性影響與處理?xiàng)l件有關(guān)。