董柯清，王雷立，劉青青，張嚴(yán)玲，王翠玲

(河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471023)

生物對(duì)晝夜交替中日照時(shí)間長(zhǎng)短的周期性變化的響應(yīng)被稱為光周期現(xiàn)象，普遍存在于動(dòng)植物中。光周期途徑是植物開(kāi)花的主要途徑之一，生物鐘是光周期途徑傳遞信號(hào)的重要一環(huán)[1-3]。中央振蕩器是生物鐘的核心部分，由LHY(late elongated hypocoty1)、CCA1(circadian clock associated 1)和偽應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白家族(pseudo-response regulators，PRRs) 構(gòu)成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)組成[4-5]，不僅能對(duì)從輸入途徑中傳遞的不同信號(hào)進(jìn)行加工處理，還能經(jīng)過(guò)一系列的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在保持自身的生物節(jié)律的同時(shí)，將節(jié)律輸出給下游的節(jié)律調(diào)節(jié)基因GI等[6-7]。PRR基因家族作為生物鐘中央振蕩器的主要組成部分，在生物鐘系統(tǒng)中起著重要作用，目前擬南芥中共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)PRRs成員，分別命名為PRR1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9，其中PRR1又被稱為TOC1(timing of cab expression 1)[8-9]。

TOC1在結(jié)構(gòu)上有PRR家族均含有的REC和CCT結(jié)構(gòu)域[10]，但是沒(méi)有PRR5、PRR7和PRR9的EAR結(jié)構(gòu)域，因此其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的機(jī)制與其他PRR家族成員不同[11]。研究發(fā)現(xiàn)TOC1與LHY和CCA1構(gòu)成了中央振蕩器的核心負(fù)反饋調(diào)控環(huán)，在這個(gè)負(fù)反饋調(diào)控環(huán)中TOC1的表達(dá)量達(dá)到最高時(shí)CCA1/LHY能抑制TOC1的表達(dá)，而當(dāng)CCA1/LHY表達(dá)量最高時(shí)TOC1又可以抑制CCA1/LHY的表達(dá)[12-15]。PRR家族成員在相互調(diào)控下呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)，TOC1在黃昏后1～3 h達(dá)到表達(dá)高峰[8]。其作為生物鐘重要的晚間表達(dá)基因，隨著夜間蛋白質(zhì)含量增加，還能夠抑制從早上到晚上表達(dá)的生物鐘基因[16-17]。目前在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中研究發(fā)現(xiàn)TOC1參與生物鐘循環(huán)并調(diào)控其下游基因表達(dá)[18-20]，能抑制PIFs介導(dǎo)的下胚軸伸長(zhǎng)[20-22]，還與響應(yīng)冷脅迫有關(guān)[22]。除此之外，水稻(Oryzasativa)中的TOC1也有相應(yīng)冷脅迫的功能[23]，還發(fā)現(xiàn)OsTOC1有抗旱相關(guān)作用[24]。大豆(Glycinemax)中PRR1參與調(diào)控ABA信號(hào)及氣孔孔徑和非生物逆境反應(yīng)等[25]。目前關(guān)于TOC1的研究主要集中在擬南芥和水稻中，其在玉米中的功能及調(diào)控關(guān)系還不清晰。通過(guò)全基因組鑒定發(fā)現(xiàn)玉米中存在2個(gè)PRR1的同源基因，將其命名為ZmPRR1-1和ZmPRR1-2[26]，其中前人克隆研究了ZmTOC1[27]，經(jīng)鑒定該基因?yàn)閆mPRR1-1，關(guān)于ZmPRR1-2至今還無(wú)相關(guān)研究。

本研究以玉米骨干自交系‘黃早4’(HZ4)為材料，克隆了ZmPRR1-2基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)規(guī)律分析，以期為揭示玉米生物鐘基因ZmPRR1-2在玉米光周期反應(yīng)途徑中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

本研究所用試驗(yàn)材料為玉米自交系‘黃早4’，種植于河南科技大學(xué)人工氣候室中，在玉米苗期選取長(zhǎng)勢(shì)良好的幼嫩葉片組織提取RNA進(jìn)行基因克隆。在玉米吐絲期，選取3株長(zhǎng)勢(shì)一致的玉米分別取其根、莖、葉、花絲、未授粉果穗、葉耳、葉鞘及雄穗等組織，經(jīng)過(guò)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中，用于進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。晝夜節(jié)律表達(dá)分析所用的玉米材料分別種植于人工氣候室的長(zhǎng)、短日照處理室中，短日照條件為9 h光照/15 h黑暗，長(zhǎng)日照條件為15 h光照/9 h黑暗，溫度控制為(28±2)℃，相對(duì)濕度為40%～60%。前期試驗(yàn)顯示‘黃早4’光周期誘導(dǎo)期是6～9葉期，本試驗(yàn)選擇在第8片葉完全展開(kāi)時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3株玉米植株，從光照開(kāi)始時(shí)采集葉片，每隔3 h取1次，每次約0.1 g，連續(xù)取樣48 h，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葉片經(jīng)過(guò)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成采用TRIzol法提取玉米‘黃早4’的葉片及其他不同組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(TaKaRa，中國(guó)大連)進(jìn)行，具體步驟參照說(shuō)明書，用于qRT-PCR試驗(yàn)的樣品所反轉(zhuǎn)錄的RNA量為1 μg。

1.2.2ZmPRR1-2基因的克隆使用Primer Premier 6.0軟件以已公布的玉米參考基因組B73序列(Zm00001d017241_T001)為模板設(shè)計(jì)獲得特異性引物(表1)。用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行ZmPRR1-2基因的cDNA克隆。PCR反應(yīng)體系為：KOD OneTMPCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各1.5 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火5 s，68 ℃延伸11 s，37個(gè)循環(huán)；最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將符合要求的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 特異性引物信息表Table 1 Specific primer sequences

1.2.3 生物信息學(xué)分析運(yùn)用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸的理化性質(zhì)，利用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對(duì)ZmPRR1-2基因編碼氨基酸序列進(jìn)行保守motif分析，利用NetPhos3.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)在線軟件進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用NPS@:HNN (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和Plant-mPLocserver(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，利用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽分析，利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)CDD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)分析保守結(jié)構(gòu)域。應(yīng)用MEGA7.0軟件鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1.2.4 組織特異性及節(jié)律表達(dá)分析分別提取各個(gè)樣本的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行ZmPRR1-2基因的組織特異性和節(jié)律表達(dá)分析，內(nèi)參基因?yàn)閁biquitin，qRT-PCR試驗(yàn)所用特異引物具體信息見(jiàn)表1。用熒光定量 PCR 試劑盒(全式金，北京)進(jìn)行試驗(yàn)，反應(yīng)總體積為20 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，cDNA模板1 μL，無(wú)核酸酶水8 μL，2×PerfectStart Green qPCR Super Mix 10 μL。q RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理均進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)及3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，得出的數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmPRR1-2基因的克隆及序列比對(duì)

cDNA的擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)測(cè)片段大小一致(圖1)，克隆得到的cDNA含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，ZmPRR1-2基因CDS序列長(zhǎng)度為1 554 bp，含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，共編碼517個(gè)氨基酸。比對(duì)發(fā)現(xiàn)ZmPRR1-2基因在‘黃早4’和B73中CDS區(qū)域大小相同，但是存在14處單堿基的差異，最終由于密碼子的簡(jiǎn)并性造成2個(gè)玉米材料的ZmPRR1-2蛋白共有7個(gè)氨基酸不同。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZmPRR1-2基因所編碼的氨基酸序列含有1個(gè)REC結(jié)構(gòu)域和1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，分別在氨基酸序列的第30～133個(gè)氨基酸區(qū)域及第442～483個(gè)氨基酸區(qū)域，REC結(jié)構(gòu)域與CCT結(jié)構(gòu)域之間的部分為IR(internal region)區(qū)域。結(jié)合氨基酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘黃早4’和B73的ZmPRR1-2氨基酸序列在REC結(jié)構(gòu)域中序列完全一致，高度保守，但在IR區(qū)域中有5個(gè)氨基酸的差異，在CCT結(jié)構(gòu)域中有1個(gè)氨基酸的差異(圖2)。

M.Marker；H4.Huangzao 4圖1 ZmPRR1-2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of ZmPRR1-2 gene

圖2 玉米自交系‘黃早4’和B73中ZmPRR1-2氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of ZmPRR1-2 proteins in ‘Huangzao 4’ and B73

2.2 ZmPRR1-2蛋白的理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用在線軟件ExPAsy對(duì)ZmPRR1-2基因所編碼的氨基酸進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，‘黃早4’中ZmPRR1-2基因所編碼517個(gè)氨基酸，分子式為C2473H3910N734O796S29，總平均親水性系數(shù)為-0.603，屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為49.45，屬于不穩(wěn)定蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為57.59 kD，理論等電點(diǎn)為6.41。ZmPRR1-2蛋白中相對(duì)較多的氨基酸是絲氨酸(Ser，S)，占比11.6%，色氨酸(Trp，W)含量最少僅占0.8%(表2)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白主要以無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為主體結(jié)構(gòu)，分別含有23.21%的α-螺旋、59.96%的無(wú)規(guī)則卷曲、13.35%的延伸鏈以及3.48%的β折疊。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核內(nèi)，信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明ZmPRR1-2蛋白不包含跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ZmPRR1-2蛋白共有55處磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(Ser，S)為最多(38個(gè))，占比69.09%，蘇氨酸(Thr，T)次之(14個(gè))，酪氨酸(Tyr，Y)最少(3個(gè))，該結(jié)果也符合在真核生物中磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸上這一結(jié)論[28]。

表2 ZmPRR1-2蛋白中的20種氨基酸含量表Table 2 The list of 20 amino acids in ZmPRR1-2 protein

2.3 多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

以本試驗(yàn)克隆所得的氨基酸序列為模板，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源比對(duì)，將所得結(jié)果篩選后進(jìn)行序列比對(duì)，PRR1蛋白在多個(gè)物種中的2個(gè)重要保守結(jié)構(gòu)域REC和CCT的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果(圖3)顯示，PRR1蛋白的REC和CCT結(jié)構(gòu)域在不同物種中相對(duì)保守，特別是禾本科物種的PRR1蛋白保守性非常高。進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，玉米ZmPRR1-2基因與同屬于禾本科黍亞科的高梁PRR1(Sorghumbicolor，XP_002452462.1)親緣關(guān)系最近(89.89%)，并且與谷子(Setariaitalica，XP_004953120.1)、水稻(Oryzasativa，BAD38854.1)、大麥(Hordeumvulgare，AEW48242.1)等禾本科作物處于同一進(jìn)化分支中，表明PRR1基因進(jìn)化過(guò)程中在禾本科內(nèi)相對(duì)保守，而與雙子葉植物擬南芥(Arabidopsisthaliana,Q9LKL2.1)，及油棕(Elaeisguineensis，XP_010943377.1)、椰子(Cocosnucifera，EHA8587847.1)等棕櫚科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

A.REC結(jié)構(gòu)域的保守序列；B.CCT結(jié)構(gòu)域的保守序列；Zm.玉米;Td.野生二粒小麥;Sb.高粱;Ph.黍;Si.谷子;La.高羊茅;Bt.馬甲竹;Tu.烏拉爾圖小麥;Hv.大麥;At.擬南芥;Zo.姜;Ma.小果野蕉;Ao.石刁柏;Ac.鳳梨;Pd.海棗;Eg.油棕;Cn.椰子;Os.水稻;Pm.糜子;Bd.二穗短柄草圖3 ZmPRR1-2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)A.Conserved sequence of REC domain;B.Conserved sequence of CCT domain;Zm.Zea mays;Td.Triticum dicoccoides;Sb.Sorghum bicolor;Ph.Panicum hallii;Si.Setaria italica;La.Lolium arundinaceum;Bt.Bambusa tulda;Tu.Triticum urartu;Hv.Hordeum vulgare subsp.vulgare;At.Arabidopsis thaliana;Zo.Zingiber officinale;Ma.Musa acuminata subsp.malaccensis;Ao.Asparagus officinalis;Ac.Ananas comosus;Pd.Phoenix dactylifera;Eg.Elaeis guineensis;Cn.Cocos nucifera;Os.Oryza sativa;Pm.Panicum miliaceum;Bd.Brachypodium distachyonFig.3 Multiple sequence alignment of conserved domain of ZmPRR1-2 and other PRR1-2

圖4 ZmPRR1-2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of protein sequences of ZmPRR1-2 and other PRR1-2

2.4 不同組織表達(dá)分析

不同組織的表達(dá)分析結(jié)果(圖5)顯示：在玉米‘黃早4’植株的根、莖、葉、花絲、果穗、葉耳、葉鞘及雄穗這8個(gè)組織部位中，ZmPRR1-2基因的相對(duì)表達(dá)水平在葉片中最高，并顯著高于其他7個(gè)組織，在果穗和花絲相對(duì)較低，且顯著低于雄穗，推測(cè)玉米中ZmPRR1-2基因主要在葉片中進(jìn)行表達(dá)并發(fā)揮功能，參與玉米光周期調(diào)控，并且該基因在玉米開(kāi)花轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)雄穗發(fā)育和雌穗發(fā)育的調(diào)控功能存在差異。

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)圖5 玉米 ZmPRR1-2基因的組織特異性表達(dá)分析Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.5 Tissue-specific expression analysis of ZmPRR1-2 gene

2.5 晝夜節(jié)律表達(dá)分析

對(duì)長(zhǎng)/短日照條件下玉米‘黃早4’的ZmPRR1-2基因進(jìn)行連續(xù)48 h的表達(dá)分析，結(jié)果(圖6)表明，ZmPRR1-2基因在兩種日照條件下均具有以24 h為一個(gè)周期的節(jié)律性表達(dá)規(guī)律。且在兩種光照條件下，在光照起始時(shí)分ZmPRR1-2的相對(duì)表達(dá)水平較低。短日照條件下于光照后3 h起始ZmPRR1-2基因的表達(dá)，在光照后12 h或黑暗后3 h達(dá)到表達(dá)高峰；長(zhǎng)日照條件下在光照后6 h起始該基因的表達(dá)，于光照后15 h或光照剛剛結(jié)束時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，這也使得ZmPRR1-2基因的表達(dá)高峰在長(zhǎng)/短日照處理下相差3 h(圖6)。該結(jié)果與前人對(duì)ZmPRR1-1的研究結(jié)論相一致[27]。

橫坐標(biāo)的實(shí)心方框顯示黑暗處理時(shí)長(zhǎng)，空心方框?yàn)楣庹仗幚頃r(shí)長(zhǎng)圖6 玉米ZmPRR1-2基因的晝夜節(jié)律表達(dá)分析The solid box portion of the abscissa means the time that are dark,and the hollow box portion is lightedFig.6 Circadian rhythm expression of ZmPRR1-2 gene

3 討 論

植物生長(zhǎng)發(fā)育受到生物鐘的嚴(yán)密調(diào)控，PRRs家族基因是生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分中央振蕩器的核心組成部分，PRR1(TOC1)作為PRRs基因家族最重要的成員，與MYB家族成員LHY和CCA1組成中央振蕩器的核心負(fù)反饋環(huán)，是中心反饋環(huán)的關(guān)鍵組成要件，在植物光周期調(diào)控開(kāi)花途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[29]。在擬南芥中，CCA1和LHY在清晨時(shí)由光激活表達(dá)，在黎明時(shí)表達(dá)量最高，LHY和CCA1蛋白與TOC1啟動(dòng)子的黑夜元件(AAATATCT)相結(jié)合從而抑制TOC1在白天表達(dá)。隨后，早晨環(huán)中PRR9的表達(dá)由于TOC1被抑制而得到解除，PRR9/PRR7/PRR5依次積累，極大地抑制了CCA1的表達(dá)，隨著CCA1/LHY表達(dá)水平的下降，從而可解除對(duì)TOC1基因表達(dá)的抑制作用，TOC1表達(dá)量逐漸升高，傍晚表達(dá)量達(dá)到峰值[4,6]。TOC1基因表達(dá)量過(guò)高或過(guò)低時(shí)，會(huì)造成生物鐘周期變短或延長(zhǎng)，TOC1過(guò)量表達(dá)的突變體中生物鐘紊亂，表明TOC1的節(jié)律表達(dá)和蛋白豐度對(duì)于維持生物鐘的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用，TOC1基因表達(dá)節(jié)律失衡會(huì)造成植物細(xì)胞周期紊亂、開(kāi)花時(shí)間異常、甚至影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[30-31]。本研究中玉米ZmPRR1-2基因的晝夜節(jié)律表達(dá)規(guī)律與擬南芥TOC1基因的表達(dá)高度一致，在光照開(kāi)始時(shí)，由于CCA1和LHY蛋白對(duì)ZmPRR1-2基因的抑制作用，ZmPRR1-2基因的表達(dá)水平非常低。ZmPRR1-2蛋白的減少解除了其對(duì)PRR9基因的抑制作用，隨著PRR9蛋白的增加，反過(guò)來(lái)抑制了ZmCCA1基因的表達(dá)，因而逐漸解除了CCA1對(duì)ZmPRR1-2基因的抑制作用，ZmPRR1-2基因的表達(dá)量逐漸增加。本研究中在短日照條件下于光照開(kāi)始3 h后ZmPRR1-2基因的表達(dá)量開(kāi)始逐漸上升，而長(zhǎng)日照條件下在光照開(kāi)始6 h后ZmPRR1-2基因的表達(dá)量才開(kāi)始逐漸上升，表明光周期的長(zhǎng)短對(duì)解除CCA1對(duì)ZmPRR1-2基因的抑制作用有重要影響，至于是光照時(shí)間還是黑暗時(shí)間發(fā)揮更為重要的作用，需要進(jìn)一步探索。韋小敏試驗(yàn)結(jié)果表明暗間斷能提高ZmCCA1、ZmGI基因的表達(dá)量，而降低ZmCN8和hd6的表達(dá)水平[32]。因此可以推測(cè)長(zhǎng)日照條件下相對(duì)較長(zhǎng)的光照時(shí)間有利于ZmCCA1的表達(dá)，故而延長(zhǎng)了其對(duì)ZmPRR1-2基因的抑制作用，以致于ZmPRR1-2基因的表達(dá)起始時(shí)間比短日照下推遲了3 h，進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證這一假說(shuō)將是一個(gè)非常有意義的研究課題。

同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，玉米中ZmPRR1-2基因與高粱、水稻、烏拉爾圖小麥等禾本科植物親緣關(guān)系較近，序列一致性非常高，但是與這些作物不同的是，在玉米中PRR1基因的同源基因有2個(gè)，分別是ZmPRR1-1和ZmPRR1-2，分別位于第4和第5染色體，推測(cè)原因可能與玉米基因組在與高粱分化后，大約5～1 200萬(wàn)年前經(jīng)歷的一次四倍體化事件有關(guān)，玉米的四倍體化的歷史導(dǎo)致玉米基因組中直系同源基因的數(shù)量明顯高于其近緣系高粱和蜀黍族的其他核心作物[8,26]。生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生物鐘相關(guān)基因節(jié)律表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中維持平衡，從而保持其功能的穩(wěn)定性，如果這2個(gè)基因均在晝夜節(jié)律網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，則玉米生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能會(huì)變得更加復(fù)雜。那么ZmPRR1-1和ZmPRR1-2是否會(huì)出現(xiàn)功能分化或者功能冗余？它們?nèi)绾螀⑴c玉米生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，仍有待闡明。

LHY和CCA1蛋白對(duì)TOC1基因的抑制作用的分子機(jī)制已經(jīng)闡述的非常清楚[13]。然而關(guān)于TOC1對(duì)CCA1和LHY的抑制作用的分子機(jī)制，至今尚不明晰。與其他PRR家族成員不同的是，PRR9、PRR7和PRR5蛋白能通過(guò)其EAR結(jié)構(gòu)域與TOPLESS和HDA6(histone deacetylase 6)形成一個(gè)復(fù)合體，結(jié)合到CCA1和LHY的啟動(dòng)子上抑制其轉(zhuǎn)錄，而TOC1沒(méi)有EAR結(jié)構(gòu)域，不能直接與CCA1的啟動(dòng)子結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄[11]。本研究結(jié)果表明ZmPRR1-2蛋白含有REC和CCT兩個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，符合其作為PRR家族成員的基本結(jié)構(gòu)特征，而其IR區(qū)間與擬南芥TOC1一樣不含有其他家族成員所共有的重要基序EAR-motif[20]。Pruneda-Paz等[15]的研究表明TOC1可以與TCP轉(zhuǎn)錄因子CHE(CCA1 hiking expedition)互作，而CHE能結(jié)合到CCA1的啟動(dòng)子的TBS位點(diǎn)(GGTCCCAC)，從而抑制CCA1的表達(dá)。又有研究表明TOC1可通過(guò)其CCT結(jié)構(gòu)域的T1ME元件(TGTG)直接結(jié)合到CCA1和LHY的啟動(dòng)子上從而抑制二者的轉(zhuǎn)錄[20]。由此可見(jiàn)，TOC1對(duì)CCA1和LHY的抑制作用的分子機(jī)制非常復(fù)雜，到底ZmPRR1-2是否能通過(guò)其CCT結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合到ZmCCA1和ZmLHY的啟動(dòng)子上，抑或是通過(guò)與CHE蛋白的互作間接地結(jié)合到ZmCCA1和ZmLHY的啟動(dòng)子上，從而抑制其表達(dá)，需要進(jìn)一步深入研究。而且，玉米中存在ZmPRR1-1和ZmPRR1-2兩個(gè)TOC1的同源基因，使得問(wèn)題更為復(fù)雜，這兩個(gè)基因如何與CCA1和LHY相互抑制是玉米生物鐘調(diào)控機(jī)制研究中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

綜上所述，本研究以玉米自交系‘黃早4’為試驗(yàn)材料,擴(kuò)增獲得玉米PRR家族轉(zhuǎn)錄因子ZmPRR1-2,并分析了其組織性特異表達(dá)特征和不同光周期環(huán)境下的晝夜表達(dá)規(guī)律，初步驗(yàn)證了其晝夜節(jié)律表達(dá)節(jié)律與擬南芥TOC1高度一致，推測(cè)其在玉米光周期調(diào)控開(kāi)花途徑中發(fā)揮重要作用，為揭示其在玉米生物鐘中的分子功能奠定了基礎(chǔ)，但是ZmPRR1-2與CCA1和LHY的相互反饋抑制調(diào)控的分子機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。