李雪松，陳翔宇，李蒙蒙，徐娟，林麗軍，陸利霞，崔曉文，熊曉輝

(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，南京，211800)

傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法是國(guó)際公認(rèn)的權(quán)威微生物計(jì)數(shù)。但是平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)具有滯后性[1]，其次平板計(jì)數(shù)法僅計(jì)數(shù)可培養(yǎng)的活菌，對(duì)于不可培養(yǎng)的微生物無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)[2]。目前已有許多新型的微生物計(jì)數(shù)方法，如還原顯色法、阻抗法、ATP生物發(fā)光法、熒光儀法、電化學(xué)發(fā)光法等[3-7]。這些方法間接、快速獲知菌體數(shù)量，但極易受環(huán)境及基質(zhì)影響。對(duì)菌體逐個(gè)計(jì)數(shù)的直接計(jì)數(shù)方法更快速、準(zhǔn)確，如流式細(xì)胞儀可對(duì)高速流動(dòng)的微生物個(gè)體逐個(gè)檢測(cè)，且可對(duì)死、活菌分別計(jì)數(shù)[8]。目前流式細(xì)胞儀已經(jīng)應(yīng)用于微生物的檢測(cè)[9-11]，但流式細(xì)胞儀價(jià)格昂貴,檢測(cè)成本高。

基于微生物圖像計(jì)數(shù)的方法是另一種成本更低的直接計(jì)數(shù)方法，其原理是顯微鏡鏡檢技術(shù)，計(jì)數(shù)載體通常為具有固定微體積的計(jì)數(shù)板或具有固定面積的濾膜。而根據(jù)載體的不同，圖像計(jì)數(shù)定量微生物濃度的統(tǒng)計(jì)方法也有所不同。血球計(jì)數(shù)板使用最多，其計(jì)數(shù)室深度為0.1 mm，容積為0.1 μL，可計(jì)數(shù)真菌及一些形態(tài)較大的細(xì)菌[12]。而濾膜法是將試樣中的微生物細(xì)胞過(guò)濾在濾膜上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定面積濾膜上的細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而推算出樣品中微生物的濃度[13-14]。因此在圖像計(jì)數(shù)中，定量結(jié)果都是基于部分體積或面積中細(xì)胞數(shù)量推算的結(jié)果。結(jié)果的準(zhǔn)確推算基于2個(gè)假設(shè)：微生物細(xì)胞的分布是均勻的；對(duì)部分體積或面積中微生物統(tǒng)計(jì)的參數(shù)可以代表總體[15]。然而現(xiàn)有的研究中很少對(duì)以上的假設(shè)進(jìn)行分析和說(shuō)明，且目前圖像計(jì)數(shù)沒(méi)有統(tǒng)一的分析方法。其次，關(guān)于圖像計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)的結(jié)果間的比較未見(jiàn)報(bào)道。

本研究使用具有固定體積的微型計(jì)數(shù)板，將不同濃度的釀酒酵母樣品經(jīng)美蘭染色后加入微型計(jì)數(shù)室中，智能手機(jī)獲取菌體的顯微圖像，并對(duì)圖像中的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。本研究對(duì)圖像計(jì)數(shù)過(guò)程進(jìn)行了廣泛的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并與GB 4789.15—2016中的平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行了對(duì)比，以期為微生物圖像計(jì)數(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC 9080，本實(shí)驗(yàn)室保存；0.01 mol/L PBS(pH 7.45)，0.1%堿性美蘭染色液，上海生物工程有限公司；酵母浸出粉葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。所有的試劑與培養(yǎng)基均用超純水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

自制微型計(jì)數(shù)板，聚甲基丙烯酸甲酯制作，計(jì)數(shù)室規(guī)格24 mm×4.15 mm×0.1 mm；BM1000生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；Redmi k40智能手機(jī)，北京小米科技有限責(zé)任公司；SHP-100智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒酵母菌液的制備

將保存的釀酒酵母接種于YPD培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化2～3次。取37 ℃下培養(yǎng)18 h的菌液1 mL于1.5 mL離心管中1 500 r/min離心5 min，去上清液，菌泥用同體積的無(wú)菌PBS重懸，以10倍稀釋制得不同濃度的樣品液，備用。

1.3.2 釀酒酵母顯微圖像的獲得及菌體計(jì)數(shù)

1.3.2.1 釀酒酵母美蘭染色

取100 μL釀酒酵母懸液，渦旋分散，加入100 μL美蘭染色液，室溫染色3 min，吸取染色后的菌液，加入并充滿微型計(jì)數(shù)室。未染色的為活酵母細(xì)胞，藍(lán)色的為死亡酵母細(xì)胞。

1.3.2.2 釀酒酵母計(jì)數(shù)用顯微圖像獲得

所使用顯微鏡物鏡40倍，目鏡10倍，圖像總放大倍數(shù)為400倍，單個(gè)顯微鏡視野的直徑為0.45 mm。通過(guò)智能手機(jī)獲得顯微鏡圖像，每個(gè)圖像對(duì)應(yīng)一個(gè)完整的視野，用于釀酒酵母圖像計(jì)數(shù)。通過(guò)智能手機(jī)從每個(gè)微型計(jì)數(shù)室獲得均勻分布、不重疊、用于定量計(jì)數(shù)的200個(gè)圖像。

1.3.2.3 圖像中釀酒酵母的計(jì)數(shù)

使用Image J[16]軟件對(duì)獲得的圖像進(jìn)行酵母菌計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)每張圖像中的活菌數(shù)量和死菌數(shù)量，每個(gè)圖像中活菌數(shù)量計(jì)為yi。

1.3.3 釀酒酵母濃度平板計(jì)數(shù)

依據(jù)GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》對(duì)釀酒酵母濃度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.3.4 圖像計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

使用1.3.1制備的不同濃度釀酒酵母樣品，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行13、25、50、100、200個(gè)圖像的采集，并計(jì)數(shù)每個(gè)圖像中釀酒酵母數(shù)量。對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[17]，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.4.1 箱線圖的制作

制作不同圖像中釀酒酵母數(shù)量的箱線圖，圖中大于Q3+1.5IQR和小于Q1-1.5IQR的數(shù)量值判斷為異常值，其中Q1為下四分?jǐn)?shù)，Q3為上分位數(shù)，四分位間距IQR=Q3-Q1。圖像中釀酒酵母數(shù)量平均值的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：n, 計(jì)數(shù)的圖像數(shù)量；yi, 每個(gè)圖像中活菌數(shù)量。

1.3.4.2 統(tǒng)計(jì)參數(shù)的分析

1.3.4.3 圖像計(jì)數(shù)定量樣品中釀酒酵母濃度的計(jì)算

(2)

式中：n,計(jì)數(shù)的圖像數(shù)量；V,單個(gè)圖像體積，0.016 μL；2,樣品加入等體積美蘭染色液的稀釋系數(shù)。

1.3.5 圖像計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)結(jié)果的不確定度

對(duì)于圖像計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)過(guò)程，都是通過(guò)對(duì)不同視野圖像或平行平板重復(fù)計(jì)數(shù)計(jì)算得到最終定量結(jié)果。因此在重復(fù)計(jì)數(shù)過(guò)程中，不同圖像或平板中菌體或菌落數(shù)量的差異性會(huì)造成定量結(jié)果的不確定，根據(jù)JJF1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的規(guī)定計(jì)算不確定度。不確定度也反映了對(duì)應(yīng)分析過(guò)程的誤差水平[18]。

1.3.5.1 圖像計(jì)數(shù)結(jié)果不確定度的計(jì)算

以單個(gè)圖像計(jì)數(shù)定量樣品中釀酒酵母濃度如公式(3)所示：

(3)

基于單個(gè)圖像計(jì)數(shù)定量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度(以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)的計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算如公式(5)所示：

(5)

最終對(duì)樣品的定量結(jié)果是對(duì)n個(gè)圖像計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。因此，最終圖像計(jì)數(shù)定量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(6)計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(7)計(jì)算：

(6)

(7)

根據(jù)不確定度計(jì)算了定量結(jié)果的95%置信區(qū)間，如公式(8)所示：

(8)

式中：t0.025臨界值由自由度為n-1的學(xué)生氏t分布確定。

1.3.5.2 平板計(jì)數(shù)結(jié)果不確定度的計(jì)算

平板計(jì)數(shù)方法按GB 4789.15—2016所規(guī)定的操作執(zhí)行，但對(duì)連續(xù)2個(gè)稀釋梯度，每個(gè)稀釋梯度均傾注了50個(gè)平板。對(duì)100個(gè)平板進(jìn)行釀酒酵母菌落計(jì)數(shù)，每個(gè)平板中菌落數(shù)標(biāo)記為XAi，XBi。

基于單個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度(以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)的計(jì)算如公式(9)(10)所示。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如公式(11)所示：

(9)

(10)

(11)

式中：A,第一稀釋梯度；B,第二稀釋梯度；i,每個(gè)稀釋梯度中的平行平板，i=1，2，3，…50。根據(jù)國(guó)標(biāo)方法的要求，選擇2個(gè)稀釋梯度的菌落數(shù)在10～150個(gè)之間的平板為有效平板，有效平板數(shù)量記為m。Xi,有效平板中的菌落數(shù)，對(duì)于第一稀釋梯度Xi=XAi，對(duì)于第二稀釋梯度Xi=0.1XBi。

在GB 4789.15—2016平板計(jì)數(shù)中連續(xù)2個(gè)稀釋梯度各傾注2塊平板，因此平板計(jì)數(shù)的結(jié)果由4塊平板得出，故n取4。得到平板計(jì)數(shù)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算如公式(12)所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算如公式(13)所示：

(12)

(13)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 22.0軟件和Origin 2018軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度釀酒酵母樣品圖像中菌體數(shù)量分布

選取了105～107CFU/mL濃度范圍內(nèi)的5個(gè)樣品，濃度由高至低標(biāo)記為A～E。各樣品圖像中釀酒酵母的數(shù)量如圖1所示(圖1-a～1-e對(duì)應(yīng)樣品A～E；Ⅰ～Ⅲ表示每一樣品的3次重復(fù)圖像計(jì)數(shù))，箱體線段至上而下依次表示最大值、上四分位數(shù)、中位數(shù)、下四分位數(shù)和最小值，箱體內(nèi)散點(diǎn)為平均數(shù)，箱體外為異常值。由圖1可知，釀酒酵母數(shù)量在不同圖像中存在很大的差異。如樣品A，單個(gè)圖像中釀酒酵母計(jì)數(shù)結(jié)果最多為449個(gè)，最少為151個(gè)。并且樣品濃度為105CFU/mL，不同圖像中釀酒酵母數(shù)量差異更大，如樣品E的圖像中釀酒酵母數(shù)量最多為11個(gè)，單個(gè)圖像中出現(xiàn)無(wú)菌體的現(xiàn)象。每個(gè)樣品中部分組別的箱線圖中可觀察到異常值，如樣品A的重復(fù)2(圖1-a-Ⅱ)，圖像數(shù)量為200時(shí)，存在異常值449、201；樣品B的重復(fù)1(圖1-b-Ⅰ)，圖像數(shù)量為25時(shí)，存在異常值104。表明溶液中細(xì)胞分布不均勻，從而導(dǎo)致定量結(jié)果的不確定。

對(duì)樣品A、B、C不同重復(fù)的箱線圖進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)在不同計(jì)數(shù)圖像數(shù)量時(shí)，平均數(shù)均屬于同一水平，且與中位數(shù)基本重合；隨計(jì)數(shù)圖像數(shù)量的變化，數(shù)據(jù)的分布范圍存在差異，但箱體寬度基本一致，表明數(shù)據(jù)具有相似的集中程度。分析樣品D、E不同重復(fù)的箱線圖，隨著計(jì)數(shù)圖像數(shù)量增加到50個(gè)時(shí)，平均數(shù)逐漸達(dá)到同一水平，并接近于中位數(shù)；此時(shí)箱線圖數(shù)據(jù)的分布范圍與箱體的寬度也趨于一致，表明不同數(shù)據(jù)組之間具有相似的分布特點(diǎn)。對(duì)5個(gè)樣品，3個(gè)重復(fù)，不同計(jì)數(shù)圖像數(shù)量下得到的共75組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)(Shapiro-Wilk Test,P>0.05)，顯示僅有40組數(shù)據(jù)通過(guò)檢驗(yàn)。

在一些基于顯微圖像計(jì)數(shù)的微生物計(jì)數(shù)方法中，一定區(qū)域中微生物的分布常被建模為泊松分布[19]或正態(tài)分布[20]。本研究中基于箱線圖的形狀，在不同的圖像中釀酒酵母的數(shù)量成對(duì)稱分布，不同計(jì)數(shù)圖像數(shù)量的箱線圖也說(shuō)明對(duì)分布方式的準(zhǔn)確判斷需要足夠數(shù)量的圖像。

2.2 計(jì)數(shù)圖像數(shù)量對(duì)釀酒酵母計(jì)數(shù)結(jié)果的影響

2.2.1 計(jì)數(shù)圖像數(shù)量對(duì)釀酒酵母計(jì)數(shù)中位數(shù)的影響

在統(tǒng)計(jì)學(xué)中，中位數(shù)受極端數(shù)據(jù)的影響較小，是反映一組數(shù)據(jù)特征的重要參數(shù)[17]。不同計(jì)數(shù)圖像數(shù)量時(shí)釀酒酵母計(jì)數(shù)的中位數(shù)及變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。對(duì)于106～107CFU/mL濃度的樣品A、B、C，當(dāng)計(jì)數(shù)圖像的數(shù)量由13個(gè)增加至200個(gè)時(shí)，中位數(shù)依次為樣品A(299.50～301.67)，樣品B(69.50～70.67)，樣品C(27.33～28.00)(圖2-a)，且其變化均小于5%，見(jiàn)圖2-b。而對(duì)于105CFU/mL濃度的樣品D、E，隨統(tǒng)計(jì)圖像數(shù)量的增加，釀酒酵母計(jì)數(shù)的中位數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定，當(dāng)數(shù)量達(dá)到50個(gè)以上時(shí),樣品D中位數(shù)趨于7，樣品E中位數(shù)為2；此時(shí)中位數(shù)數(shù)值變化小于10%(圖2-b)。結(jié)果表明，計(jì)數(shù)一定數(shù)量的圖像后，計(jì)數(shù)中位數(shù)可以代表總體的數(shù)量特征，可作為圖像計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析的參數(shù)。釀酒酵母濃度為106～107CFU/mL時(shí)，需計(jì)數(shù)的圖像數(shù)量為13個(gè)；釀酒酵母濃度為105CFU/mL時(shí)，需計(jì)數(shù)的圖像數(shù)量為50個(gè)。

a-3.5×107 CFU/mL；b-7.3×106 CFU/mL；c-3.5×106 CFU/mL；d-7.5×105 CFU/mL，e-2.7×105 CFU/mL圖1 不同統(tǒng)計(jì)圖像數(shù)量中釀酒酵母數(shù)量箱線圖Fig.1 Box diagram of the cell number of S.cerevisiae by different image amounts

a-不同計(jì)數(shù)圖像數(shù)量時(shí)中位數(shù)；b-不同圖像數(shù)量中位數(shù)與200個(gè)圖像計(jì)數(shù)中位數(shù)的百分比圖2 釀酒酵母計(jì)數(shù)中位數(shù)隨計(jì)數(shù)圖像數(shù)量的變化(n=3)Fig.2 Median change of S.cerevisiae by the different image amounts(n=3)

2.2.2 計(jì)數(shù)圖像數(shù)量對(duì)釀酒酵母計(jì)數(shù)平均數(shù)的影響

計(jì)數(shù)不同數(shù)量的圖像后得到的圖像中釀酒酵母數(shù)量的平均數(shù)及百分比變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3。樣品A、B、C圖像計(jì)數(shù)的平均數(shù)均大于20個(gè)(圖3-a)，計(jì)數(shù)平均數(shù)隨圖像數(shù)量變化小于5%(圖3-b)，13個(gè)圖像計(jì)數(shù)平均數(shù)即穩(wěn)定。

a-圖像中釀酒酵母數(shù)量的平均數(shù)；b-不同圖像數(shù)量計(jì)數(shù)平均數(shù)與200個(gè)圖像計(jì)數(shù)平均數(shù)的百分比圖3 釀酒酵母計(jì)數(shù)平均數(shù)隨計(jì)數(shù)圖像數(shù)量的變化(n=3)Fig.3 Average change of S.cerevisiae by the different image amounts(n=3)

對(duì)于樣品D、E，圖像計(jì)數(shù)的平均數(shù)小于10個(gè)，當(dāng)計(jì)數(shù)圖像數(shù)量為13和25時(shí)，釀酒酵母計(jì)數(shù)平均數(shù)差異大；當(dāng)圖像數(shù)量達(dá)到50個(gè)時(shí)，平均數(shù)隨圖像數(shù)量變化小于5%(圖3-b)。分析表明，對(duì)一定數(shù)量的圖像計(jì)數(shù)后得到的計(jì)數(shù)平均數(shù)可反映總體的數(shù)量特征，可作為圖像計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析的參數(shù)。在本研究中，釀酒酵母濃度為106～107CFU/mL時(shí)需統(tǒng)計(jì)圖像數(shù)量至少為13個(gè)，濃度為105CFU/mL時(shí)需統(tǒng)計(jì)圖像數(shù)量至少為50個(gè)，所得平均數(shù)更反映實(shí)際細(xì)胞數(shù)量。

2.2.3 不同圖像間釀酒酵母數(shù)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差隨計(jì)數(shù)圖像數(shù)量的變化

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為反映不同圖像中釀酒酵母數(shù)量的差異性的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)，也用于計(jì)算圖像計(jì)數(shù)結(jié)果的不確定度。如圖4-a，不論計(jì)數(shù)圖像數(shù)量為多少，均存在RSDA

a-不同計(jì)數(shù)圖像數(shù)量時(shí)釀酒酵母數(shù)量的RSD；b-不同圖像數(shù)量下RSD與200個(gè)圖像下所得RSD的百分比圖4 釀酒酵母數(shù)量的RSD隨計(jì)數(shù)圖像數(shù)量的變化(n=3)Fig.4 RSD change of S.cerevisiae by the different image amounts(n=3)

2.3 圖像計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)的對(duì)比

2.3.1 圖像計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)結(jié)果的不確定度

由表1可知，釀酒酵母平板計(jì)數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.099，95%置信區(qū)間下限為26.3，上限為29.4。

表1 平板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results by plate counting

表2 圖像計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical results by image counting

計(jì)數(shù)的視野數(shù)量和視野中目標(biāo)物的數(shù)量決定了計(jì)數(shù)誤差或精密度水平[21]。如在我國(guó)水利部SL 733—2016《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定每個(gè)視野的浮游植物平均數(shù)須對(duì)應(yīng)相應(yīng)的計(jì)數(shù)視野數(shù)。美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)《Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater(22nd)》對(duì)水中藻類的計(jì)數(shù)中要求在濾膜的每個(gè)視野中存在10～20個(gè)自然單位。本研究也證明了增加統(tǒng)計(jì)的圖像數(shù)量可以有效提高圖像計(jì)數(shù)的精確度。而伴隨著數(shù)字圖像處理技術(shù)的廣泛研究與應(yīng)用，對(duì)超大量圖像實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分析變得簡(jiǎn)單[22]。因此圖像計(jì)數(shù)有望得到更精確的定量結(jié)果。其次，本研究中計(jì)算的不確定度僅是指2種計(jì)數(shù)過(guò)程中由于重復(fù)計(jì)數(shù)所帶來(lái)的不確定度，而并非總的不確定度。但研究表明，重復(fù)的平板計(jì)數(shù)給計(jì)數(shù)結(jié)果的不確定度帶來(lái)了最大的貢獻(xiàn)[23]。而KIRCHMAN等[24]使用顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)菌的研究也表明，不同視野計(jì)數(shù)的變異是計(jì)數(shù)結(jié)果總變異的最大來(lái)源，占總變異的60%～80%。

2.3.2 兩種計(jì)數(shù)結(jié)果的比較

對(duì)105～107CFU/mL釀酒酵母樣品分別通過(guò)平板計(jì)數(shù)和圖像計(jì)數(shù)進(jìn)行定量分析，釀酒酵母樣品濃度進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，結(jié)果見(jiàn)表3。采用雙尾配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)2種定量計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析，表明圖像計(jì)數(shù)結(jié)果顯著大于平板計(jì)數(shù)結(jié)果(P<0.05)。并且圖像計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)均在10%以下，小于平板計(jì)數(shù)，可重現(xiàn)性更好。

表3 平板計(jì)數(shù)和圖像計(jì)數(shù)得到的釀酒酵母樣品濃度Table 3 Cell concentration of S.cerevisiae by plate counting and image counting

對(duì)2種結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖5所示。線性回歸結(jié)果表明，在105～107CFU/mL時(shí)，釀酒酵母樣品采用圖像計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)存在顯著的相關(guān)性(P<0.001，R2=0.999 6)。2種定量結(jié)果盡管在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異，但對(duì)其差值進(jìn)行比較，在試驗(yàn)的所有樣品中，圖像計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)定量樣品濃度的對(duì)數(shù)值相差均小于0.1，所計(jì)數(shù)的樣品中釀酒酵母濃度相差均未出現(xiàn)數(shù)量級(jí)上的差異。表3表明，圖像計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)均小于平板計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)，也說(shuō)明了圖像計(jì)數(shù)變化較小。依據(jù)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心微生物定量(如食品中菌落總數(shù))能力驗(yàn)證(實(shí)驗(yàn)室間，參與者)結(jié)果判斷，能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照|Z|值進(jìn)行評(píng)價(jià)，|Z|<2.0為滿意結(jié)果[25]。釀酒酵母濃度為105～107CFU/mL范圍內(nèi)，圖像計(jì)數(shù)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果一致，且前者精確度與重復(fù)性更好。

圖5 兩種定量結(jié)果的線性關(guān)系Fig.5 The linear relationship between the results of two quantitative analyses

3 結(jié)論

本研究以105～107CFU/mL的釀酒酵母為分析對(duì)象，表明需一定數(shù)量的圖像計(jì)數(shù)可以得到總體的數(shù)量特征，計(jì)數(shù)平均數(shù)和中位數(shù)可作為圖像計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析的參數(shù)。在本研究對(duì)釀酒酵母樣品的圖像計(jì)數(shù)中，釀酒酵母濃度為106～107CFU/mL時(shí)需統(tǒng)計(jì)圖像數(shù)量至少為13個(gè)，濃度為105CFU/mL時(shí)需統(tǒng)計(jì)圖像數(shù)量至少為50個(gè)，圖像計(jì)數(shù)方法不確定度較小，并且通過(guò)增加計(jì)數(shù)圖像的數(shù)量可以進(jìn)一步減小結(jié)果的不確定度，使結(jié)果更加精確。對(duì)釀酒酵母樣品圖像計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)比較表明，在105～107CFU/mL時(shí)，釀酒酵母樣品采用圖像計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)存在顯著的相關(guān)性，2種計(jì)數(shù)結(jié)果的對(duì)數(shù)值相差均小于0.1，圖像計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)均小于平板計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)。

目前隨著微流控技術(shù)與數(shù)字圖像處理技術(shù)的快速發(fā)展，圖像計(jì)數(shù)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)化、自動(dòng)化的特點(diǎn)，使得基于圖像計(jì)數(shù)的微生物計(jì)數(shù)方法具有了更大的發(fā)展空間[26-27]。本研究的成果為新型圖像計(jì)數(shù)方法的開(kāi)發(fā)與使用提供了統(tǒng)計(jì)分析依據(jù)。