汪冉，彭政，張娟

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))/未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫，214122) 3(食品合成生物技術(shù)教育部工程研究中心(江南大學(xué))/江蘇省食品合成生物技術(shù)工程研究中心，江蘇 無錫，214122)

乙醛(CH3CHO)是乙醇的代謝物，廣泛存在于眾多食品、環(huán)境[1]和過量飲酒者體內(nèi)[2]。大量的細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高劑量(40～1 000 μmol/L)的乙醛會對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生較高毒性、誘變性以及致癌性[3-4]。此外，乙醛還會毒害乙醇生產(chǎn)過程中的微生物，使其無法正常生長，繼而使乙醇產(chǎn)量降低[5-8]。世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已把乙醛列為Ⅰ類致癌物[9]。

乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)是廣泛存在于人和動物的肝臟細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞中的一種氧化還原酶，可在NAD(P)+存在的條件下催化乙醛脫氫生成乙酸[2]。目前，工業(yè)化的ALDH主要從動物的胰腺、肝臟或肝細(xì)胞線粒體中提取，由于來源少，提取難度大，產(chǎn)量較低，成本較高，因此尚未得到廣泛應(yīng)用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物ALDH來源豐富，學(xué)者們采用測定酶活性的方式獲取產(chǎn)ALDH的微生物。目前雖然已從法爾凱干酵母[12]、雪峰干酵母[13]、釀酒酵母[14]、陸生伊薩酵母[15]菌等眾多微生物細(xì)胞中提取到ALDH，但酶活性普遍較低。由于通過測定酶活性來篩選產(chǎn)ALDH的微生物這種方式工作量大且效率低，所以較難篩選到產(chǎn)高活性ALDH的微生物。醛脫氫酶抑制劑(雙硫侖)能夠通過抑制ALDH活性來抑制以乙醇為主要碳源的產(chǎn)ALDH微生物的生長，而產(chǎn)生較高活性ALDH的微生物因ALDH活性只受到部分抑制而能夠利用乙醇繼續(xù)生長。通過調(diào)整雙硫侖的濃度初步分離出一部分產(chǎn)較高活性ALDH的微生物，再以測定酶活性的方式確定最終結(jié)果，2種方法結(jié)合使用則能更高效并精確地篩選到產(chǎn)高活性ALDH的微生物菌株[5,15-18]。

本研究以雙硫侖抗性篩選結(jié)合酶活性測定的方式從葡萄樣品中篩選出產(chǎn)高活性ALDH的微生物，采用超聲波破碎法提取出ALDH并通過硫酸銨分級沉淀和DEAE-Sephacel陰離子交換層析將ALDH分離純化，研究該酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、金屬離子的影響、底物特異性和動力學(xué)，為食品和環(huán)境中的乙醛降解奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與培養(yǎng)基

樣品：無錫自然葡萄園的土壤和葡萄。

無碳培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO45，KH2PO41，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，酵母粉 0.1，121 ℃滅菌15 min[5,19]。

雙硫侖培養(yǎng)基(g/L)：無碳培養(yǎng)基，瓊脂粉20，無水乙醇20，不同濃度的雙硫侖。無水乙醇和雙硫侖試劑經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，115 ℃滅菌30 min。

1.2 主要試劑及儀器

輔酶NAD+、酵母菌通用PCR引物[NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)、NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)]，生工生物工程(上海)股份有限公司；雙硫侖，上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、40%乙醛溶液、KCl、β-巰基乙醇、(NH4)2SO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNA Marker和2×TaqDNA Polymerase，大連寶生物工程有限公司。

B00 N-900 N超聲波細(xì)胞破碎儀，上海版諾生物科技有限公司；SYNERGY/H1酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；AKTA蛋白純化儀、陰離子交換柱，美國通用電器；GC-2030AF氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 菌株的分離與篩選

1.3.1 初篩

稱取10 g葡萄園土壤和新鮮葡萄，分別制成土壤懸液和葡萄汁液，用無菌生理鹽水將兩者梯度稀釋，分別吸取100 μL,10-4、10-5和10-6稀釋度的土壤懸液和葡萄汁液涂布于含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4 mg/L雙硫侖的無碳培養(yǎng)基平板，于30 ℃培養(yǎng)4～5 d后將含最高濃度雙硫侖平板上的單菌落挑出并劃線分離，保存于YPD斜面培養(yǎng)基[5, 19]。

1.3.2 復(fù)篩

將初篩得到的菌株在YPD固體培養(yǎng)基平板上劃線活化，挑取單菌落接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，220 r/min恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)，以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h。取3 mL發(fā)酵液于8 000 r/min離心5 min后收集全部菌體，用PBS(pH 7.4)洗滌并重懸菌體后進(jìn)行超聲波破碎(開4 s，關(guān)5 s，工作時間20 min)，12 000 r/min離心3 min，取上清液測定酶活力[5]。

將Tris-HCl(pH 9.2)、輔酶NAD+、乙醛、KCl、β-巰基乙醇和超純水按照表1 ALDH活力測定體系中的添加量提前混勻，在35 ℃條件下溫浴10 min后加入ALDH，迅速使用酶標(biāo)儀檢測340 nm下吸光度值的變化量，每隔1 min讀取1次吸光度值，總反應(yīng)時間為5 min，根據(jù)每分鐘吸光度值的變化量計算出ALDH的酶活力[20]。

表1 ALDH活力測定體系Table 1 Enzyme activity assay system of ALDH

酶活力定義：在35 ℃下，1 min在340 nm下吸光度值發(fā)生0.001的數(shù)量變化定義為1個活力單位。ALDH的酶活力按公式(1)(2)計算[21]：

(1)

(2)

1.4 產(chǎn)ALDH菌株的鑒定

1.4.1 菌株菌落及細(xì)胞形態(tài)

根據(jù)產(chǎn)生菌的菌落和菌體形態(tài)、繁殖方式可以進(jìn)行菌種初步分類鑒定[5, 22]。

1.4.2 菌株ITS rRNA序列的PCR擴(kuò)增與序列測定

使用酵母ITS rRNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2×TaqDNA聚合酶12.5 μL，10 μmol/L NL1和NL4各1 μL，菌液1 μL，水9.5 μL，混勻后即離心；PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min，預(yù)變性；94 ℃ 30 s，變性；55 ℃ 30 s，退火；72 ℃ 1 min，延伸；由變性到延伸設(shè)定為34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后反應(yīng)終止[5]。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后將PCR產(chǎn)物送至上海生工測序。

1.4.3 ITS rRNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將菌株的ITS rRNA序列上傳至GenBank進(jìn)行BLAST比對，篩選出與待鑒定菌株ITS rRNA序列同源性較高的序列，利用MEGA 7.0軟件以距離矩陣法中的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[5]。

1.5 ALDH的分離純化

1.5.1 硫酸銨分級沉淀

在冰浴條件下，將粗酶液置于磁力攪拌器上，一邊攪拌一邊緩慢加入硫酸銨粉末至飽和度依次達(dá)到35%、45%、55%、60%、70%、80%，分別于4 ℃靜置2 h，10 000 r/min離心20 min后收集分級沉淀，將沉淀溶于2 mL緩沖液A(pH 7.4，含0.01 mol/L磷酸鉀緩沖液，體積分?jǐn)?shù)3%的甘油，0.1 mol/L海藻糖，1 mmol/L二硫蘇糖醇)中并在相同的緩沖液中透析脫鹽，測定沉淀中的ALDH活力和蛋白質(zhì)含量，確定使ALDH沉淀的最佳硫酸銨濃度范圍。

1.5.2 DEAE-Sephacel陰離子交換層析

DEAE-Sephacel層析柱(2.6 cm×9 cm)預(yù)先用緩沖液A平衡，柱床體積為50 mL。取10 mL經(jīng)脫鹽處理的酶液上樣于該柱，用緩沖液A和緩沖液B(緩沖液A、1 mol/L NaCl)分段洗脫，收集活性ALDH并經(jīng)緩沖液A透析脫鹽后濃縮至一定體積，經(jīng)SDS-PAGE分析后確定最佳洗脫鹽濃度。

1.6 ALDH的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 ALDH的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

為探究ALDH的最適反應(yīng)溫度，分別測定反應(yīng)體系在不同溫度(30、40、50、60、70、80、90 ℃)下的酶活力，以檢測到的最高酶活力為100%，計算各溫度下的相對酶活力。將ALDH在不同溫度下保溫120 min后，計算各溫度下的剩余酶活力，以未處理組的酶活力為100%[20]。

1.6.2 ALDH的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

為探究ALDH的最適反應(yīng)pH，將酶活力測定體系的 Tris-HCl(pH 9.2)和水替換成不同pH梯度(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的廣泛緩沖液，其他條件不變，分別測定不同pH條件下的ALDH活性，以檢測到的最高酶活力為100%，計算各pH條件下的相對酶活力。將酶液在不同pH緩沖液中保存2 h后，測定剩余酶活力，以未處理組的酶活力為100%。

1.6.3 金屬離子對ALDH的影響

向酶的反應(yīng)體系中加入濃度為5 mmol/L的金屬離子(Na+、K+、NH4+、Ca2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+)，以檢測到的最高酶活力為100%，計算ALDH的相對酶活力，以未添加金屬離子檢測到的酶活力為對照。

1.6.4 ALDH的底物特異性研究

底物特異性是在最適反應(yīng)溫度和pH條件下，將酶活力測定體系中的乙醛替換成等濃度的甲醛、丙醛、正丁醛、戊二醛、丙酮醛、苯甲醛、水楊醛，其他條件不變，分別測定乙醛脫氫酶的活力性，以檢測到的最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.6.5 酶動力學(xué)常數(shù)的測定

將乙醛稀釋成不同濃度(0.2～5.0 mmol/L)，將輔酶NAD+稀釋成不同濃度(0.1～2.0 mmol/L)，將ALDH純酶液分別加入到不同濃度底物和輔酶NAD+中，測定反應(yīng)初速，并繪制底物濃度和反應(yīng)速度，以及輔酶NAD+濃度和反應(yīng)速度之間的散點(diǎn)圖，再利用Origin 2021對各個數(shù)據(jù)點(diǎn)使用米氏方程展開非線性擬合至收斂，求得最大反應(yīng)速度(Vmax)和米氏常數(shù)(Km)，并進(jìn)一步計算催化常數(shù)Kcat及催化效率Kcat/Km[20, 23]。

1.7 乙醛降解實(shí)驗(yàn)

1.7.1 乙醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.7.2 樣品處理和頂空進(jìn)樣條件

樣品處理：將提取到的ALDH粗酶液加入到裝有酶反應(yīng)混合液[1 mol/L Tris-HCl(pH 9.2)，20 mmol/L 輔酶NAD+，100 mmol/L乙醛，3 mol/L KCl，1 mmol/L巰基乙醇]的20 mL的頂空瓶中，加水至終體積為3 mL，立即用鋁帽密封并置于35 ℃的水浴鍋反應(yīng)2 h，然后沸水浴10 min將ALDH滅活，以不加輔酶NAD+的體系為對照。

頂空進(jìn)樣條件：將裝有3 mL樣品的頂空瓶經(jīng)75 ℃水浴加熱30 min，用2 mL注射器吸取2 mL液上氣體，迅速注入氣相色譜分析乙醛含量的變化。

1.7.3 色譜操作條件

色譜分析柱：HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)；柱溫40 ℃恒溫5 min，以5 ℃/min的速度升溫至150 ℃，然后按20 ℃/min增至250 ℃，約保持2 min后結(jié)束分析；檢測器200 ℃；進(jìn)樣口200 ℃；高純N2(載氣)流速1.2 mL/min；分流比設(shè)為25∶1；H240 mL/min，空氣400 mL/min，N245 mL/min[5, 24]。

1.7.4 數(shù)據(jù)分析和處理

按上述條件檢測并根據(jù)外標(biāo)法計算樣品中的乙醛含量，設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，按公式(3)計算乙醛降解率(%)：

（4）澆筑事故處理?；炷翝沧⒅腥绯霈F(xiàn)澆筑中斷時間過長導(dǎo)致混凝土初凝或?qū)Ч鼙话纬龌炷撩娴那闆r，應(yīng)立即清除孔內(nèi)混凝土重新澆筑；如清除難度大則可在上游側(cè)增加一道混凝土防滲墻，采用高壓旋噴樁在新、舊墻端頭結(jié)合處進(jìn)行補(bǔ)強(qiáng)，確保墻體質(zhì)量。

(3)

式中：ρ0，對照反應(yīng)中的乙醛質(zhì)量濃度，mg/L；ρ，酶催化反應(yīng)結(jié)束后剩余的乙醛質(zhì)量濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ALDH菌株的篩選

由圖1可知，涂滿新鮮葡萄汁液的雙硫侖平板上生長了許多菌落，且隨著雙硫侖濃度的提高，平板上的菌落逐漸減少，直到含有4.0 mg/L雙硫侖的平板上不再有菌落生長。將含3.5 mg/L雙硫侖的平板上的單菌落劃線分離后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，由表2可知，共有6株菌產(chǎn)生較高活性的ALDH，其中菌株CT-20產(chǎn)生的ALDH活性最高，為13.26 U/mL，故選擇菌株CT-20作為下一步研究對象。

圖1 雙硫侖平板篩選產(chǎn)ALDH菌株Fig.1 Screening of ALDH-producing strains by disulfiram plates

表2 不同菌株ALDH活性Table 2 ALDH activity of different strains

2.2 菌株的初步鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

觀察菌株CT-20在YPD固體培養(yǎng)基和雙硫侖固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)，發(fā)現(xiàn)CT-20在YPD這樣營養(yǎng)充分的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后呈現(xiàn)微白色，圓形凸起狀，表面光滑且濕潤，質(zhì)地比較均一，易挑取的狀態(tài)，如圖2-a所示；在雙硫侖培養(yǎng)基這樣營養(yǎng)匱乏的惡劣條件下，菌落邊緣長出明顯的假菌絲，如圖2-b；在光學(xué)顯微鏡下，CT-20呈短卵形或球形，直徑在4～6 μm，具有典型的酵母細(xì)胞形態(tài)特征，同時可觀察出該菌較明顯的出芽生殖特征，如圖2-c所示。

a-YPD培養(yǎng)基菌落形態(tài);b-雙硫侖培養(yǎng)基菌落形態(tài);c-顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)圖2 菌株CT-20的分離與鑒定Fig.2 Isolation and identification of strain CT-20

2.2.2 菌株ITS rRNA 序列分析

對菌株CT-20的ITS rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到了全長為585 bp的基因序列，將該序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中(登錄號為OM373101)，通過BLAST檢索GenBank中的全部核酸序列并進(jìn)行分析和比對，基于ITS rRNA基因序列構(gòu)建菌株CT-20的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，該菌株與CandidatropicalisMYA-3404序列具有99.65%的相似性，結(jié)合菌株的形態(tài)特征最終判斷菌株CT-20為熱帶假絲酵母，將其命名為CandidatropicalisLBBE-W1。其產(chǎn)生的乙醛脫氫酶命名為CTALDH(Candidatropicalisaldehyde dehydrogenase)。

圖3 基于ITS rRNA序列的菌株CT-20的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain CT-20 based on ITS rRNA sequences

2.3 ALDH CTALDH的分離純化

2.3.1 硫酸銨分級沉淀

硫酸銨具有溶解度較大、溫度系數(shù)偏小、對大多數(shù)蛋白活性影響較小等特點(diǎn)，常被用于蛋白質(zhì)的初步純化。分別測定飽和度在0%～35%，35%～45%，45%～55%，55%～60%，60%～70%，70%～80%之間析出的沉淀中的CTALDH活性和蛋白含量(以粗酶液的酶活力和總蛋白質(zhì)含量為100%)，確定最佳硫酸銨鹽析范圍。由圖4-a可知，當(dāng)硫酸銨飽和度在0%～35%和35%～45%時，沉淀中顯示出很高的活性，分別達(dá)到粗酶液酶活力的31.7%和33.91%，蛋白質(zhì)含量分別為粗酶液總蛋白質(zhì)含量的4%和9%；當(dāng)硫酸銨飽和度>45%時，沉淀中的CTALDH活力僅為粗酶液酶活力的5%左右，蛋白質(zhì)含量約為粗酶液總蛋白質(zhì)含量的24%，因此選擇在0%～45%的硫酸銨飽和度下沉淀出的蛋白質(zhì)做進(jìn)一步純化。

a-硫酸銨分級沉淀中酶活力和蛋白質(zhì)含量與硫酸銨飽和度的關(guān)系;b-DEAE-陰離子交換層析SDS-PAGE分析圖4 CTALDH的分離純化Fig.4 Seperation and purification of CTALDH注：M-Marker;泳道1-CTALDH純酶；泳道2-CTALDH粗酶

2.3.2 DEAE-Sephacel陰離子交換層析

將脫鹽處理后的硫酸銨沉淀蛋白上樣于DEAE-Sephacel柱進(jìn)行陰離子交換層析，收集洗脫液，通過酶活力測定發(fā)現(xiàn)ALDH活性主要集中在0.3～0.4 mol/L NaCl梯度洗脫范圍內(nèi)，將0.4 mol/L NaCl洗脫得到的洗脫液經(jīng)3 kDa、10 kDa和30 kDa超濾管過濾并濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖4-b，泳道1中顯示出一條分子質(zhì)量約為55 kDa的單一條帶，經(jīng)計算得出CTALDH的比酶活力為181.17 U/mg，是目前報道的酶活力最高的天然ALDH(IssatchenkiaterricolaXJ-2來源)的5.8倍[11, 24]。

2.4 CTALDH的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 CTALDH的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

溫度可以通過影響酶蛋白的構(gòu)象、酶與底物、激活劑和抑制劑的親和力而影響酶的反應(yīng)速度。微生物來源的ALDH的最適反應(yīng)溫度一般在35～60 ℃[24]，由圖5-a可知，CTALDH純酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，當(dāng)溫度>80 ℃，活性急劇下降，在90 ℃時幾乎失去了全部活性。由圖5-b可知，當(dāng)溫度<50 ℃時，該酶具有較好的熱穩(wěn)定性；當(dāng)溫度為60 ℃時，僅孵育60 min酶活力便出現(xiàn)明顯降低；當(dāng)溫度>70 ℃時，酶活力則迅速降低。

a-最適反應(yīng)溫度;b-熱穩(wěn)定性圖5 溫度對CTALDH的酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity and stability of CTALDH

2.4.2 CTALDH的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

pH通過影響酶的構(gòu)象和底物的帶電狀態(tài)而影響酶和底物的親和力，繼而影響酶的催化反應(yīng)速度。由圖6-a可知，CTALDH純酶對酸性環(huán)境高度敏感，當(dāng)pH<6.0時，酶活力隨著pH值的增加而提高，但均低于50%；當(dāng)pH值達(dá)到9.0時，酶活力最高；當(dāng)pH>9.0時，酶活力迅速降低。CTALDH在弱堿性環(huán)境中活性最高，在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中迅速失活，這與大部分微生物來源的ALDH的最適反應(yīng)pH相似。由圖6-b可知，CTALDH在pH 7.0～9.0孵育120 min具有較好的穩(wěn)定性，ALDH酶活力保留了80%以上；當(dāng)pH>5.0或pH<9.0時，CTALDH迅速失去活性。

a-最適反應(yīng)pH;b-pH穩(wěn)定性圖6 pH對CTALDH的酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH value on activity and stability of CTALDH

2.4.3 金屬離子對CTALDH的影響

金屬離子通過與酶結(jié)合可以穩(wěn)定酶的最佳活性構(gòu)象，提高與底物的親和力，從而對酶活力起到激活作用，也可能影響到酶的必需基團(tuán)或活性部位而抑制酶活力[25]。由圖7可知，金屬離子Na+、K+、Ba2+對CTALDH純酶的活性具有明顯促進(jìn)作用，金屬離子Ni2+、Cu2+和Mn2+對CTALDH活性具有較強(qiáng)烈的抑制作用。

圖7 金屬離子對CTALDH的影響Fig.7 Effect of metal ions on CTALDH

2.4.4 CTALDH的底物特異性

為了考察CTALDH對底物的特異性，選擇7種底物替代乙醛進(jìn)行研究。結(jié)果如圖8所示，CTALDH對甲醛、戊二醛、水楊醛具有較低的活性，對乙醛表現(xiàn)出最高的活性，這一結(jié)果表明CTALDH具有較狹窄的底物特異性，乙醛是其最適底物。

圖8 CTALDH的底物特異性Fig.8 Substrate specificity of CTALDH

2.4.5 酶動力學(xué)常數(shù)的測定

通過酶的動力學(xué)研究，可推斷該酶促反應(yīng)的機(jī)理。Vmax值隨酶濃度的差異而改變，米氏常數(shù)Km值則是酶的另一種特性常量，它由酶反應(yīng)的固有特性而決定，并因外部條件如pH、溫度、離子強(qiáng)度等的影響而出現(xiàn)不同變化[20-21]。將純化的CTALDH添加到具有不同底物濃度(0.20～5.0 mmol/L)和不同濃度輔酶NAD+(0.10～2.00 mmol/L)的酶反應(yīng)液中，可以計算得出CTALDH作用于底物乙醛時的米氏常數(shù)Km為13.35 mmol/L、最大速度Vmax為156.36 U/mg；輔酶NAD+的米氏常數(shù)Km為1.34 mmol/L，最大速度Vmax為36.91 U/mg。CTALDH的催化常數(shù)Kcat為130.3/s，催化效率Kcat/Km為9.76 L/(mmol·s)。

2.5 乙醛降解結(jié)果

利用頂空氣相色譜測定CTALDH催化反應(yīng)后乙醛的殘余量，已知乙醛標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間為6.23 min[5]，由圖9可知，酶反應(yīng)液中的乙醛峰面積(B)與其對照(A)比較明顯減小，表明菌株C.tropicalisLBBE-W1產(chǎn)生的CTALDH具有良好的乙醛降解能力。通過乙醛標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出CTALDH對乙醛的降解效率達(dá)到95.12%，這與姚正穎[24]在E.coliJM109中表達(dá)的I.terricolaXJ-2來源的ALDH乙醛降解能力同處于較高水平。

a-空白對照乙醛峰;b-CTALDH反應(yīng)后的乙醛峰圖9 乙醛降解圖Fig.9 Acetaldehyde degradation diagram

3 結(jié)論

本研究分離到1株酵母菌株CandidatropicalisLBBE-W1，其產(chǎn)生的CTALDH活力為13.26 U/mL，比酶活力為181.17 U/mg。CTALDH的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適反應(yīng)pH為8.0～9.0。該酶在30～50 ℃和pH 5.0～9.0條件下具有較好的穩(wěn)定性。金屬離子Na+、K+、Ba2+均對CTALDH活性具有促進(jìn)作用，而Ni2+、Cu2+、Mn2+則對其具有明顯的抑制作用，乙醛是CTALDH的最適底物。CTALDH作用底物乙醛和輔酶NAD+的米氏常數(shù)Km分別為13.35 mmol/L和1.34 mmol/L、最大反應(yīng)速度Vmax分別為156.36 U/mg和36.91 U/mg；CTALDH的催化常數(shù)Kcat為130.3/s，催化效率Kcat/Km為9.76 L/(mmol·s)。CTALDH 在2 h內(nèi)乙醛降解率達(dá)到95.12%，在乙醛降解領(lǐng)域具有較大的潛力。