朱佐銀，彭湉，周新麗

(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海，200093)

植物乳桿菌是一種桿狀的兼性厭氧乳桿菌，能夠抑制病原菌的生長，從而調(diào)節(jié)消化道菌群平衡。一旦腸道菌群失調(diào)，腸道的代謝和免疫環(huán)境將會受到影響，從而導致炎癥的發(fā)展[1]。植物乳桿菌作為其治療策略之一，可通過定植抗力和生態(tài)占位來排斥病原菌，從而調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡[2-3]。在胃腸道消化過程中，胃的低pH、高膽鹽等環(huán)境，降低了植物乳桿菌的存活率并影響它在宿主體內(nèi)的定植，致使植物乳桿菌在人體內(nèi)的活菌數(shù)達不到其發(fā)揮作用的數(shù)量要求，促使益生效果降低[4]。益生菌微膠囊技術是保護益生菌活細胞免受不利環(huán)境因素的影響并將其傳遞到腸道的有效方法。目前用于微囊化的制備技術主要有擠壓法、乳化法、噴霧干燥法等傳統(tǒng)方法。其中擠壓法常用于益生菌的封裝[5-6]，但制備的微膠囊粒徑相對較大(2～5 mm)，微膠囊化過程較緩慢，不利于規(guī)?；a(chǎn)。乳化法細胞存活率高，但制備的微膠囊形狀不規(guī)則，微球均一性較差[7-8]。噴霧干燥是常用的微囊化工藝之一，操作成本低廉，生產(chǎn)能力高[9]，但噴霧干燥中菌體與熱空氣接觸，對益生菌的活力有所影響甚至使其失活。

液滴微流控技術主要研究微尺度范圍內(nèi)液滴的生成、操控及應用等。它是在微流控芯片上將分散相以微小體積(10-5～10-9L)單元的形式分散于連續(xù)相中，形成的液滴在通道內(nèi)運動[10]。在制備液滴的過程中，微流控技術可以對液滴的大小，數(shù)量和性質(zhì)進行精確地控制，還可以通過調(diào)節(jié)微膠囊粒徑、形態(tài)結構和組分來提高生物活性物質(zhì)的包埋率和控釋，為微囊化研究提供了一個新平臺。該技術已用于生物、醫(yī)療、制藥、環(huán)境等領域[11]。將細菌封裝后進行單個細胞的單克隆擴增，再結合細菌微囊化使熒光活化細胞分選(fluorescent activated cell sorting system, FACS)可實現(xiàn)高通量篩選[12]。TEREKHOV等[13]將液滴微流控與FACS相結合，實現(xiàn)了超高通量篩選和細菌相互作用的檢測。QUINTANA等[14]利用微流控設備成功將植物乳桿菌CIDCA83114封裝在豆渣油和丙烯酸組成的W/O乳液中，并通過控制兩相流速從而有規(guī)律地產(chǎn)生穩(wěn)定且大小均一的液滴。

雖然液滴微流控技術為微膠囊的制備帶來了方法上的變革，但單個微流體裝置的生產(chǎn)率較低。開發(fā)能夠并行操作多個微流體液滴生成器(microfluidic droplet generator, MFDG)的陣列芯片，使高通量制備微膠囊成為可能。在單層微流體芯片中，流體入口和出口的數(shù)量隨著液滴發(fā)生器的數(shù)量增加而增加，限制了集成到單個芯片上的液滴發(fā)生器數(shù)量。通過加入第二層微流體通道，可以為每個MFDG供應流相，且整個并行結構共用一個進口和出口[15]，能夠增加液滴生成器的數(shù)量。另外，改變兩相分布層和液滴生成器結構也有助于增加液滴生成器的數(shù)量，目前兩相分布層大致分為梯度分布和樹狀分布，MFDG集成陣列也有平行陣列和圓形陣列2種[16-17]。HAN等[17]設計了一種8通道并行化芯片，探索了圓形陣列和平行陣列2種并行化模式生成液滴的情況，研究發(fā)現(xiàn)圓形陣列更能實現(xiàn)單分散液滴的制備，但此研究僅限于流體梯度分布，基于樹狀分布還有待探索。目前利用微流控芯片高通量制備液滴的研究大多基于單分散性液滴的形成，而幾乎沒有研究將其應用于益生菌微膠囊的高通量制備。

彭湉[18]利用流聚焦液滴微流控芯片制備植物乳桿菌微膠囊，通過正交試驗確定了單個微流控單元的最佳幾何參數(shù)。本文基于上述芯片的最佳幾何參數(shù)，設計并加工了集成多個MFDG的微流控芯片，以液滴直徑大小、變異系數(shù)及液滴生成頻率為評價指標，研究了梯度分布和樹狀分布2種流體分布層結構，以及平行陣列和圓形陣列2種液滴生成器模式對液滴生成的影響；選擇樹狀分布的圓形陣列芯片研究MFDG個數(shù)對液滴生成的影響；綜合考慮流體分布結構、陣列模式和MFDG個數(shù)，實現(xiàn)對植物乳桿菌微膠囊的高通量制備。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗設備

1.1.1 材料與試劑

材料：植物乳桿菌，杜邦中國集團有限公司上海分公司；海藻酸鈉、低脂果膠、卵磷脂、無水CaCl2、檸檬酸鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶(酶活力1∶10 000)、胰蛋白酶(酶活力1∶250),生工生物工程(上海)股份有限公司。

試劑：MRS液體培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基，模擬胃液，模擬腸液。

1.1.2 實驗設備

MCO18AC CO2培養(yǎng)箱，日本松下醫(yī)療器械有限公司；HRLM-80高壓滅菌鍋，青島海爾特種電器有限公司；ST16r低溫離心機，北京賽默飛；CFI60光學顯微鏡，日本尼康；VLS2.30 CO2激光雕刻機，美國環(huán)球公司；TBK-508真空貼合機，深圳市旺達科技有限公司。

1.2 液滴微流控芯片的制備

液滴微流控芯片采用PMMA材料加工，利用Auto CAD分層繪制芯片的幾何圖形，將繪制好的各層芯片結構圖案傳輸至激光雕刻機進行切割，得到各層結構基片。超聲波清洗20 min后，利用真空貼合機對芯片進行鍵合。最后選取合適規(guī)格的針頭、聚四氟乙烯管對芯片出口、入口進行插針、接管等操作，用UV紫外固化膠進行粘連密封。為了更好地形成W/O液滴，使用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)注射涂覆的方法對親水性PMMA通道進行疏水性改性。

1.3 高通量芯片流體分布層結構

高通量芯片流體層分為梯度分布和樹狀分布2種結構。圖1-a所示，梯度分布由連續(xù)相通道、分散相通道、一個公共出口通道以及在水平方向上排布的多個MFDG組成。兩相流體分別從蓋板層的2個入口進入兩相分布層，通過垂直通孔流入集成了多個MFDG的液滴生成層后生成單分散液滴，最后液滴流入收集通道，實現(xiàn)液滴集中收集。梯度分布芯片主要由蓋板層、兩相分布層、垂直通孔層、液滴生成器集成層、液滴收集層以及底板層共6層組成。芯片的整體尺寸為35 mm×50 mm，各MFDG的幾何尺寸參數(shù)為：孔口寬度100 μm、通道高度300 μm、進油口寬度350 μm、進水口200 μm、出口寬度600 μm。

a-梯度分布；b-樹狀分布圖1 梯度分布芯片結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the gradient distribution chip structure

樹狀分布結構芯片主要由連續(xù)相樹狀分布層、分散相樹狀分布層與每個樹狀分支末端匹配的MFDG組成(圖1-b)。連續(xù)相和分散相分別從入口引入后，兩相流體均以樹狀分布展開，并通過直至通孔分流流入每個MFDG內(nèi)，并剪切生成單分散液滴流向液滴收集層，導出液滴?；诜植鎸ΨQ原理，樹狀分布結構將兩相流體均勻地分配到液滴生成微通道中，具有最小的能量消耗和停留時間[19]。樹狀分布結構主要由8個基本層組成：蓋板層、連續(xù)相分布層、垂直通孔層1、分散相分布層、垂直通孔層2、MFDG集成層、液滴收集層以及底板層。芯片的整體尺寸為40 mm×40 mm，各MFDG的幾何尺寸參數(shù)與梯度分布芯片的MFDG設置一致。圖2為2種分布芯片實物圖。

a-梯度分布；b-樹狀分布圖2 微流控芯片實物圖Fig.2 Physical map of microfluidic chip

1.4 高通量芯片液滴生成器結構

高通量芯片液滴生成器分為平行陣列和圓形陣列2種結構，圖3為平行陣列和圓形陣列芯片實物圖。平行陣列是指液滴生成器集成層中各MFDG的排列方式為平行模式，多個MFDG(8、16、32)在水平方向上依次排開。平行陣列8、16、32-MFDG各芯片的尺寸分別為40 mm×40 mm，40 mm×70 mm，50 mm×80 mm，各MFDG的幾何尺寸參數(shù)與梯度分布芯片的MFDG設置一致。圓形陣列是指液滴生成器集成層中各MFDG的排列方式為圓形模式，多個MFDG(8、16、32)以圓心為中心陣列排開。兩相流體通過各自的進樣口輸入后均勻分配至芯片的MFDG堆棧中心放置，旨在保持從液體源到各MFDG相同的通道長度。兩相流體都從圓形芯片的中心按樹狀分布流到邊緣，然后再從上到下流動，實現(xiàn)集中式分配。在液滴生成層中各MFDG的出口均指向圓心，達到集中式收集的效果。圓形陣列8、16、32-MFDG芯片半徑分別為23.5、23.5、35 mm，各MFDG的幾何尺寸參數(shù)與梯度分布芯片的MFDG設置一致。

a-平行陣列-8MFDG；b-平行陣列-16MFDG；c-平行陣列-32MFDG；d-圓形陣列-8MFDG；e-圓形陣列-16MFDG；f-圓形陣列-32MFDG圖3 兩種陣列芯片實物圖Fig.3 Physical map of two array chips

1.5 流體分布層結構對液滴生成的影響

按照梯度分布和樹狀分布結構設計，分別制作集成8個MFDG的微流控芯片，用于制備單分散液滴。其中，連續(xù)相為硅油，分散相為菌-壁材混合液(海藻酸鈉-低酯果膠-卵磷脂復合壁材溶液)，連續(xù)相流速為500 μL/min，分散相流速為50 μL/min，開啟注射泵。隨著時間的推移，兩相流體穩(wěn)定持續(xù)地注入到每個MFDG中并兩相剪切形成W/O液滴，通過光學顯微鏡觀察液滴生成過程，分析流體分布層結構對液滴生成的影響。設置分散相的流速分別為10、20、30、40、50 μL/min，兩相流速比恒定為15，相應的連續(xù)相的流速為150、300、450、600、750 μL/min，在5組流速條件下制備微液滴，測定梯度和樹狀2種流體分布結構下液滴尺寸大小及變異系數(shù)，并分析液體流速對液滴生成的影響。

1.6 液滴生成器集成層形式對液滴生成的影響

在樹狀分布的基礎上，分別用集成了8、16、32個MFDG的平行陣列芯片和圓形陣列芯片制備微液滴，連續(xù)相流速為500 μL/min，分散相流速為50 μL/min，在平行陣列、圓形陣列2種芯片結構和不同MFDG個數(shù)下，測定液滴尺寸大小及變異系數(shù)。

1.7 不同流速比對高通量微膠囊化的影響

將16個MFDG集成在基于樹狀分布的圓形陣列芯片中，用于植物乳桿菌微膠囊的高通量制備。保持分散相流速為50 μL/min不變，通過改變連續(xù)相流速，從而改變兩相流速比值(10、12、15、20)，制備不同粒徑大小的微膠囊，對粒徑大小、粒徑分布以及生成頻率進行統(tǒng)計分析。

1.8 微膠囊的性能測定

1.8.1 粒徑大小及分布

隨機抽取制備的植物乳桿菌微膠囊若干，置于顯微鏡下拍照獲取放大40倍的微膠囊照片，每組樣本選取3個視野，設置3次平行實驗。拍攝的照片用Image-Pro Plus處理軟件對微膠囊粒徑進行測量統(tǒng)計。另外其粒徑分布可以通過粒徑大小的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)來衡量。變異系數(shù)定義為樣品的標準偏差與平均直徑之間的比率，當分布足夠窄(CV≤5%)，該樣品被認為是單分散性的。

1.8.2 微膠囊包埋率

初始菌落數(shù)N0：菌種活化梯度稀釋后在MRS平板上點樣法(20 μL)進行初始菌落計數(shù)(CFU/mL)。計算方法如下：每毫升菌液中菌落形成單位(CFU)=同一稀釋梯度3組平行實驗的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5；微膠囊包埋菌落數(shù)N：取制備所得的微膠囊，加入檸檬酸鈉解囊液，放置在恒溫搖床中37 ℃，180 r/min振蕩使其完全崩解后，梯度稀釋平板點樣法進行菌落計數(shù)(CFU/mL)。包埋率按公式(1)計算：

(1)

1.8.3 液滴生成頻率

通過視頻記錄液滴的生成過程，統(tǒng)計一定時間段內(nèi)液滴生成的數(shù)量，并按公式(2)將液滴數(shù)量轉(zhuǎn)換為液滴生成頻率。

(2)

式中：f，液滴生成頻率，Hz；N，液滴數(shù)量，個；t，時間，min。

2 結果與討論

2.1 梯度分布和樹狀分布制備微液滴

在連續(xù)相流速為500 μL/min，分散相流速為50 μL/min的固定流速下，液滴在8個并行通道中產(chǎn)生，每個單一通道的液滴呈單分散性，但8個通道液滴大小及生成頻率略有不同，這可能是共用一條公共入口通道和各平行液滴發(fā)生器之間的“串擾”引起的。雖然2種流體分布的芯片均存在這種現(xiàn)象，但由于梯度分布結構的不對稱性，流體到達各MFDG時的流阻不一致，流體分布不均，從而導致各通道產(chǎn)液滴的頻率差異較大；樹狀分布的芯片從入口到各MFDG的通道長度相同，能實現(xiàn)流體的對稱均勻分布，各通道產(chǎn)生液滴的頻率差異較小。這2種芯片分布的差異使得液滴生成的狀態(tài)有所不同，實驗結果表明，樹狀對稱結構分布的微通道更傾向于單分散液滴的形成，滿足植物乳桿菌微膠囊單分散性的要求。

在兩相流速比恒定為15，同時改變兩相流速的條件下，分別用2種分布結構陣列芯片制備微液滴，結果如表1所示。2種芯片制備的液滴尺寸隨兩相流體絕對流量的增加而減小，當兩相流速分別從分散相Qd=10 μL/min，連續(xù)相Qc=150 μL/min增大至Qd=50 μL/min，Qc=750 μL/min時，梯度結構芯片制備的液滴平均直徑由440.39 μm減小至325.14 μm，樹狀結構芯片制備的液滴平均直徑由428.2 μm減小至300.85 μm。在兩相流體低流速下(Qd=10 μL/min，Qc=150 μL/min)，樹狀微流體芯片制備的液滴CV值為2.41%，明顯低于梯度微流體芯片制備的微液滴的CV值(4.37%)；而在較高流速下，樹狀結構芯片制備的液滴CV也有所增加，最高達到4.74%，與梯度分布之間的CV值差異減小。樹狀結構將流體均勻分配到每個MFDG，但受到相鄰通道的壓力影響以及產(chǎn)生液滴向噴射狀態(tài)的過渡現(xiàn)象，從而導致液滴尺寸分布變廣。實驗表明均勻的液體加載在MFDG的平行化中起著重要的作用，非對稱分布結構中流體的壓力梯度、改變流動的氣泡、兩相回流以及通道阻塞等問題都將影響單分散液滴的生成。

表1 兩種微流體裝置制備的微膠囊的平均尺寸及其分布Table 1 Average size and distribution of microcapsules prepared by two microfluidic devices

2.2 平行陣列和圓形陣列制備微液滴

在樹狀分布的基礎上，制作集成8、16、32-個MFDG的平行陣列和圓形陣列芯片，在相同面積條件下，圓形陣列對板材的利用率是平行陣列的200%，可見圓形陣列在空間結構上更高效。在連續(xù)相流速為500 μL/min，分散相流速為50 μL/min的條件下，分別用8、16、32-MFDG的平行陣列芯片和圓形陣列芯片制備微液滴，通入芯片的兩相流體均借助樹狀分布層實現(xiàn)了流體的均勻分布，2種芯片均能穩(wěn)定、快速、均勻地產(chǎn)生液滴。

由于流動分布性能的不同，在平行陣列和圓形陣列中產(chǎn)生的液滴的平均尺寸有所不同，圖4為MFDG個數(shù)對平行陣列和圓形陣列芯片液滴的平均粒徑及其變異系數(shù)的影響。當MFDG個數(shù)相同時，圓形陣列制備的液滴直徑大小和尺寸分布，小于平行陣列制備的液滴，其中MFDG個數(shù)為8時，2種陣列芯片制備的液滴差異最小，平行陣列芯片制備的液滴平均直徑為345.1 μm，變異系數(shù)為3.36%，圓形陣列芯片制備的液滴平均直徑為343.3 μm，變異系數(shù)為3.29%。此外，從圖4中還可以看出，隨著MFDG個數(shù)的增加，流體分布的誤差增大，導致2種陣列制備的液滴的平均直徑和變異系數(shù)均呈上升趨勢。相比之下，圓形陣列制備的液滴直徑大小和變異系數(shù)更小，其中集成16個MFDG的圓形陣列芯片制備的液滴的變異系數(shù)CV=3.98%(<5%)，呈現(xiàn)單分散性。該結論與HAN等[17]的研究結論相似。由此可見，流體分布不平衡是液滴多分散性的主要影響因素，圓形陣列相對平行陣列來說更能促進均勻的流體輸送，適用于單分散液滴的高通量制備。

a-平均直徑的變化；b-變異系數(shù)的變化圖4 MFDG個數(shù)對平行陣列和圓形陣列芯片液滴生成的影響Fig.4 Effect of the number of MFDGs on droplet generation in parallel and circular array chips

2.3 不同流速比對高通量制備微膠囊的影響

將16個MFDG集成在基于樹狀分布的圓形陣列芯片中，在不同流速比下制備植物乳桿菌微膠囊，其粒徑大小、粒徑分布、生成頻率及包埋率結果如表2所示。隨著流速比的增加，植物乳桿菌微膠囊粒徑呈減小趨勢，從371.7 μm減小至298.7 μm，而粒徑分布逐漸變寬，變異系數(shù)CV最大為4.95%。此外，植物乳桿菌微膠囊生成頻率隨流速比的增加而增加，當流速比為20時，其生成頻率最高達到30.5 Hz。最后將所制備的植物乳桿菌微膠囊離心收集洗凈后置于濃度為0.06 mol/L的無菌檸檬酸鈉解囊液中進行菌體釋放，活菌計數(shù)后得到其包埋率為93.7%～96.4%，在各流速比條件下差異不大。保持分散相流速為50 μL/min不變，通過改變連續(xù)相流速，從而改變兩相流速比(10、12、15、20)來制備不同粒徑大小的微膠囊。當分散相流速保持不變時，液滴尺寸隨著連續(xù)相流速的增加而減小。

表2 不同流速比制備植物乳桿菌微膠囊的結果Table 2 The results of preparing Lactobacillus plantarum microcapsules with different flow rate ratios

通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著流速比的增加，植物乳桿菌微膠囊粒徑呈減小趨勢，生成頻率不斷增大，而液滴的穩(wěn)定性逐漸下降，由于流速比為10和12時，生成液滴的頻率較慢，流速比為20時，生成液滴的穩(wěn)定性不佳，液滴生成后期出現(xiàn)流體掛壁、拖尾、噴射等現(xiàn)象，液滴生成失控。綜合考慮，選取流速比為15為最佳流速比。高通量陣列芯片制備所得微膠囊粒徑分布均勻，形狀較為規(guī)則(圖5)。

圖5 高通量微流控陣列芯片制備的微膠囊Fig.5 Microcapsules fabricated by high-throughput microfluidic array chips

3 結論

本文通過液滴微流控芯片制備植物乳桿菌微膠囊，設計一種集成多個MFDG的微陣列芯片，用于植物乳桿菌微膠囊的高通量制備。得出以下結論：

(1)制作梯度分布和樹狀分布2種流體分布結構的微流控芯片用于制備單分散液滴。在兩相流體低流速下，樹狀微流體芯片制備的液滴單分散性(CV=2.41%)明顯優(yōu)于梯度微流體芯片制備的微液滴(CV=4.37%)；在較高流速下，樹狀分布與梯度分布之間的CV值差異減小，受到相鄰通道的壓力影響以及產(chǎn)生液滴向噴射狀態(tài)的過渡現(xiàn)象，微液滴的尺寸分布變廣；

(2)選取較佳的樹狀流體分布結構，用集成了8、16、32-MFDG的平行陣列芯片和圓形陣列芯片制備微液滴。當MFDG個數(shù)為8時，2種陣列制備的液滴差異不大，當MFDG個數(shù)增加時，圓形陣列比平行陣列制備的液滴直徑更小以及更窄的尺寸分布；

(3)將16個MFDG集成在基于樹狀分布的圓形陣列芯片中，用于植物乳桿菌微膠囊的高通量制備。當流速比為15時，液滴生成頻率為20.3 Hz，包埋率為96.4%。

本文對液滴微流控芯片的流體分布層及液滴生成器的結構進行了優(yōu)化，用于植物乳桿菌微膠囊的制備。結果表明樹狀分布的圓形微流控陣列芯片實現(xiàn)了對植物乳桿菌的高效率封裝，包埋效果良好。該研究為高通量制備植物乳桿菌微膠囊提供了思路，目前僅在二維方向上進行了液滴生成器的并行化設計，距實現(xiàn)真正工業(yè)化還有很大的上升空間，可設計三維陣列芯片，探尋更高通量的益生菌微膠囊制備方法。