楊小涵，秦濟(jì)昆，操俊，李月嬋，羅學(xué)剛*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 生物工程國家級實驗教學(xué)示范中心，天津，300457) 2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津，300457)

蛋白質(zhì)是組成人體的基本物質(zhì)，動物蛋白質(zhì)的氨基酸(特別是必需氨基酸)組成完整性更高、構(gòu)成比例與人體更為接近、更容易吸收，同時動物蛋白質(zhì)原料富含更多的維生素B12、DHA等人體重要的營養(yǎng)素，而凝集素、皂苷等抗?fàn)I養(yǎng)素的含量則比植物蛋白質(zhì)原料少。因此，動物蛋白質(zhì)飲品的需求與發(fā)展空間越來越大。目前，市場上的蛋白質(zhì)飲品依然以核桃仁、花生等植物蛋白質(zhì)類居多，動物蛋白質(zhì)飲品基本上局限于乳類產(chǎn)品，新型產(chǎn)品亟待開發(fā)[1]。

蝦中蛋白質(zhì)含量較高，同時磷脂等營養(yǎng)成分也十分豐富，具有較高的開發(fā)價值。近年來，中國產(chǎn)區(qū)蝦產(chǎn)量連續(xù)呈增長趨勢，2021年已達(dá)到200萬t左右，在世界六大蝦主產(chǎn)國中位居首位。蝦產(chǎn)品以直接食用為主，精深加工研發(fā)力度不夠，產(chǎn)品品種少，并且受市場波動、季節(jié)等因素影響明顯，特別是近年來餐飲業(yè)受新冠疫情沖擊，致使蝦產(chǎn)業(yè)過?，F(xiàn)象加重。

蝦醬作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品，是我國沿海以及東南亞地區(qū)常用的調(diào)味料之一，但是在其他地域至今難以推廣，應(yīng)用人群比較有限，而且鹽含量較高，在健康方面并不理想。研究發(fā)現(xiàn)，蝦醬中存在芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、片球菌屬、酵母菌屬等多種天然的共生微生物[2]。

益生菌食品具有改善腸道微生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝、增強(qiáng)免疫效力及防治各類疾病的功效，具有巨大的商業(yè)價值[3-5]。本文從傳統(tǒng)蝦醬中篩選出能夠較好地代謝蝦肉的益生菌，然后通過系統(tǒng)性的優(yōu)化與分析，對適于現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)的益生菌蝦肉蛋白發(fā)酵飲品進(jìn)行了研發(fā)探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬，山東省濱州經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)某蝦醬專賣店；鮮蝦，天津市北塘海鮮市場；檸檬，天津市某水果專賣店；甜菊糖苷，曲阜香州甜菊制品有限責(zé)任公司；食品級木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；食品級活性炭，鞏義市海星供水材料有限公司；無水乙醇，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品有限公司；伯樂蛋白定量試劑盒，伯樂(Bio-Rad)公司；黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HG35型厭氧培養(yǎng)箱，天津普瑞斯儀器有限公司；TG16B型高速臺式離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-6100分光光度計，上海元析儀器有限公司；SPECTRAMAX190型酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司；PSSJ-4V型精密pH計，上海精密科學(xué)儀器公司；HN-E905奧爾貝斯榨汁機(jī)，奧爾貝斯電器廠；4R2204CN型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；1200高效液相色譜儀，安捷倫公司。

1.3 蝦醬中益生菌的篩選

1.3.1 菌株的篩選

無菌條件下取1 g發(fā)酵蝦醬于1 mL無菌水中混勻，梯度稀釋后分別取各梯度下的樣品100 μL均勻涂布至添加CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。依次挑選出現(xiàn)溶鈣圈的白色圓形菌落于MRS固體平板上進(jìn)行劃線純化，37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.2 菌株的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

取純化后的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察其形態(tài)。

1.3.2.2 基因序列比對

通過PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA并進(jìn)行測序，BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析后使用MEGA-7軟件的鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[6]，然后使用iTOL(https://itol.embl.de/)對進(jìn)化樹進(jìn)行美化[7]。

1.3.3 生長曲線的繪制

取40 μL活化菌株于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定OD600值，繪制生長曲線。

1.3.4 嘌呤代謝能力的測定

以鳥嘌呤和次黃嘌呤作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過HPLC分析菌株發(fā)酵對樣品的鳥嘌呤與次黃嘌呤代謝能力的影響[8-9]。

1.4 蝦肉蛋白飲品的制備

1.4.1 工藝流程及操作要點

原料前處理→脫脂→酶解→煮沸滅酶→離心，合并上清液→加活性炭脫色脫苦脫腥→離心取上清液→巴氏滅菌→冷卻得蛋白液→復(fù)配→接菌→培養(yǎng)→調(diào)配→成品[10-11]

原材料前處理：將新鮮的蝦清洗干凈后去殼，于65 ℃水浸泡30 min，烘干過夜，粉碎，過100目篩，保存待用。

脫脂：將原料與無水乙醇按質(zhì)量比1∶6混合，在50 ℃下靜置1 h，并每隔20 min攪拌1次，重復(fù)2次。

酶解：用木瓜蛋白酶在pH 7.2、60 ℃條件下，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶用量6 000 U/g，反應(yīng)6 h。

活性炭處理：添加15 g/L的活性炭，在55 ℃下處理30 min。

復(fù)配：將新鮮的巴氏滅菌后的檸檬汁與蝦蛋白液按體積比7∶3混合[12]。

1.4.2 蝦肉蛋白飲品工藝參數(shù)的優(yōu)化

1.4.2.1 單因素試驗

以感官評價為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗。

(1)發(fā)酵時間的確定：控制接種量為3%、甜菊糖苷添加量為1.25 g/L，對復(fù)配飲品分別發(fā)酵8、10、12、14、16 h。

(2)接種量的確定：控制發(fā)酵時間為12 h、甜菊糖苷添加量為1.25 g/L，分別按接種量1%、2%、3%、4%、5%，對復(fù)配飲品進(jìn)行發(fā)酵。

(3)甜菊糖苷添加量的確定：控制接種量3%、發(fā)酵時間為12 h，分別添加0.75、1、1.25、1.5、1.75 g/L甜菊糖苷，對復(fù)配飲品進(jìn)行發(fā)酵[13]。

1.4.2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，取得分最高的2個水平，設(shè)計L4(23)正交試驗，以感官評價為指標(biāo)，優(yōu)化最佳的工藝參數(shù)。

1.4.2.3 飲品感官評價標(biāo)準(zhǔn)

由固定的10人對綜合樣品的組織狀態(tài)、氣味、口感等指標(biāo)作出評分，去掉最低分和最高分后的平均值為該產(chǎn)品的最終得分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 Sensory evaluation criteria

1.5 飲品參數(shù)的測定

1.5.1 飲品中蛋白質(zhì)含量的測定

利用蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測：避光條件下精密吸取4 μL試劑以及200 μL樣品于孔板中，避光反應(yīng)15 min，利用酶標(biāo)儀測定其OD595值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比。

1.5.2 抗氧化能力的測定

分別取1 mL蒸餾水、DPPH、樣品于5 mL離心管中，搖勻，避光靜置30 min，然后在517 nm處測量其吸光值，按公式(1)計算其清除率并與維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對照[14]：

(1)

式中：AX，1.0 mL樣品+1.0 mL DPPH+1.0 mL蒸餾水的吸光值；A0，1.0 mL DPPH+2.0 mL蒸餾水的吸光值；AX0，3.0 mL無水乙醇的吸光值。

1.5.3 抑制XOD能力的測定

利用XOD測定試劑盒中的5個試劑分別加入蒸餾水、發(fā)酵前以及發(fā)酵后的樣品于水浴37 ℃反應(yīng)20 min，測定其OD530，XOD抑制率的計算如公式(2)所示：

(2)

式中：R，XOD的抑制率，%；ODC，對照組OD530值；ODS，實驗組OD530值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦醬中益生菌的篩選、鑒定與檢測

2.1.1 益生菌的篩選與鑒定

以傳統(tǒng)蝦醬為原料，最終篩選獲得一株具有顯著產(chǎn)酸能力、強(qiáng)嘌呤代謝能力的桿狀菌，鏡檢結(jié)果如圖1所示，革蘭氏染色為紫色，菌株呈現(xiàn)明顯的桿狀且可觀察到芽孢。測序比對結(jié)果顯示其16S rDNA與凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulansstrain) wy01相似度高達(dá)97.71%(圖2)，再結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征，最終鑒定為凝結(jié)芽孢桿菌，并命名為B.coagulansGH1-1，將其保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.24236。

圖1 B.coagulans GH1-1鏡檢照片F(xiàn)ig.1 Microscopic photos of B.coagulans GH1-1

圖2 B.coagulans GH1-1的進(jìn)化樹Fig.2 Evolutionary tree of B.coagulans GH1-1

2.1.2B.coagulansGH1-1生長曲線及嘌呤代謝能力的檢測

如圖3所示，B.coagulansGH1-1于0～4 h處于潛伏期，4～16 h處于對數(shù)生長期，16 h時到達(dá)穩(wěn)定期，最大OD600在1.8左右。由于對數(shù)生長中后期的菌株具有生長速度快，各個體間均勻一致等優(yōu)點，用做發(fā)酵的種子繁殖后代時可接近同步生長，使發(fā)酵代謝正常，周期縮短，因此種子發(fā)酵時間定為12 h。

圖3 B.coagulans GH1-1生長曲線Fig.3 Growth curve of B.coagulans GH1-1

由圖4可知，B.coagulansGH1-1可很好地代謝鳥嘌呤和次黃嘌呤，嘌呤總量減少了86.75%。因此，用該菌株發(fā)酵飲品可有效減少蝦蛋白的嘌呤含量，且該菌株進(jìn)入腸道后，具有代謝腸道中嘌呤的能力，對于防治高尿酸血癥具有潛在的功效。

a-標(biāo)準(zhǔn)品液相圖;b-GH1-1代謝后液相圖圖4 B.coagulans GH1-1的嘌呤代謝能力HPLC檢測圖Fig.4 B.coagulans GH1-1 purine metabolism ability HPLC detection chart注：黃嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤的停留時間分別為4.7、5.2和8.8 min

2.2 B.coagulans GH1-1發(fā)酵蝦肉蛋白飲品的工藝優(yōu)化

由于使用單純的蝦肉蛋白液發(fā)酵口味難以被大眾接受，且堿性過強(qiáng)(經(jīng)測定pH>12)，不利于菌株的生長和代謝，因此，為提高其口感，調(diào)節(jié)其pH，同時增加飲品的營養(yǎng)成分，使用檸檬汁與其進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，并在發(fā)酵后添加適量甜菊糖苷進(jìn)一步調(diào)節(jié)口味。

2.2.1 單因素試驗結(jié)果

如圖5所示，隨著發(fā)酵時間的增加，感官評分呈先上升后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為14 h時，發(fā)酵飲品綜合得分最高，果味、酸味、甜味交融，口感最佳。但隨著發(fā)酵時間的增加，乳酸產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時間超過14 h后，發(fā)酵酸味過重，飲品的新鮮感、檸檬特征香氣伴隨發(fā)酵逐漸消失，評分下降。

圖5 發(fā)酵時間對感官評價的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation

隨著接種量的增加，感官評分呈先上升后降低的趨勢。當(dāng)接種量過低時，乳酸風(fēng)味不足，感官評分較低，隨著接種量的增加，乳酸產(chǎn)量增加，酸味稍微加重，但飲品發(fā)酵更加充分的同時，飲品的新鮮感漸弱，檸檬特征香氣漸弱，當(dāng)接種量為3%時，酸度適中，果香味明顯，飲品綜合得分最高(圖6)。

圖6 B.coagulans GH1-1接種量對感官評價的影響Fig.6 Effect of B.coagulans GH1-1 inoculum on sensory evaluation

隨著甜菊糖苷添加量的增加，感官評分呈先上升后降低的趨勢。適量的甜菊糖苷與飲品的酸味復(fù)合可增加口感，但隨著添加量的增加，甜菊糖苷特殊甜味加重，會影響了檸檬的果香以及發(fā)酵口感，感官評分大幅度下降。當(dāng)甜菊糖苷添加量為1 g/L時，飲品酸甜適度，符合多數(shù)人的口味，綜合得分最高(圖7)。

圖7 甜菊糖苷添加量對口感的影響Fig.7 Effect of stevioside addition on taste

2.2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇得分最高的2個水平進(jìn)行正交，正交因素與水平見表2。

表2 正交因素水平表Table 2 Orthogonal factor level table

正交試驗結(jié)果及極差如表3所示，極差RA>RB=RC，即3種因素對飲品感官評價的重要程度最大的為發(fā)酵時間。3個因素最佳配比為A1B1C1，即發(fā)酵時間為12 h、接種量為3%、甜菊糖苷添加量為1 g/L。

2.3 發(fā)酵飲品的特性分析

如表4所示，飲品中蛋白質(zhì)的含量為2.44 g/100 mL。未發(fā)酵的飲品DPPH清除率為66.61%，與維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，相當(dāng)于859.13 μmol/L的維生素C；發(fā)酵后的DPPH清除率為80.03%，與維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，相當(dāng)于914.47 μmol/L的維生素C，可以看出發(fā)酵后，飲品的抗氧化能力可提高22.14%。經(jīng)計算，未發(fā)酵的飲品可抑制53.11%的XOD活性，發(fā)酵后XOD活性抑制率可達(dá)66.67%，抑制XOD活性的能力提高25.53%。

表3 正交實驗結(jié)果及極差分析Table 3 Results and range analysis of orthogonal experiment

表4 發(fā)酵蝦肉飲品的特性分析Table 4 Beverage parameter measurement results

3 結(jié)論

凝結(jié)芽孢桿菌是一種可食用益生菌，它既有乳酸菌和雙歧桿菌的益生作用，又具有芽孢菌的抗逆性強(qiáng)、易貯藏等優(yōu)點，研究發(fā)現(xiàn)，大約有85%凝結(jié)芽孢桿菌能順利到達(dá)小腸，通過調(diào)節(jié)微生物群組成、宿主免疫和代謝，對腸道疾病具有治療作用。此外，毒理學(xué)實驗和大量臨床觀察表明，凝結(jié)芽孢桿菌屬于一類安全的可食用微生物[15]。早在1989年，凝結(jié)芽孢桿菌就被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)評為“普遍認(rèn)為安全(Generally Recognized as Safe, GRAS)”的一類桿菌，目前已被FDA列入GRAS名單，并獲得了歐盟食品安全局的安全資格認(rèn)定。2005年，我國國家食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了凝結(jié)芽孢桿菌活菌藥物上市，2016年我國衛(wèi)生部也批準(zhǔn)凝結(jié)芽孢桿菌作為新資源食品[16]。目前，凝結(jié)芽孢桿菌在食品、醫(yī)藥、飼料等方面的應(yīng)用依然在不斷發(fā)展[17]。

蝦營養(yǎng)成分豐富，具有巨大的開發(fā)潛力[18-19]。然而，我國對蝦資源的開發(fā)起步較晚，目前也還處在不斷探索階段，例如：一些研究將蝦制成蝦粉，再進(jìn)一步用于提取油脂、蝦青素、蛋白質(zhì)等[20]。近年來，不少人也針對其易于微生物生長繁殖的特點，從其相關(guān)制品中篩選出益生菌，如2021年田亮金等[2]從蝦醬中篩選出了6株益生芽孢桿菌并對其益生效果進(jìn)行了分析。與其不同的是，本研究中所篩選獲得凝結(jié)芽孢桿菌不僅具有較強(qiáng)抗氧化作用，而且有著明顯的嘌呤代謝能力，為蝦肉這一高嘌呤食材的深加工提供了新的優(yōu)良發(fā)酵菌株。

蝦肉相關(guān)飲品，目前市面上還極為罕見。謝偉斌等[11]曾對蝦蛋白進(jìn)行酶解，再與蜂蜜等調(diào)配制備了一款低分子多肽保健飲品；章雪琴等[21]將蝦肉攪碎酶解，用3種益生菌聯(lián)合發(fā)酵制備了一款發(fā)酵飲品。與前人研究有所不同，本文首先從蝦醬中分離獲得了具有生長性能良好、嘌呤代謝能力強(qiáng)的益生菌新菌株，經(jīng)過較為系統(tǒng)的優(yōu)化，研究制備了一款蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分豐富且更符合大眾口味的蝦蛋白飲品。而且，該發(fā)酵飲品具有很強(qiáng)的抗氧化能力，有助于延緩組織器官功能減退以及細(xì)胞組織的老化，同時，所用菌株具有較強(qiáng)的代謝嘌呤的能力，且輔料檸檬汁具有降低尿酸的功效[22]，所制得的飲品還可顯著增強(qiáng)XOD抑制活性，因此，該飲品在預(yù)防高尿酸血癥方面具有潛在的價值。