張漫敏，曾祥益，方利敏，徐靜宇，程新，姚明印，黃林，*

1(生物科學與工程學院，江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西農(nóng)業(yè)大學應(yīng)用微生物研究所 (江西農(nóng)業(yè)大學)，江西 南昌，330045)2(江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備重點實驗，江西 南昌，330045)

乳酸菌可產(chǎn)多種抑菌活性物質(zhì)，已被研究報道的主要有：乳酸、乙酸、苯乳酸、細菌素、reuterin、reutericyclin[1]等。細菌素是某些細菌分泌的一類具有抗菌生物活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)，它在較低濃度下具有很強的抗菌活性，且因其安全、無毒、易被人體消化，不產(chǎn)生耐藥性，添加至食品中不會對感官品質(zhì)造成影響等特性，顯示了細菌素在食品保鮮方面的巨大潛力[2-5]。目前研究最為深入的細菌素是乳酸鏈球菌素(Nisin)，它作為食品添加劑已被50多個國家授權(quán)使用，但因其抑菌譜窄、pH耐受性較差使其應(yīng)用受限[6-7]。RASHEED等[8]從發(fā)酵乳桿菌BZ532(LactobacillusfermentumBZ532)中分離出新型細菌素LF-BZ532，對多種食品病原菌具有廣譜抑菌活性。AN等[9]從植物乳桿菌M1-UVs300 (LactobacillusplantarumM1-UVs300)中分離出新型細菌素M1-UVs300，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜抗菌活性；HU等[10]分離出LactobacillusalimentariusFM-MM4細菌素對細菌及酵母菌具有廣譜抗菌活性。GAO等[11]分離到一株新型的抑菌廣譜、且對熱和低pH表現(xiàn)出抗性的Ⅱa類細菌素(GarviecinLG34)產(chǎn)生菌；辛維崗等[12]分離出細菌素LSP01，對大腸桿菌(Escherichiacoli)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等12株致病菌具有良好的抑制效果，且對熱和pH表現(xiàn)出良好抗性。

細菌素被認為是一種潛在的生物防腐劑，到目前為止，已被發(fā)現(xiàn)的細菌素有數(shù)百余種，但真正商業(yè)化的只有Nisin和pediocin PA-1，其余僅限于實驗研究[13-14]。不同細菌素抑菌效率和抑菌特性各有不同，且同一細菌素在不同條件下抑菌活性有所不同，不同的外部環(huán)境也會影響細菌素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和抑菌效果。因此，尋找新型細菌素并探究其抑菌穩(wěn)定性，對其后續(xù)研究及應(yīng)用具有極其重要的意義。

課題組此前從新鮮牛糞中分離鑒定出LactobacillusplantarumC010，并初步確定可產(chǎn)細菌素[15]。試驗在前期L.plantarumC010液體發(fā)酵工藝優(yōu)化及誘導調(diào)控作用提高細菌素產(chǎn)量研究基礎(chǔ)上[16]，采用硫酸銨沉淀法、有機試劑萃取法和pH吸附解吸法粗提L.plantarumC010所產(chǎn)細菌素，并通過Sephadex G-25、Sephadex LH-20凝膠層析結(jié)合半制備高效液相色譜進一步純化，對其結(jié)構(gòu)和理化穩(wěn)定性進行分析，以期為植物乳桿菌C010所產(chǎn)細菌素的分離提取、開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

試驗菌株：L.plantarumC010由課題組從新鮮牛糞中自行分離鑒定保存，所用培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。

指示菌：革蘭氏陰性細菌韓國假單胞菌PS1(PseudomonaskoreensisPS1)、革蘭氏陽性細菌梭狀芽孢桿菌J4(BacillusfusiformisJ4)均為課題組從腐敗冷卻豬肉中自行分離保存的特定優(yōu)勢腐敗菌株[17]，所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ半制備型液相色譜，Agilent 1260分析型高效液相色譜，中國安捷倫科技有限公司；Bruker DRX-500MHz核磁共振光譜儀，布魯克德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1L.plantarumC010發(fā)酵液的制備

將活化后的L.plantarumC010種子液以2%(體積分數(shù))的接種量接入新鮮MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期，即為L.plantarumC010發(fā)酵液。取3 000 mL發(fā)酵液于6 000 r/min離心10 min，去沉淀，保留無細胞上清液用0.22 μm無菌濾膜抽濾后于-20 ℃冷藏備用。

1.2.2L.plantarumC010產(chǎn)細菌素初步提取及比較

采用硫酸銨沉淀法、有機試劑萃取法和pH吸附解析法從L.plantarumC010發(fā)酵液中初步提取細菌素：(1)硫酸銨沉淀法：將上述上清液50 mL加入不同含量的硫酸銨中，使硫酸銨終飽和度分別為40%、50%、60%、70%、80%和90%，鹽析12 h后離心，所得沉淀用1 mL pH 6.0磷酸緩沖液溶解；(2)有機試劑萃取法：①有機試劑的選擇：將上述上清液50 mL分別與乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、甲醇、三氯甲烷以1∶1(體積比)萃取，所得萃取液于合適溫度下旋干并用1 mL pH 6.0磷酸緩沖液溶解，同時將50 mL上清液旋蒸至1 mL作為對照組；②抽提比例的優(yōu)化：選取較優(yōu)有機試劑與發(fā)酵上清液分別以1∶1、2∶1、3∶1和 4∶1 (體積比)進行萃取，所得萃取液旋干并用1 mL pH 6.0的磷酸緩沖液溶解；(3)pH吸附解析法：參照顧雅昕等[14]方法并加以修改。將上述發(fā)酵液50 mL于70 ℃水浴30 min，以殺死活性細胞及鈍化酶活力，用NaOH溶液分別調(diào)pH至5.5、5.8、6.1、6.4、6.7、7.0，磁力攪拌1 h使細菌素充分吸附在細胞膜表面，6 000 r/min離心10 min去除菌體，用pH 7.0磷酸緩沖液充分洗滌菌體，用HCl溶液將pH分別調(diào)至1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1解析1 h，離心所得上清液經(jīng)冷凍干燥得到粗提粉末，用1 mL pH 6.0磷酸緩沖液溶解；(4)粗提細菌素抑菌活性的檢測：將上述粗提品分別以P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4為指示菌，采用牛津杯雙層瓊脂擴散法測定不同處理下粗提細菌素的抑菌效果，用十字交叉法測定其抑菌圈直徑。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3L.plantarumC010產(chǎn)細菌素的分離純化

將2 mL抑菌效果較好的粗品經(jīng)0.22 μm微膜過濾，以pH 6.0磷酸緩沖液為流動相上樣于葡聚糖凝膠Sephadex G-25層析柱(直徑1.6 cm×柱高60 cm)中，自動收集各餾分，以P.koreensisPS1為指示菌測定抑菌活性，所得具有活性的餾分旋干后用80%(體積分數(shù)，下同)甲醇等體積復(fù)溶，用Sephadex LH-20層析柱(直徑1.6 cm×柱高120 cm)進一步純化，以80%色譜級甲醇為流動相，自動收集各餾分，按上述方法驗證活性后，將具有活性的餾分用紫外分光光度計在波長190～700 nm進行掃描，其最大吸收峰作為HPLC的檢測波長。

1.2.4 半制備高效液相色譜純化

將經(jīng)過Sephadex LH-20純化得到的活性組分用0.22 μm微膜過濾，用島津半制備液相LC-20AR色譜Venusil XBP C18柱進一步純化。制備條件為：A液：含0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸的水；B液：含0.1%甲酸的乙腈；上樣量0.5 mL，檢測波長215 nm，流速1 mL/min，洗脫程序為：0～20 min，流動相B 0%～60%, 20～25 min，流動相B 60%～100%，25～30 min，流動相B保持100%，收集具有抑菌活性的液相色譜洗脫組分，所得活性洗脫組分重新上樣于高效液相色譜，檢測其純度并于冷凍干燥后置于-80 ℃冰箱儲存。

1.2.5 細菌素純度及分子質(zhì)量的檢測

將半制備高效液相色譜收集得到的具有抑菌活性的組分用HPLC檢驗純度[9]。樣品經(jīng)0.22 μm微膜過濾，用安捷倫1260高效液相色譜ZORBX Eclipse Plus C18檢測，檢測條件為：A液：含0.1%(體積分數(shù)，下同)三氟乙酸的水；B液：含0.1%三氟乙酸的乙腈；上樣量0.1 mL，檢測波長215 nm，流速1 mL/min，洗脫程序為：0～20 min，流動相B 0%～60%，20～25 min，流動相B 60%～100%，25～30 min，流動相B保持100%。

1.2.6 細菌素的結(jié)構(gòu)鑒定

采用DFS快原子轟擊離子源質(zhì)譜儀對該單一活性組分進行分子量測定，電轟擊電離模式(electron ionization mass spectrometry,EI-MS)檢測，并用Bruker DRX-500MHz核磁共振光譜儀進一步解析其結(jié)構(gòu)。

1.2.7 細菌素理化穩(wěn)定性測定

熱穩(wěn)定性實驗：將提純樣品粉末用去離子水復(fù)溶后于60、80、100 ℃水浴60 min，121 ℃處理20 min，待溫度恢復(fù)至室溫檢測抑菌活性。

pH穩(wěn)定性實驗：將提純樣品粉末用去離子水復(fù)溶后，用1 mol/L HCl溶液分別將pH值調(diào)至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，并以不調(diào)pH的溶液為陰性對照，同等pH值的HCl溶液為陽性對照，37 ℃下處理測定其抑菌活性。

酶解穩(wěn)定性實驗：將提純樣品粉末用去離子水復(fù)溶后調(diào)至胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶K等的最適pH，加入終質(zhì)量濃度為2 mg/mL的酶，于最適溫度下反應(yīng)2 h，調(diào)回pH檢測抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.plantarum C010產(chǎn)細菌素的粗提結(jié)果

試驗采用3種不同方法對L.plantarumC010產(chǎn)細菌素進行粗提，通過雙層瓊脂平板擴散法以冷卻豬肉特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4為指示菌進行抑菌活性檢測。

由表1、表2可知，在硫酸銨鹽析法中，隨著溶解度的升高，抑菌效果增強，在飽和度為80%時抑菌效果最佳。在有機試劑萃取法中，乙酸乙酯和正丁醇提取活性物質(zhì)對特定致腐菌P.koreensisPS1、B.fusiformisJ4的抑菌效果接近于上清濃縮液，顯著高于甲醇、乙醇和三氯甲烷。但正丁醇沸點大于乙酸乙酯，不利于后期有機試劑的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，之后進一步將乙酸乙酯和發(fā)酵上清液按不同體積比進行萃取。V(乙酸乙酯)∶V(上清液)=4∶1時，提取的活性物質(zhì)抑菌效果最佳。乙酸乙酯萃取時會伴隨棕褐色物質(zhì)的聚沉，推測為雜質(zhì)蛋白，但不影響對該細菌素的萃取，萃取效率較高。

表1 L.plantarum C010發(fā)酵液硫酸銨和有機試劑提取細菌素的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of bacteriocin from L.plantarum C010 by saturated ammonium sulfate and ethyl acetate extraction

如表2所示，在吸附解析中，利用單因素變量法優(yōu)化吸附和解析pH時，當吸附pH為6.7、解析pH為1.8時提取活性物質(zhì)抑菌效果最佳，但該法提取效率仍低于乙酸乙酯萃取法。因此，在L.plantarumC010發(fā)酵上清液細菌素提取中，乙酸乙酯萃取優(yōu)于pH吸附解析和硫酸銨沉淀法。DüNDAR等[18]對屎腸球菌(Enterococcusfaecium) W3細菌素提取過程中，pH吸附解吸法得到的樣品活性為原上清液活性的16%，約是硫酸銨沉淀法的4倍。顧雅昕等[14]對發(fā)酵乳桿菌LBM97所產(chǎn)細菌素提取進行比較，發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法均能獲得目的蛋白，且pH吸附解吸法得到的細菌素樣品表現(xiàn)出最穩(wěn)定的抑菌活性。可見不同菌種發(fā)酵液中細菌素的適宜提取方法存在差異，這可能與細菌種屬以及存在環(huán)境的差異有關(guān)，也可能與細菌素本身的理化性質(zhì)如分子質(zhì)量大小、親疏水性等的差異有關(guān)。

表2 L.plantarum C010發(fā)酵液pH吸附解析提取細菌素抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of bacteriocin from L.plantarum C010 by pH adsorption/desorption

2.2 L.plantarum C010產(chǎn)細菌素的凝膠層析

發(fā)酵上清液經(jīng)乙酸乙酯萃取后，經(jīng)Sephadex G-25凝膠得到的各餾分對特定致腐菌P.koreensisPS1進行抑菌活性檢測，在22～26管收集液中具有明顯的抑菌活性(圖1-a)；將這些收集液合并再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠層析，測得第17～22管之間的層析組分液均具有較強抑菌活性(圖1-b)。該抑菌活性組分液在波長215 nm處有明顯的紫外吸收峰，故選取215 nm作為高效液相色譜純化檢測波長。

a-G-25層析洗脫曲線；b-LH-20層析洗脫曲線圖1 Sephadex層析曲線Fig.1 The elution curve of Sephadex

2.3 L.plantarum C010產(chǎn)細菌素的半制備高效液相色譜純化

反相高效液相色譜是純化細菌素的高效方法，據(jù)前人[8,19-20]報道采用該方法純化得到了細菌素。由圖2可知，在L.plantarumC010發(fā)酵上清液抑菌活性組分液中仍存在多種物質(zhì)，但僅在5.894 min的收集液具有較強抑菌活性，其對特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4抑菌圈直徑分別為15.12和18.46 mm，故選擇該組分進行下一步純化。

圖2 L.plantarum C010抑菌活性組分的半制備高效液相色譜圖Fig.2 Semi-preparative HPLC graph of antibacterial active components from L.plantarum C010

2.4 L.plantarum C010產(chǎn)細菌素的純度及分子質(zhì)量檢測

將經(jīng)半制備高效液相色譜純化得到的抑菌活性組分液經(jīng)HPLC檢驗純度達90%以上，將上述純化得到的單一抑菌活性組分物質(zhì)經(jīng)EI質(zhì)譜分析，得出該組分物質(zhì)分子質(zhì)量為260.116 1 Da(圖3)。

核磁共振圖譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)分析數(shù)據(jù)如下：1H NMR (500 MHz, Methanol-d4) δ 7.34～7.17 (m,5H),4.48 (td,J=5.1,1.9 Hz,1H),4.36 (ddd,J=11.7,5.9,1.9 Hz,1H),4.27 (t,J=4.8 Hz,1H),3.79～3.64 (m,1H),3.16 (t,J=4.6 Hz,2H),2.10～2.01 (m,1H),1.36 (ddd,J=12.9,11.7,4.6 Hz,1H),1.04～0.87 (m,1H).13C NMR (126 MHz,MeOD) δ 171.24,167.08,137.38,131.00,129.46,128.06,68.51,58.32,57.59,55.23,38.86,37.98。結(jié)合NMR譜推測分子式為C14H16N2O3。經(jīng)查閱，該核磁共振圖譜與文獻[21]基本一致，該化合物鑒定為環(huán)(L-苯丙氨酰-反式-4-羥基-L-脯氨酸[Cyclo(L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro])二肽[22]，命名為細菌素Plantarum C010。按分子質(zhì)量大小可以將其劃分為Ⅰ類細菌素。該細菌素雖然早在2000年被發(fā)現(xiàn)[23]，但是關(guān)于它的抑菌活性的研究較少；常見于內(nèi)生放線菌、分歧桿菌、鏈霉菌等菌屬中[21]，但首次從乳酸菌屬中分離提取得到該物質(zhì)。如ERAM等[24]明確指出Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽具有抑菌活性，但未做深入研究。KHALIL等[25]從澳大利亞淺水海灘的細菌中得到該物質(zhì)，且具有抑真菌活性。LEE等[26]從海洋細菌灰鏈霉菌中提取的該物質(zhì)具有抗HL-60癌細胞活性。

a-EI質(zhì)譜圖；b-核磁共振1H譜圖；c-結(jié)構(gòu)式圖3 L.plantarum C010細菌素EI質(zhì)譜圖、1H NMR圖譜及化學結(jié)構(gòu)式Fig.3 EI mass spectra, 1H NMR spectrum and chemical structural formula of bacteriocin from L.plantarum C010

2.5 細菌素Plantarum C010理化穩(wěn)定性分析結(jié)果

目前，已關(guān)于Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽的研究報道，其理化穩(wěn)定性的研究甚少，且不同細菌素抑菌效率和抑菌特性各有不同，同一細菌素在不同條件下抑菌活性也有所不同，不同外部環(huán)境也會影響細菌素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和抑菌效果。故細菌素的抑菌穩(wěn)定性在很大程度上決定了其實際應(yīng)用價值。因此，探究細菌素在環(huán)境中的穩(wěn)定性對其后續(xù)研究及應(yīng)用具有極其重要的意義。

表3結(jié)果表明，細菌素Plantarum C010在不同溫度處理下對B.fusiformisJ4抑菌活性沒有表現(xiàn)出顯著性差異，而在121 ℃處理20 min條件下對P.koreensisPS1抑菌活性略有下降，但相較于CK組仍然保持95%以上抑菌活性，說明該細菌素具有較強的耐熱穩(wěn)定性。

表3 L.plantarum C010產(chǎn)細菌素抑菌穩(wěn)定性Table 3 Bacteriostatic stability of bacteriocin from L.plantarum C010

在細菌素耐受pH試驗中，同等pH下的鹽酸對P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4均沒有抑菌活性，說明不是酸引起的抑菌作用，而是細菌素產(chǎn)生的抑菌效果。由表3可知，在pH為3.0～5.5時，細菌素具有較強抑菌活性，當pH在5.0～6.0時，抑菌活性顯著減弱甚至失活。

在細菌素酶解試驗中，利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶K分別處理純化后的細菌素，對P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4抑菌活性均無明顯改變(表3)。這與EL-GENDY等[27]所研究的細菌素enterocin OS13β一樣耐高溫和具有多重酶等特性，說明該細菌素不具有大分子蛋白質(zhì)屬性，或者說是一種不具有某些特異性酶切位點的小肽類化學物質(zhì)。

綜上所述，本研究從植物乳桿菌C010發(fā)酵上清液中分離純化的細菌素Plantarum C010，具有較好的熱穩(wěn)定性，這可能與Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽的環(huán)形結(jié)構(gòu)有關(guān)，使其相對于簡單二肽類化合物的穩(wěn)定性更強。其次，當pH>5.5時，環(huán)二肽失活可能由于羥脯氨酸中的羧基發(fā)生化學反應(yīng)形成酯，導致二肽的環(huán)型結(jié)構(gòu)被破壞，活性相應(yīng)降低甚至失活。此外，與近年來的新型小分子肽細菌素[8-12]相比，該Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽細菌素對上述6種酶均具有較強的耐受性，也使其具有更好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究采用3種不同提取方法對L.plantarumC010所產(chǎn)細菌素的提取效果進行比對分析，提取效率為：乙酸乙酯>吸附解析>硫酸銨鹽析；采用“三步法”分離純化L.plantarumC010細菌素：乙酸乙酯萃取、Sephadex凝膠層析、半制備高效液相色譜，獲得單一抑菌活性組分物質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振解析發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)是分子質(zhì)量為260.116 1 Da的Cyclo (L-Phe-trans-4-hydroxy-L-Pro)二肽類化合物，命名為細菌素Plantarum C010，并首次發(fā)現(xiàn)于植物乳桿菌屬。目前，該細菌素的抗菌特性研究較少，僅證實了對真菌和癌細胞有抑制作用。本研究證實了該細菌素對革蘭氏陽性細菌B.fusiformisJ4和革蘭氏陰性細菌P.koreensisPS1均具有較強的抑制活性，且耐熱性強，在121 ℃處理20 min對特定致腐菌P.koreensisPS1和B.fusiformisJ4抑菌活性仍為96.57%和101.5%；該細菌素在pH 3.0～5.0時，具有較強抑菌活性，但在pH>5.0時抑菌活性顯著下降甚至失活；經(jīng)過氧化氫酶、脂肪酶、淀粉酶及蛋白酶等處理該細菌素抑菌活性無明顯改變。該結(jié)果豐富了植物乳桿菌所產(chǎn)抗菌活性產(chǎn)物的多樣性，同時，為L.plantarumC010所產(chǎn)細菌素的分離純化及保鮮應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。