孟少華，馬相杰，趙建生，卜曉彤，李鑫，袁靜瑤，楊鈺菲，鄒神中，傅禮瑋，曾茂茂，陳潔

1(河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司，河南 漯河，462000)2(河南省肉品技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司，河南 漯河，462000) 3(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 4(江南大學(xué) 國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫，214122)

乳液凝膠，是一種同時(shí)具有乳液結(jié)構(gòu)和凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的軟固體材料，具有獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以將乳化油滴固定在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中[1-2]。許多食品體系如豆腐、肉制品、奶酪和酸奶等都可以歸類于乳液凝膠，乳液凝膠在食品加工中得到了廣泛的應(yīng)用。蛋白質(zhì)是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還具有多種功能特性，如凝膠性和乳化性，因此在乳液及凝膠體系中被廣泛研究。隨著消費(fèi)者對(duì)健康、可持續(xù)生產(chǎn)越來越重視，植物蛋白在近年來成為研究的熱點(diǎn)。并且，目前許多研究都強(qiáng)調(diào)了飲食中增加豆類的積極影響[3-5]。

為了獲得具有更好性能的凝膠產(chǎn)品，采用微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TGase)交聯(lián)是一種有效且綠色的蛋白質(zhì)凝膠改善方法[6-7]。TGase可以催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基和賴氨酸殘基的ε-氨基之間的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而導(dǎo)致分子間或分子內(nèi)交聯(lián)[8]。TGase誘導(dǎo)的蛋白凝膠性質(zhì)受大豆品種、蛋白質(zhì)組成、鹽濃度和熱處理的影響[9-11]。其中大豆蛋白質(zhì)的熱變性是重要影響因素，熱處理可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，改變其功能特性，通過預(yù)熱獲得的蛋白質(zhì)聚集體具有更高的持水能力[12]。WANG等[13]發(fā)現(xiàn)較大的大豆分離蛋白(soybean protein isolate，SPI)聚集體對(duì)凝膠性能有積極作用，凝膠彈性模量顯著增加。大豆蛋白的聚集狀態(tài)可能是影響蛋白凝膠系統(tǒng)性能的重要因素。然而，在商品化SPI生產(chǎn)過程中，不可避免地會(huì)發(fā)生一定程度的熱變性和聚集[14]。因此，對(duì)于實(shí)際加工和應(yīng)用來說，了解大豆蛋白聚集體對(duì)TGase交聯(lián)乳液凝膠性能的影響是必要的。然而，TGase誘導(dǎo)大豆蛋白交聯(lián)的研究主要集中在天然蛋白上，熱誘導(dǎo)的大豆蛋白聚集體對(duì)TGase交聯(lián)乳液凝膠的影響尚未見報(bào)道。

為了解不同SPI聚集體的乳化性質(zhì)以及對(duì)后續(xù)TGase交聯(lián)凝膠行為的影響，本文考察了不同熱變性程度的SPI對(duì)TGase交聯(lián)形成的蛋白乳液凝膠性質(zhì)的影響。此外，從不同蛋白含量及油含量的角度，探討其與TGase交聯(lián)的乳液凝膠的各種性質(zhì)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

臺(tái)灣292大豆，黑龍江慶美種業(yè)有限公司；TGase(酶活力90 U/g)，購于江蘇泰興市東圣生物科技有限公司；大豆油，上海益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；無水乙醇、正己烷、鹽酸、NaOH(均為分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

9FZ-15B粉碎機(jī)，臺(tái)州余國電器有限公司；DELTA320 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GL-10MD冷凍離心機(jī)，湖南湘儀儀器公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；ZPH-300相稱顯微鏡，上海宙山精密光學(xué)儀器有限公司；HAAKE MARSⅢ流變儀，德國Thermo Scientific公司；Ultra-Turrax T18 basic高速均質(zhì)器，德國IKA公司；LUMiSizer651全功能穩(wěn)定性分析儀，德國LUM公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同熱處理的SPI聚集體的制備

大豆經(jīng)過去皮、粉碎、脫脂處理后，將脫酯豆粉與水按照料液比1∶10 (g∶mL)混合，隨后用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，在室溫條件下攪拌1.5 h。將分散體系進(jìn)行離心(6 500 r/min，25 min，4 ℃)以分離出上清液。通過滴加2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5，在室溫條件下攪拌1 h后通過離心(3 500 r/min，15 min，4 ℃)分離出沉淀。將沉淀與水以料液比1∶6 (g∶mL)進(jìn)行復(fù)溶并調(diào)節(jié)pH至7.0，冷凍干燥，得到天然SPI(蛋白得率64.9%，蛋白含量85.5%，水分3.5%，脂肪0.3%，灰分4.6%)，將樣品研磨成粉末并真空包裝，置于-80 ℃冰箱存放。

將天然SPI溶液(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.1%)在不同溫度下(65、85、95 ℃)水浴加熱10 min，收集不同熱變性程度的蛋白質(zhì)聚集體及未加熱的天然蛋白進(jìn)行冷凍干燥，將其分別命名為65 ℃-SPI、85 ℃-SPI、95 ℃-SPI、Native-SPI。

1.3.2 蛋白乳液的制備

1.3.2.1 不同熱處理SPI制備的乳液

將15% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))不同溫度熱處理的SPI樣品充分溶解，SPI溶液與大豆油以質(zhì)量比4∶1混合，并使用高速均質(zhì)器在13 500 r/min下均質(zhì)5 min，從而得到蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的蛋白乳液。

1.3.2.2 不同蛋白濃度制備的乳液

將95 ℃-SPI樣品按照10%、12.5%、15% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別進(jìn)行充分溶解，將SPI溶液與大豆油以質(zhì)量比4∶1混合，并使用高速均質(zhì)器在13 500 r/min下均質(zhì)5 min，從而得到蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、10%、12%的蛋白乳液。

1.3.2.3 不同油濃度制備的SPI乳液

將95 ℃-SPI樣品按照12.6%、13.3%、14.1%、15% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行充分溶解，將SPI溶液與大豆油以19∶1、9∶1、17∶3、4∶1(質(zhì)量比)的比例混合，并使用高速均質(zhì)器在13 500 r/min下均質(zhì)5 min，從而得到油質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%的蛋白乳液，不同油濃度乳液的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

1.3.3 蛋白乳液凝膠的制備

將配制好的乳液，在4 ℃下保藏30 min，添加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按照蛋白干基質(zhì)量計(jì))的TGase，攪拌均勻，在50 ℃下培養(yǎng)1 h，隨后在75 ℃下加熱15 min以達(dá)到滅酶的目的，滅酶結(jié)束后立即冰浴冷卻，4 ℃冷藏過夜后脫模，以用于后續(xù)分析表征。

1.3.4 乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化穩(wěn)定性(end system identifier，ESI)的測(cè)定

將不同熱處理的大豆蛋白溶液(10 g/L)與大豆油以4∶1的體積比混合，然后使用高速均質(zhì)機(jī)在10 000 r/min下均質(zhì)2 min。取出20 μL乳液加入到5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液中振蕩均勻，隨后立即用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在500 nm處的吸光度A0。將上述制備的乳液在室溫下保持30 min后，如上述方法，在500 nm處測(cè)定吸光度A30，取SDS溶液作為空白對(duì)照。EAI和ESI按公式(1)、(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：T，濁度，為2.303；N，稀釋倍數(shù)，為250；c，蛋白濃度；θ，油的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.5 乳液穩(wěn)定性的測(cè)定

通過穩(wěn)定性分析儀表征不同溫度熱變性SPI制備蛋白乳液的穩(wěn)定性，參照CAI等[15]的方法，并稍作修改，離心轉(zhuǎn)速設(shè)定為4 000 r/min，輪廓線560張，截圖時(shí)間間隔為15 s，光因子設(shè)定為1.0，測(cè)試溫度25 ℃，測(cè)試光源470 nm，測(cè)試總時(shí)長140 min。通過儀器自帶軟件對(duì)澄清指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 乳液凝膠質(zhì)構(gòu)性能的測(cè)定

利用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定乳液凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，樣品的直徑為29 mm，高度為30 mm。所用探頭為P/50，測(cè)前速度2 mm/s，測(cè)定速度1 mm/s，測(cè)后速度5 mm/s，觸發(fā)力為10 g，測(cè)定距離設(shè)定為凝膠50%應(yīng)變，測(cè)得凝膠的硬度、彈性、咀嚼性等。

1.3.7 蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的表征

取蛋白凝膠中間位置切片，將凝膠片放在載玻片上用光學(xué)顯微鏡放大100倍觀察并拍照。

1.3.8 乳液黏度的測(cè)定

利用流變儀測(cè)定乳液的表觀黏度，在25 ℃下，剪切速率設(shè)置為0.01～100 s-1，間隙為1 mm，35 mm錐板進(jìn)行旋轉(zhuǎn)剪切，對(duì)乳液的表觀黏度進(jìn)行表征。

1.3.9 蛋白乳液凝膠持水性的測(cè)定

參照周士琪[16]的方法稍作修改，將新鮮制備的5 g乳液凝膠樣品4 ℃放置24 h，取出恢復(fù)至室溫，稱質(zhì)量(m1)后放入干燥的離心管中，4 ℃、7 000 r/min離心20 min，將乳液凝膠取出，吸取表面水分后再次稱質(zhì)量(m2)，持水性按公式(3)計(jì)算：

(3)

1.3.10 蛋白乳液凝膠持油性的測(cè)定

參照周士琪[16]的方法并稍作修改，新鮮制備的5 g乳液凝膠樣品4 ℃放置24 h，將乳液凝膠稱質(zhì)量(m1)后放入預(yù)先稱質(zhì)量的離心管(m2)中，再于70 ℃水浴30 min，4 ℃、7 000 r/min離心20 min。離心完成后將乳液凝膠取出，隨后將離心管于65 ℃下烘干至恒重，對(duì)烘干后的離心管進(jìn)行稱質(zhì)量(m3)，離心管增加質(zhì)量即為油脂損失，持油性按公式(4)計(jì)算：

(4)

1.3.11 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Origin 2022軟件進(jìn)行作圖。采用SPSS 19.0分析其顯著性差異以及相關(guān)性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理溫度對(duì)SPI乳化性能的影響

2.1.1 EAI及ESI性能

如圖1所示，經(jīng)過熱變性后有效地改善了SPI的乳化性能。相較于Native-SPI，經(jīng)過熱處理后SPI的EAI和ESI顯著增加。這是由于熱處理誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的去折疊，并使得蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理溫度的增加，SPI的疏水性顯著增加[17-18]。從而改變了蛋白分子表面的親水/親油性，增強(qiáng)其在油/水界面上的吸附能力和乳液的黏度，導(dǎo)致其乳化活性和乳化穩(wěn)定性的增強(qiáng)。GUO等[19]發(fā)現(xiàn)熱處理也會(huì)導(dǎo)致蕓豆蛋白疏水性的增加，其穩(wěn)定乳液的ESI和EAI顯著增加。

a-ESI；b-EAI圖1 經(jīng)不同加熱處理SPI的ESI和EAIFig.1 ESI and EAI of SPI subjected to different heat treatment注：小寫字母不同表示樣品間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 乳液穩(wěn)定性

如圖2所示，在測(cè)量之前，乳液被均勻化，幾乎沒有光線通過樣品。離心后，在離心力的作用下，乳液體系不穩(wěn)定會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀于樣品池底部，導(dǎo)致透光率的降低，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致部分水相的析出，使得樣品池中部區(qū)域透光率增加，而較輕且不太透明的油相會(huì)上升到頂部，形成奶油層。隨著對(duì)SPI熱處理溫度的增加，離心結(jié)束后，最終的樣品輪廓線較初始狀態(tài)呈現(xiàn)越來越小的趨勢(shì)。Native-SPI制備的乳液其穩(wěn)定性輪廓圖變化最為明顯，隨著離心的進(jìn)行，樣品池中的透光率逐漸增大，在測(cè)定結(jié)束后，樣品池中部的透光率均已接近20%，說明乳液中有水相析出，此時(shí)乳液的澄清指數(shù)約為0.164。隨著熱處理溫度的增加，乳液的澄清指數(shù)也顯著降低。當(dāng)熱處理溫度增加到85 ℃時(shí)，乳液在離心測(cè)定結(jié)束后，其穩(wěn)定性輪廓圖幾乎與初始輪廓圖保持一致，尤其是SPI熱處理溫度為95 ℃時(shí)制備的乳液，在經(jīng)過140 min的離心測(cè)試后，輪廓線未發(fā)生任何變化，其澄清指數(shù)降低到0.001。此結(jié)果與圖1所示的結(jié)果一致，熱處理顯著提高了SPI穩(wěn)定乳液的EAI和ESI，由此其穩(wěn)定性也相應(yīng)地增加。

a-Native-SPI輪廓圖；b-60 ℃-SPI輪廓圖；c-85 ℃-SPI輪廓圖；d-95 ℃-SPI輪廓圖；e-澄清指數(shù)圖2 熱處理溫度對(duì)SPI乳液穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of heat treatment temperature on the stability of SPI emulsion

2.2 不同溫度熱處理SPI對(duì)蛋白乳液凝膠性質(zhì)的影響

如圖3-a所示，65 ℃及85 ℃熱處理的SPI乳液凝膠顯示出與Native乳液凝膠相近的凝膠性能，三者的硬度無顯著差異(P>0.05)，這與SPI的熱變性程度密切相關(guān)，SPI主要由大豆球蛋白(11S)和β-伴球蛋白(7S)組成。郭鳳仙等[20]研究發(fā)現(xiàn)7S組分的變性溫度為74.2 ℃，而11S組分的變性溫度則為90 ℃，在65 ℃處理?xiàng)l件下，此時(shí)僅有7S組分發(fā)生部分變性，因此凝膠性與Native樣品相近。先前的研究表明，隨著大豆蛋白熱處理溫度的增加，形成的熱聚集體粒徑也相應(yīng)增加，但當(dāng)大豆蛋白接近完全變性后，平均粒徑反而由于高溫?zé)崽幚韺?dǎo)致大粒徑聚集體熱解聚，從而使得粒徑呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)[21-23]。因此，當(dāng)溫度升高到85 ℃時(shí)，凝膠性沒有顯著增加的原因可能是由于在以TGase誘導(dǎo)SPI交聯(lián)形成凝膠時(shí)，隨著溫度的升高，蛋白分子發(fā)生疏水性聚集，從而導(dǎo)致TGase反應(yīng)位點(diǎn)減少。然而，當(dāng)熱處理溫度升高至95 ℃時(shí)，7S、11S組分均完全變性，高溫將導(dǎo)致SPI分子發(fā)生熱解聚，蛋白分子重排和聚集，從而使得更多的TGase反應(yīng)位點(diǎn)被暴露，凝膠強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，其制備的乳液凝膠硬度是Native乳液凝膠的2.2倍。如圖3-b所示，盡管不同樣品間硬度存在很大差異，但凝膠的持水性和持油性均沒有顯著差異(P>0.05)，都表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。

通過圖3-c和圖3-d可以看出，隨著SPI熱處理溫度的升高，乳液凝膠的氣孔也相應(yīng)增加，且氣孔尺寸也呈現(xiàn)增大的狀態(tài)，這種現(xiàn)象是由于乳液黏度的增加所導(dǎo)致的。由不同熱處理溫度的SPI穩(wěn)定的乳液的表觀黏度如圖3-e所示。所有的SPI乳液均呈現(xiàn)剪切變稀的特性，表現(xiàn)出典型的假塑性流體特征。65 ℃熱處理的蛋白乳液表現(xiàn)出與Native蛋白乳液相近的黏度，而隨著熱處理溫度進(jìn)一步增加，乳液的黏度也逐漸增加。前期的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著熱變性溫度的升高，SPI的疏水性也顯著增加[17-18]。因此黏度顯著增加的原因可能是由于蛋白分子間具有更高的聚集度和疏水性，從而增加乳液體系中SPI分子之間的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致乳液呈現(xiàn)更高的表觀黏度。蛋白的表觀黏度隨著疏水性的增加而增加的趨勢(shì)也與ZHENG等[24]的研究結(jié)果一致。

由于95 ℃-SPI制備的乳液凝膠具有最高的凝膠性，因此后續(xù)以其為對(duì)象進(jìn)一步研究蛋白濃度、油濃度對(duì)TGase交聯(lián)的乳液凝膠的影響。

a-凝膠硬度；b-持水/油性；c-宏觀凝膠形態(tài)；d-微觀凝膠形態(tài)；e-表觀黏度圖3 熱處理溫度對(duì)SPI乳液凝膠硬度、持水/油性、宏觀、微觀凝膠形態(tài)及表觀黏度的影響Fig.3 Effect of heat treatment temperature on gel hardness, water/oil holding capacity, macrograph, micrographof SPI emulsion gel, and apparent viscosity of SPI emulsion

2.3 不同蛋白濃度對(duì)SPI乳液凝膠性質(zhì)的影響

圖4-a為蛋白濃度對(duì)SPI乳液凝膠硬度的影響，蛋白濃度對(duì)蛋白質(zhì)凝膠性能至關(guān)重要，凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成是蛋白分子間作用、分子和溶劑相互作用以及鄰近肽鏈之間的相互吸引和相互排斥平衡后的結(jié)果[25]。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?%時(shí)，乳液凝膠的硬度僅為861.4 g。這是由于當(dāng)?shù)鞍诐舛容^低時(shí)，SPI分子-溶劑之間作用處于優(yōu)勢(shì)地位，致使蛋白乳液形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)弱。隨著SPI濃度的增加，乳液凝膠的硬度呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)?shù)鞍诐舛壬咧?2%時(shí)，此時(shí)的凝膠硬度是蛋白濃度為8%樣品的3.3倍，此時(shí)蛋白分子間的相互作用占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，蛋白與蛋白分子之間的相互作用也顯著增強(qiáng)，凝膠強(qiáng)度也相應(yīng)的增加。通過圖4-b和圖4-c可以觀察到，蛋白濃度從8%增加到12%，均能制備出硬挺、均勻的乳液凝膠。但隨著濃度的增大，凝膠形成的氣孔也由小變大。從圖4-d可以看出在不同蛋白濃度下(8%～12%)，SPI乳液凝膠均具有優(yōu)異的持水性和持油性，說明凝膠具有緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

a-凝膠硬度；b-宏觀形態(tài)；c-微觀形態(tài)；d-持水/油性圖4 SPI濃度對(duì)蛋白乳液凝膠硬度、宏觀形態(tài)、微觀形態(tài)和持水/油性的影響Fig.4 Effect of SPI concentration on the gel hardness, macrograph, micrograph, and water/oil holding capacity of SPI emulsion gel

2.4 不同油濃度對(duì)SPI乳液凝膠性質(zhì)的影響

圖5-a探究了不同油濃度對(duì)乳液凝膠硬度的影響，隨著油濃度從5%增加到20%，乳液凝膠的硬度顯著增大(P<0.05)。這是由于隨著油濃度的增加，蛋白在乳液水相的濃度也相應(yīng)增加，因此，SPI蛋白分子分布更緊密，蛋白質(zhì)分子間的相互作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致SPI乳液凝膠的凝膠性能改善。通過圖5-b和圖5-c可以觀察到，油濃度從5%增加到20%所制備的SPI乳液凝膠均具有優(yōu)異的形態(tài)，形狀規(guī)整，不軟塌。但隨著油濃度的增加，凝膠形成的氣孔也由少變多，由小變大。從圖5-d可以看出，在不同油濃度下(5%～20%)，SPI乳液凝膠均具有優(yōu)異的持水性和持油性，說明95 ℃-SPI穩(wěn)定的乳液凝膠具有優(yōu)異的凝膠網(wǎng)絡(luò)，可束縛住乳液凝膠體系中的水相和油相。

a-凝膠強(qiáng)度；b-宏觀形態(tài)；c-微觀形態(tài)；d-持水/油性圖5 油濃度對(duì)蛋白凝膠強(qiáng)度、宏觀形態(tài)、微觀形態(tài)和持水/油性的影響Fig.5 Effect of oil concentration on the gel hardness, macrograph, micrograph, and water/oil holding capacity of SPI emulsion gel

3 結(jié)論

SPI經(jīng)熱處理后，其EAI、ESI和乳液離心穩(wěn)定性均有顯著改善。不同熱處理溫度的SPI樣品經(jīng)TGase誘導(dǎo)形成凝膠后，凝膠強(qiáng)度在95 ℃時(shí)得到顯著改善，其凝膠硬度是天然蛋白乳液凝膠的2.2倍。表明大豆蛋白分子經(jīng)過一定程度的熱處理，逐漸形成聚集體，對(duì)TGase誘導(dǎo)乳液凝膠形成有促進(jìn)作用。且隨著溫度的增加，乳液黏度相應(yīng)增加，凝膠氣孔也相應(yīng)增大。對(duì)于95 ℃熱處理蛋白的凝膠，隨著蛋白濃度的增大，凝膠強(qiáng)度增大；隨著油濃度的增加，凝膠強(qiáng)度顯著增加。所有樣品均具有優(yōu)異的持水性和持油性?？傊?，SPI經(jīng)過一定程度的熱處理(95 ℃)有利于TGase誘導(dǎo)形成蛋白凝膠，這為工業(yè)生產(chǎn)蛋白基乳液凝膠制品提供了一定的理論依據(jù)。