杜向軍，明紅梅*，馬浩，江東材，朱和琴，陳園，胥佳

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(四川省宜賓市敘府酒業(yè)股份有限公司，四川 宜賓，644000)

大曲又稱塊曲或磚曲，是以生小麥粉為主要原料(或配以大麥、豌豆為輔料)，經(jīng)過自然接種，在人工控制溫度和濕度的條件下培育而成[1]。其富含多種微生物、酶類和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，是白酒釀造過程中的糖化發(fā)酵劑、生香劑。研究表明，大曲的品質(zhì)直接影響著白酒的產(chǎn)量、質(zhì)量和酒體風(fēng)格，是生產(chǎn)傳統(tǒng)固態(tài)釀造大曲酒的重要物質(zhì)保障[2]，故有“曲乃酒之骨”之稱。

大曲作為白酒釀造的糖化發(fā)酵劑和生香劑，其獨特的“包包”結(jié)構(gòu)，使之具有更大的比表面積和孔隙度[3]。研究表明，大曲不同部位之間的水分、酸度、發(fā)酵力、酯化力、糖化力、液化力、微生物群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味物質(zhì)的組成都具有明顯差異[4]。鄧長陽等[5]對大曲表層和曲心的真菌群落結(jié)構(gòu)進行了研究，發(fā)現(xiàn)大曲表層的微生物主要以根霉菌和毛霉菌為主，而在曲心中以嗜熱真菌、嗜熱子囊菌、曲霉菌和畢赤酵母為主。JIN等[6]發(fā)現(xiàn)醬香型大曲中的真菌群落趨向于隨機分布，而細(xì)菌群落中乳桿菌主要分布在表層，芽孢桿菌主要分布在曲心。近年來，隨著白酒釀造行業(yè)機械化的發(fā)展，茅臺、瀘州老窖、四特酒等酒企也開始采用機械壓制大曲[7]。由于機械壓曲替代了傳統(tǒng)的壓曲方式，可能會改變大曲的比表面積、孔隙度等特性，從而影響大曲的品質(zhì)。目前，基于傳統(tǒng)質(zhì)量評價體系的機制大曲和人工大曲品質(zhì)差異的研究已有報道[8]，但關(guān)于機制大曲和人工大曲不同部位之間微生物群落差異及其影響因素的研究較少。

本研究以成品(貯存90 d)機制大曲和人工大曲為研究對象，采用高通量測序技術(shù)解析機制大曲和人工大曲曲塊不同部位的微生物多樣性，并探究2種大曲微生物多樣性差異的影響因素，為進一步剖析大曲品質(zhì)的內(nèi)在驅(qū)動因素、改進機械制曲工藝、提升大曲質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本：機制和人工大曲成品曲，由四川某白酒生產(chǎn)企業(yè)提供。

實驗試劑：葡萄糖、CuSO4·5H2O、酒石酸鉀鈉、NaOH、濃HCl、乙酸、乙酸鈉、可溶性淀粉、己酸、無水乙醇、濃H2SO4、甲醛、酪蛋白、L-酪氨酸(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠；福林酚(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒，美國MP Biomedicals。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25CW型pH計，上海般特儀器制造有限公司；PX124ZH/E電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；DHG-9013A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司；5424離心機，德國艾本德股份公司；Nanodrop ONE超微量分光光度計，廣州儀濤科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣方法及樣品前處理

取樣方法：隨機選取2個機制大曲貯存庫房和2個人工大曲貯存庫房，每個庫房取6組大曲，共24塊大曲，取樣點的設(shè)置參考周天慈等[9]的方法。

分樣方法：將大曲表面至1 cm厚的區(qū)域作為表層，大曲曲坯中心向外3 cm的區(qū)域作為坯心,大曲曲包中心向外3 cm的區(qū)域作為包心，剩余部分作為大曲中層。

樣品前處理：分別將2種大曲表層、中層、坯心和包心的樣品粉碎過20目篩并混合均勻，采用四分法將各部位的樣品分別濃縮至300 g，并將樣本在-20 ℃保藏備用,高通量測序的樣本于-80 ℃保藏。樣本信息見表1。

表1 樣品信息表Table 1 Informaiton of the Daqu samples

1.3.2 理化生化指標(biāo)的測定

大曲水分、酸度、淀粉含量、液化力、糖化力、酯化力、氨基酸態(tài)氮、酒化力的測定參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》；還原糖的測定采用斐林試劑法[1]；酸性蛋白酶活力的測定參考GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》。

1.3.3 大曲總DNA的提取

采用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒提取大曲中微生物的基因組DNA，提取方法按照試劑盒提供的操作方法進行。

1.3.4 PCR擴增

使用超微量分光光度計檢測提取DNA的質(zhì)量，滿足Illumina HiSeq平臺測序的要求后，使用引物ITS1F/ITS2R擴增真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)；使用引物338F/806R擴增細(xì)菌16S rRNA的V3～V4高變區(qū)。

擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

擴增體系：4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL上游引物(5 μmol/L)，0.8 μL下游引物(5 μmol/L)，0.2 μL rTaq聚合酶，0.2 μL BSA，10 ng模板DNA，補ddH2O至20 μL。擴增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

使用SPSS 23軟件對理化生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進行顯著性分析。微生物多樣性分析在上海美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com/)進行。使用SIMCA 14.1對微生物進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)。使用TBtools繪制核心微生物熱圖。最后使用Canoco5對核心微生物和理化生化指標(biāo)進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲曲塊不同部位理化生化指標(biāo)差異性分析

大曲的理化生化指標(biāo)是衡量大曲發(fā)酵是否成熟的重要指標(biāo)，在一定程度上能夠反映大曲質(zhì)量的優(yōu)劣。對機制大曲和人工大曲曲塊不同部位的理化生化指標(biāo)進行檢測，結(jié)果見表2、表3。

由表2、表3可知，機制大曲表層的水分顯著高于中層、坯心和包心，人工大曲則是表層、包心的水分顯著高于中層、坯心，與文獻(xiàn)[10]的報道不一致，原因可能與儲存環(huán)境的濕度有關(guān),且2種大曲各部位水分的變化趨勢并不一致，人工大曲包心水分含量較高，可能與人工拌料不均勻有關(guān)。機制大曲表層的酸度顯著低于其他部位，而人工大曲表層、中層的酸度顯著低于坯心、包心，可能是由于表層氧氣充足，不利于富集產(chǎn)酸微生物[11]，且表層更有利于有機酸的揮發(fā)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，人工大曲坯心和包心的酸度均達(dá)到1.40 mmol/10 g以上，可能是由于在發(fā)酵過程中這2個部位“高溫微氧”的環(huán)境更適合產(chǎn)酸微生物的生長和代謝[12]。機制和人工大曲的糖化力、液化力均為表層顯著高于坯心、包心，可能是由于表層的O2豐富，富集了曲霉、根霉和芽孢桿菌等產(chǎn)糖化酶和液化酶的功能微生物。而且機制大曲中層的糖化力和液化力也較高，分別為42.70和0.23 U/g，可能是中層O2較為豐富，而且水分和溫度也適合這些微生物的繁殖和代謝。同時發(fā)現(xiàn)機制和人工大曲坯心和包心的還原糖含量均顯著高于表層和中層，可能是由于還原糖既可被微生物利用還可轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)[13]。而淀粉含量在2種大曲的各部位均不具有規(guī)律。2種大曲表層的酸性蛋白酶活力顯著低于其他部位，可能是由于中層、坯心和包心相較于表層在發(fā)酵過程中的溫度更高，容易富集嗜熱真菌等具有分泌耐高溫的酸性蛋白酶的微生物有關(guān)[14]。而大曲中的氨基酸態(tài)氮的變化規(guī)律并沒有與酸性蛋白酶呈現(xiàn)較好的一致性。2種大曲中層的酯化力均顯著高于其他部位，分別為13.21和 12.34 U/g，原因可能是中層的微環(huán)境比較適宜曲霉、芽孢桿菌等酯化能力較強的微生物生長。機制大曲各部位的酒化力差異不顯著，人工大曲表層的酒化力顯著高于其他部位，可能是因為人工踩曲有較好的提漿效果[15]，表層的水分分布狀態(tài)更適合產(chǎn)酒精酵母的生長與繁殖。

表2 機制大曲和人工大曲曲塊不同部位理化指標(biāo)值Table 2 Physicochemical indexes values in different parts of mechanical and artificial Daqu

表3 機制大曲和人工大曲曲塊不同部位生化指標(biāo)值Table 3 Biochemical indexes values in different parts of mechanical and artificial Daqu

2.2 大曲曲塊不同部位微生物多樣性分析

2.2.1 基于OTU的多樣性指數(shù)分析

利用IIIumina MiSeq測序技術(shù)對機制大曲和人工大曲曲塊不同部位真菌和細(xì)菌的群落進行解析，結(jié)果如表4所示。在機制大曲中，表層真菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)最高，分別為3.66、118.38和115.87，而坯心則是細(xì)菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)最高，分別為2.17、180.15和180.74。表明在機制大曲中，表層的真菌多樣性最豐富，坯心的細(xì)菌多樣性最豐富。在人工大曲中，表層真菌和細(xì)菌的Shannon指數(shù)最高，分別為2.72和1.82，而包心真菌和細(xì)菌的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)最高，真菌為96.14和94.54，細(xì)菌為106.43和107.54。表明人工大曲表層真菌和細(xì)菌的物種多樣性比其他部位豐富，但是，包心真菌和細(xì)菌的群落豐富度最高。

通過對比2種大曲各部位的多樣性指數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)，機制大曲表層真菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均高于人工大曲表層，坯心真菌的Shannon指數(shù)和包心真菌的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)也高于人工大曲坯心和包心。同時發(fā)現(xiàn)，機制大曲表層細(xì)菌的Shannon指數(shù)低于人工大曲表層，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)高于人工大曲，中層真菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均低于人工大曲，而中層細(xì)菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均高于人工大曲，坯心和包心細(xì)菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)均高于人工大曲。此外，2種大曲各部位真菌和細(xì)菌的Coverage指數(shù)均達(dá)到了99.90%以上，表明本次的測序結(jié)果深度足夠，能夠反映出樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實情況。

表4 機制大曲和人工大曲曲塊不同部位微生物群落多樣性指數(shù)Table 4 The microbial diversity index in different parts of mechanical Daqu and artificial Daqu

2.2.2 大曲曲塊不同部位微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了進一步探究2種大曲曲塊不同部位微生物的群落結(jié)構(gòu)，利用IIIumina MiSeq測序技術(shù)平臺對2種大曲不同部位的微生物進行屬水平上的分類學(xué)分析，結(jié)果如圖1所示。

a-真菌；b-細(xì)菌圖1 機制和人工大曲曲塊不同部位微生物群落結(jié)構(gòu)(屬水平)Fig.1 Microbial community structure in different parts of mechanical and artificial Daqu

由圖1-a可知，在機制大曲中，JZ、JX、JB中相對豐度>5%的優(yōu)勢真菌均為曲霉屬(Aspergillus)和嗜熱真菌屬(Thermomyces)，其相對豐度總和分別為84.65%、99.66%、97.28%；而JP的優(yōu)勢真菌為曲霉屬、嗜熱真菌屬和伊薩酵母屬(Issatchenkia)，其相對豐度總和為49.05%。因此，機制大曲JZ、JX、JB的真菌構(gòu)成具有較大的相似性，而JP與JZ、JX、JB的真菌的構(gòu)成有較大的差異性。在人工大曲中，CP的優(yōu)勢真菌為unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬(Geotrichum)、曲霉屬和嗜熱真菌屬，其相對豐度總和為76.58%；CZ中的優(yōu)勢真菌屬為unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬、unclassified_f_Metschnikowiaceae、嗜熱真菌屬和雙足囊菌屬(Dipodascus)，其相對豐度總和為86.99%；CX與CB的優(yōu)勢真菌均為嗜熱真菌屬，其相對豐度分別為91.74%、85.68%。因此，人工大曲CP與CZ的真菌構(gòu)成具有較大的相似性，CX與CB的真菌構(gòu)成具有較大的相似性，而CP、CZ與CX、CB的真菌構(gòu)成具有較大的差異性。從2種大曲不同部位的優(yōu)勢真菌的組成來看，其共有優(yōu)勢真菌僅有嗜熱真菌屬。由此表明，機制大曲與人工大曲真菌類群構(gòu)成具有較大差異，原因可能與機械壓曲方式下大曲孔隙度較為緊密，從而導(dǎo)致了2種大曲微環(huán)境的差異，影響微生物的生長與繁殖，使微生物在曲塊不同部位的分布特征呈現(xiàn)差異性。

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由圖1-b可知，在機制大曲中，JP相對豐度>5%的優(yōu)勢細(xì)菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)，其相對豐度為88.78%；JZ的優(yōu)勢細(xì)菌為高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬，其相對豐度總和為92.36%；JX的優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、高溫放線菌屬、泛菌屬(Pantoea)，其相對豐度總和為76.32%；JB的優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌屬和高溫放線菌屬，其相對豐度總和為78.38%，其中葡萄球菌屬在JX和JB中的相對豐度分別為57.49%、7.35%。因此，機制大曲JP與JZ的細(xì)菌構(gòu)成較為相似，JX與JB的細(xì)菌構(gòu)成有較大差異。人工大曲中，CP、CZ、CX和CB的優(yōu)勢細(xì)菌均為高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬,其相對豐度總和分別為95.75%、98.96%、98.86%、98.54%。因此，人工大曲CP、CZ、CX、CB的細(xì)菌構(gòu)成具有較高的相似性。由此表明，機制大曲各部位細(xì)菌類群的構(gòu)成具有較大差異，而人工大曲細(xì)菌類群構(gòu)成具有較高的相似性，可能是因為機制大曲的曲塊內(nèi)部微環(huán)境差異較大；而人工大曲的通氣狀況相對較好，細(xì)菌的抗逆性、適應(yīng)性較強，因此，人工大曲中細(xì)菌類群在各部位的分布狀況較為一致。

2.2.3 大曲曲塊不同部位微生物群落差異分析

對機制大曲和人工大曲曲塊不同部位的真菌和細(xì)菌群落進行PLS-DA，結(jié)果如圖2所示。

由圖2-a和圖2-b可知，2種大曲各部位樣本均處于95% Hotelling-T2的橢圓內(nèi)，說明本次分析的樣本中不存在異常值。由圖2-a可知，JZ、JX和JB的真菌類群聚為一簇，而JP的真菌類群則獨為一簇；CP和CZ的真菌類群聚為一簇，CX和CB的真菌類群聚為一簇。表明機制大曲JZ、JX和JB的真菌組成相似度高，而JP與這3個部位的相似度較低。人工大曲CP與CZ、CX與CB真菌組成的相似度高，而CP、CZ與CX、CB真菌組成的相似度較低。由圖2-b可知，JP和JZ的細(xì)菌類群聚為一簇，JX和JB的細(xì)菌類群各自獨為一簇；CP、CZ、CX、CB的細(xì)菌類群聚為一簇。以上結(jié)果表明JP與JZ的細(xì)菌組成相似度高，與JX和JB的細(xì)菌組成相似度較低，而人工大曲各部位細(xì)菌的組成均較為相似。

為了進一步解析機制大曲和人工大曲的差異微生物，利用Wilcoxon秩和檢驗對機制大曲和人工大曲的微生物組成做基于相對豐度的差異顯著性檢驗，結(jié)果如圖2-c、圖2-d所示。在屬水平上，機制大曲和人工大曲中共檢測到顯著差異的真菌和細(xì)菌各15種(P<0.05)。從2種大曲的差異真菌來看(圖2-c)，曲霉屬和青霉屬(Penicillium)在機制大曲中的相對豐度顯著高于人工大曲，而地霉菌屬、復(fù)膜孢酵母屬、雙足囊菌屬等13種真菌在人工大曲中的相對豐度顯著高于機制大曲。其中，除曲霉屬、unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬、復(fù)膜孢酵母屬、雙足囊菌屬、unclassified_f_Metschnikowiaceae、威克漢姆酵母屬以外，其余的微生物的相對豐度均低于1%。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)膜孢酵母屬可以產(chǎn)生α-淀粉酶和蛋白酶等多種水解酶；威克漢姆酵母屬具有較強的產(chǎn)乙酸乙酯的能力[16]，這2種微生物均是大曲中重要的功能性微生物，對白酒釀造具有重要作用。

從2種大曲的差異細(xì)菌來看(圖2-d)，葡萄球菌屬、氧芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬等12種細(xì)菌在機制大曲中的相對豐度顯著高于人工大曲，而高溫放線菌屬和Planifilum在人工大曲中的相對豐度顯著高于機制大曲。其中，除高溫放線菌屬和葡萄球菌屬外，其余微生物的相對豐度均低于1%，高溫放線菌屬具有耐高溫、生長快的特點，其產(chǎn)生的蛋白酶和纖維素酶，是白酒釀造中重要的功能微生物[17]；葡萄球菌屬在濃香型大曲中常被檢測到，但其在白酒釀造中的作用有待進一步研究[3,6]。

2.3 大曲曲塊不同部位核心微生物群落變化規(guī)律

a-機制大曲；b-人工大曲圖3 機制大曲和人工大曲曲塊不同部位核心微生物熱圖(屬水平)Fig.3 Heatmaps of core microbes in different parts of mechanical and artificial Daqu

由圖3-a可知，機制大曲中平均相對豐度較高的核心微生物有曲霉屬(28.03%)、嗜熱真菌屬(51.84%)、高溫放線菌屬(28.29%)、伊薩酵母屬(3.29%)、芽孢桿菌屬(40.72%)、葡萄球菌屬(16.43%)和泛菌屬(2.59%)。其中，曲霉屬、嗜熱真菌屬、高溫放線菌屬、泛菌屬和葡萄球菌屬主要分布在JX和JB中，而伊薩酵母屬和芽孢桿菌屬主要分布在JP和JZ中。由圖3-b可知，在人工大曲中平均相對豐度較高的核心微生物有unclassified_f_Dipodascaceae(22.57%)、地霉菌屬(10.10%)、嗜熱真菌屬(48.13%)、絲孢酵母屬(1.43%)、雙足囊菌屬(2.21%)、unclassified_f_Metschnikowiaceae(2.93%)、芽孢桿菌屬(11.55%)、高溫放線菌屬(86.47%)。其中unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬、絲孢酵母屬、雙足囊菌屬、unclassified_f_Metschnikowiaceae和芽孢桿菌屬主要分布在CP和CZ中，而嗜熱真菌屬和高溫放線菌屬主要分布在CX和CB中。在這些核心微生物中，曲霉屬、嗜熱真菌屬、高溫放線菌屬、芽孢桿菌屬、復(fù)膜孢酵母屬、伊薩酵母屬、假絲酵母屬和根毛霉屬等是大曲中的主導(dǎo)菌群[19-20]，這些菌群的存在有利于提升大曲的發(fā)酵性能。

整體來看，2種大曲中的核心微生物的組成及其分布規(guī)律具有一定的相似性，其中，嗜熱真菌屬、高溫放線菌屬、葡萄球菌屬等核心微生物主要分布在坯心和包心中，而芽孢桿菌屬、伊薩酵母屬、地霉菌屬、根毛霉屬、絲孢酵母屬、威克漢姆酵母屬等微生物主要分布在表層和中層，可能是由于坯心和包心具有透氣性差、不易散熱等特點，導(dǎo)致其微環(huán)境中氧氣缺乏、溫度較高，因而，這些部位成為耐溫、抗逆、兼性需氧微生物的優(yōu)勢區(qū)。

2.4 兩種大曲曲塊核心微生物群落影響因素分析

利用冗余分析法分別分析2種大曲中核心微生物與理化生化指標(biāo)之間的相關(guān)性，探究大曲中影響核心微生物群落結(jié)構(gòu)的因素，結(jié)果如圖4所示。

由圖4-a可知，在機制大曲中，嗜熱真菌屬和高溫放線菌屬與酸度和氨基酸態(tài)氮呈正相關(guān)；泛菌屬和曲霉屬與還原糖呈正相關(guān)；伊薩酵母屬、假絲酵母屬、根毛霉屬和芽孢桿菌屬與液化力、糖化力和酒化力呈正相關(guān)。表明在機制大曲中，嗜熱真菌屬和高溫放線菌屬主要受酸度和氨基酸態(tài)氮的影響；泛菌屬和曲霉屬主要受還原糖的影響；液化力、糖化力和酒化力主要受伊薩酵母屬、假絲酵母屬、根毛霉屬和芽孢桿菌屬的協(xié)同影響。由圖4-b可知，在人工大曲中，曲霉屬與淀粉含量呈正相關(guān)；嗜熱真菌屬和高溫放線菌屬與酸度、還原糖、氨基酸態(tài)氮呈正相關(guān)，而unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬和雙足囊菌屬則與酸度、還原糖和氨基酸態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)；絲孢酵母屬、威克漢姆酵母屬、芽孢桿菌屬和復(fù)膜孢酵母屬與水分、液化力、糖化力和酒化力呈正相關(guān)。表明在人工大曲中，曲霉屬主要受淀粉的影響；嗜熱真菌屬、高溫放線菌屬、unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬和雙足囊菌屬主要受酸度、還原糖和氨基酸態(tài)氮的影響。

a-機制大曲；b-人工大曲圖4 核心微生物與理化生化指標(biāo)冗余分析圖Fig.4 Redundancy analysis of core microbes and physicochemical and biochemical indexes注：紅色箭頭代表理化生化指標(biāo)，藍(lán)色箭頭代表核心微生物，二者之間的夾角代表相關(guān)性(銳角：正相關(guān)；鈍角：負(fù)相關(guān)；直角：無相關(guān)性)

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在2種大曲中，復(fù)膜孢酵母屬和伊薩酵母屬均與酸度、還原糖和氨基酸態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)；高溫放線菌屬則與氨基酸態(tài)氮呈正相關(guān)，可能與該菌屬能夠產(chǎn)生耐高溫的蛋白酶有關(guān)[17]；嗜熱真菌屬與酸度呈正相關(guān)，可能是該菌屬與代謝產(chǎn)酸有關(guān)；芽孢桿菌屬與酸度呈負(fù)相關(guān)，可能與高酸度能抑制芽孢桿菌屬的繁殖有關(guān)[21]。此外，芽孢桿菌屬和根毛霉菌屬與糖化力和液化力呈正相關(guān)，可能與這2種菌屬能產(chǎn)液化酶和糖化酶有關(guān)；酒化力與伊薩酵母屬、威克漢姆酵母屬和假絲酵母屬呈正相關(guān)，可能是這些酵母具備代謝產(chǎn)生乙醇的能力有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究對成品機制大曲和人工大曲表層、中層、坯心和包心的理化生化指標(biāo)、微生物群落結(jié)構(gòu)及其差異進行了研究，并對2種大曲核心微生物的分布規(guī)律及其影響因素進行了分析。結(jié)果表明，除酸度、還原糖、氨基酸態(tài)氮、酸性蛋白酶活力等是機制大曲和人工大曲各部位主要存在差異的理化生化指標(biāo)，其余指標(biāo)變化規(guī)律較為一致。微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，2種大曲各部位的微生物群落組成具有一定的差異，其中，主要的差異真菌為曲霉屬、unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬、復(fù)膜孢酵母屬、unclassified_f_Metschnikowiaceae和雙足囊菌屬；主要的差異細(xì)菌為高溫放線菌屬和葡萄球菌屬。2種大曲核心微生物的組成及其分布規(guī)律具有一定的相似性，其中，嗜熱真菌屬、高溫放線菌屬、泛菌屬和芽孢桿菌屬主要分布在大曲的坯心和包心，而芽孢桿菌屬、地霉菌屬、雙足囊菌屬、復(fù)膜孢酵母屬、伊薩酵母屬和假絲酵母屬主要分布在表層和中層。冗余分析結(jié)果表明，嗜熱真菌屬和高溫放線菌屬與酸度、還原糖和氨基酸態(tài)氮等環(huán)境因子呈正相關(guān)，而unclassified_f_Dipodascaceae、地霉菌屬和雙足囊菌屬與酸度、還原糖和氨基酸態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)；糖化力、液化力和酒化力則與芽孢桿菌屬、根毛霉屬、絲孢酵母屬、復(fù)膜孢酵母屬、伊薩酵母屬和假絲酵母屬呈正相關(guān)。

本次研究僅是初步揭示了機制與人工大曲各部位間理化生化指標(biāo)、微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性，由于樣本相對較少，還需擴大樣本數(shù)，深入分析2種大曲的品質(zhì)區(qū)別。針對大曲微生物與理化生化特性的相關(guān)性分析，主要基于數(shù)學(xué)模型進行統(tǒng)計分析，有待進一步實驗驗證。本次研究是以成品大曲為對象，而表征大曲品質(zhì)的理化生化特性與制曲過程中的微生物群落及其演替緊密聯(lián)系，因此，還需結(jié)合制曲過程微生物群落及變化規(guī)律進行深度分析。大曲中影響微生物群落分布和演替的因素眾多，還需對制曲原料、微環(huán)境條件、環(huán)境微生物等影響因素進一步研究，為成品大曲的質(zhì)量控制和提升奠定基礎(chǔ)。