蔣寶鑫，汪慶昊，楊國(guó)霞，賈永紅，謝曉鴻，吳月燕*

(1 浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100；2 浙江萬(wàn)里學(xué)院 設(shè)計(jì)與建筑學(xué)院，浙江寧波 315100)

大多數(shù)杜鵑花(Rhododendron)屬于觀賞性花卉，具有重要的生態(tài)影響、觀賞和藥用價(jià)值，廣泛分布于亞洲、北美和西歐。杜鵑花是中國(guó)特有的觀賞性花卉品種之一，其花色艷麗，以滿足花卉市場(chǎng)的需要[1-3]，因此，培育不同花色的杜鵑花品種是目前研究的熱點(diǎn)。影響杜鵑花花色的主要是花青素和黃烷醇，花青素是花卉顏色的重要色素，決定了園藝植物的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。尤其是花青素成分(即矢車菊素、飛燕草素、錦葵素、天竺葵素、牡丹素和矮牽牛素等)的組成，它們的數(shù)量決定了花瓣從淺色到深色的花色變化[5]。因此，了解花青素合成途徑中相關(guān)基因的合成以及花青素合成途徑中關(guān)鍵基因?qū)ɑ芷焚|(zhì)的作用具有重要意義。

二氫黃酮醇-4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)作為花青素生物合成中的關(guān)鍵酶，在花青素合成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6]。該酶通過(guò)還原3種無(wú)色、相應(yīng)的二氫黃酮醇(二氫山奈酚DHK、二氫槲皮素DHQ和二氫楊梅素DHM)催化黃烷-3，4-二醇(亮花青素)的產(chǎn)生，這也是黃酮醇合成反應(yīng)的中間體[7]。DFR以NADPH為輔助因子，催化二氫黃酮醇還原成各自的亮花青素，這些是花青素和原花青素生物合成的常見(jiàn)前體。無(wú)色不穩(wěn)定的亮花青素是合成花青素的直接前體，是花瓣和果實(shí)中主要的水溶性色素。它們也是兒茶素和原花青素的前體，參與植物抗病性，也影響植物產(chǎn)品的質(zhì)量[8-10]。DFR存在底物特異性，這個(gè)特性通常決定植物積累的花青素類型[11]。DFR基因同源物已從許多植物物種中分離出來(lái)，二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)最早是從玉米(Zeamays)中分離鑒定[12]，中國(guó)水仙(Narcissustazettavar.chinensis)[13]、新疆雪蓮(SaussureainvolucrataKar.et Kir.)[14]和黃芩(Scutellariabaicalensis)[15]等多種植物中已分離克隆出DFR基因。鄭好等[6]發(fā)現(xiàn)在芥藍(lán)(Chinese Kale)不同發(fā)育時(shí)期和不同器官中其BoaDFR表達(dá)水平存在顯著差異。武博等[16]分析發(fā)現(xiàn)毛白楊(Populustomentosa)二氫黃酮醇-4-還原酶基因PtDFR蛋白具有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性結(jié)合位點(diǎn)]。研究表明DFR基因作為花青素合成的關(guān)鍵酶基因，對(duì)植物的著色有著關(guān)鍵的作用。對(duì)矮牽牛(Petuniahybrida)介導(dǎo)舞春花(Calibrachoahybrids)CaDFR基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)，觀察到轉(zhuǎn)基因矮牽牛的花蕾和花色與對(duì)照組相比發(fā)生變化[17]。從紫萼(Hostaventricosa)克隆的HvDFR基因轉(zhuǎn)入煙草中增加了煙草花青素的積累[18]。研究說(shuō)明，DFR的表達(dá)情況對(duì)植物花色有重要影響。王云生等[19]在茶樹(shù)(Camelliasinensis)中利用原核表達(dá)純化出目的蛋白，利用HPLC-MS方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行了體外酶活檢測(cè)，目的蛋白具有DFR酶活性。因此，研究DFR底物特異性機(jī)理對(duì)花色改良和育種具有重要意義。

本試驗(yàn)采用RT-PCR和RACE技術(shù)從比利時(shí)杜鵑花中克隆獲得DFR基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)比利時(shí)杜鵑花RhDFR蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用植物酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)對(duì)紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期DFR活性進(jìn)行測(cè)定；利用qRT-PCR技術(shù)分析RhDFR基因在紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同器官和不同發(fā)育時(shí)期花瓣的表達(dá)情況，為RhDFR基因的表達(dá)和功能研究奠定了基礎(chǔ)；通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-RhDFR轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。本試驗(yàn)為從分子角度分析杜鵑花花色差異變化提供了思路，也為其他觀賞性物種花色改良及更深入探討杜鵑花花青素合成途徑供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料于2022年7月在中國(guó)寧波北侖柴橋萬(wàn)景杜鵑良種園(E121°27′40″～122°10′22″，N29°41′44″～29°58′48″)中采集。選擇生長(zhǎng)良好的紅色和白色比利時(shí)杜鵑花為實(shí)驗(yàn)材料。比利時(shí)杜鵑花花朵發(fā)育4個(gè)時(shí)期(花苞期、初開(kāi)期、盛開(kāi)期和衰敗期)及不同器官(分為雌蕊、瓣化雄蕊、花瓣和葉片)如圖1所示。采后立即置于液氮中，然后放入-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成用液氮研磨紅色比利時(shí)杜鵑花樣品，使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取花瓣總RNA。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和SpectraMax 190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司)測(cè)定總RNA的質(zhì)量和濃度。按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海近岸科技有限公司)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit RACE試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成3′/5′cDNA[20-21]。

1.2.2RhDFR基因全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其他植物DFR基因序列。使用Primer 6.0軟件進(jìn)行簡(jiǎn)并引物DFR-R1和DFR-F1設(shè)計(jì)(表1)。以紅色比利時(shí)花苞時(shí)期杜鵑花cDNA為模板，按照2×FastPfuMasterMix酶(上海近岸科技有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收與目的片段大小相同的PCR產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物與pEASY?-BluntCloningKit(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中。將感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于具有卡那霉素(100 mg·mL-1)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。挑選過(guò)夜培養(yǎng)平板的單一菌落，利用M13F和M13R通用引物進(jìn)行菌液PCR，篩選陽(yáng)性克隆菌，進(jìn)行測(cè)序(北京擎科生物科技有限公司)。使用Primer 6.0軟件進(jìn)行RACEDFR-5′和DFR-3′的引物設(shè)計(jì)(表1)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程與保守區(qū)域克隆相同，從而獲得DFR-5′和DFR-3′基因的核苷酸序列。使用DNAMAN 8軟件進(jìn)行序列拼接，根據(jù)拼接結(jié)果使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物DFR-R2和DFR-F2(表1)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程與保守區(qū)域克隆相同，從而獲得DFR基因全部核苷酸序列。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

使用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行同源蛋白質(zhì)多序列比對(duì)；下載其他植物的二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)序列[Gen Bank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)]，利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)和Protscale(http://web.expasy.org/protscale)網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白結(jié)構(gòu)、分子構(gòu)成、等電點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)和親疏水性進(jìn)行分析；采用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和Swiss Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用CDD網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)；采用NetPhos 網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白磷酸化位點(diǎn)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。

1.2.3 RhDFR活性測(cè)定利用植物酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)對(duì)紅色和白色比利時(shí)不同發(fā)育時(shí)期RhDFR活性進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)對(duì)應(yīng)的ELISA試劑盒說(shuō)明書對(duì)紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同時(shí)期花瓣樣品進(jìn)行粗酶液提取。使用液氮對(duì)樣品進(jìn)行研磨，分別稱取0.1～0.2 g研磨后的樣品，加入1 mL PBS(pH 7.4)緩沖液，4 ℃、8 000 r/min離心30 min，取上清液通過(guò)0.45 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，4 ℃保存。根據(jù)對(duì)應(yīng)酶的植物酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RhDFR活性測(cè)定。

1.2.4 比利時(shí)杜鵑RhDFR基因表達(dá)量分析實(shí)驗(yàn)所用qRT-PCR的引物序列為全長(zhǎng)引物DFR-R3和DFR-F3(表1)。使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)材料總RNA，按照NovoScript?Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成熒光cDNA。按照NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus(上海近岸科技有限公司)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系包括35 μL的2×No-voStart?SYBR qPCR SuperMix Plus，正、反向引物各1.4 μL，1.4 μL 熒光cDNA，30.8 μL ddH2O，總體積70 μL。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s；60 ℃ 1 min；30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT[22]法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用Actin-R和Actin-F作為內(nèi)參基因[23]。每種樣品都設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5RhDFR基因的原核表達(dá)使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物DFR-F4和DFR-R4(下劃線20 bp為載體序列)(表1)。以比利時(shí)杜鵑花花瓣cDNA為模版，利用2×EasyTaq?PCR Super Mix酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物與目的片段大小相同。用EcoRI-HF酶(紐英倫生物技術(shù)有限公司)將pET-28a質(zhì)粒(武漢淼靈生物科技有限公司)進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行割膠回收純化，使用NovoRec?plus One step PCR Cloning Kit(上海近岸科技有限公司)連接酶試劑盒說(shuō)明書將純化產(chǎn)物按載體片段和插入片段摩爾比1∶2連接后。再將連接后pET-28a-RhDFR載體輕輕混勻加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將一定量的菌體均勻涂布在含Kan的抗生素平板上，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取重組的單一菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，將質(zhì)粒送樣測(cè)序。

1.2.6 RhDFR重組蛋白制備與純化將重組質(zhì)粒pET-28a-RhDFR和空載質(zhì)粒pET-28a加入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞加到含Kan抗性的固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取重組的單一菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。將重組質(zhì)粒pET-28a-RhDFR和空載質(zhì)粒pET-28a陽(yáng)性菌落預(yù)培養(yǎng)于10 mL含有Kan抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過(guò)夜。當(dāng)菌液吸光度(A600 nm)達(dá)到0.5～0.8時(shí)，加入0.8 mmol/L IPTG溶液，在37 ℃條件下誘導(dǎo)重組蛋白4 h[24]。誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃、8 000 r/min離心10 min收菌，用2 mL 0.1%磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀，對(duì)沉淀進(jìn)行超聲處理，4 ℃、13 000 r/min離心10 min后吸取上清液，用2 mL 0.1%磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀。分別收集上清和沉淀，然后取20 μL蛋白樣品加入20 μL DTT混勻，100 ℃水浴加熱5～10 min，冷卻至室溫使蛋白變性，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10% SDS-PAGE)驗(yàn)證重組蛋白可溶性。使用His60鎳超流樹(shù)脂和重力柱對(duì)可溶性重組蛋白進(jìn)行純化，收集洗脫液，將洗脫液中的蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RhDFR基因的克隆

以紅色比利時(shí)杜鵑花cDNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得542 bp保守區(qū)序列(圖2，A)；基于保守區(qū)序列的RACE擴(kuò)增，分別獲得808 bp的3′序列(圖2，B)和817 bp的5′序列(圖2，C)。利用DNAMAN軟件將保守、5′和3′區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)拼接，得到RhDFR基因全長(zhǎng)為1 253 bp，其中包含1 035 bp的完整ORF序列(圖2，D)，編碼344個(gè)氨基酸。

M.DL2000；A.保守區(qū)；B.5′-RACE；C.3′-RACE；D.ORF圖2 比利時(shí)杜鵑花DFR基因 PCR 擴(kuò)增M.DL2000;A.Conserved zone;B.5′-RACE;C.3′-RACE;D.ORFFig.2 PCR amplification of DFR gene in Rhododendron hybridum Hort.

2.2 RhDFR基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)ProtParam和Protscale網(wǎng)站預(yù)測(cè)RhDFR蛋白理化性質(zhì)及親疏水性。其分子式為C1730H2682N442O512S16，相對(duì)分子質(zhì)量為38 377.94 Da，理論等電點(diǎn)為5.47，總的負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)為45，總的正電荷殘基本(Arg+Lys)為36，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為31.81，親水性平均值為-0、186，脂肪系數(shù)為82.18。結(jié)果表明，RhDFR蛋白為酸性、帶負(fù)電荷穩(wěn)定的親水性蛋白。

通過(guò)CDD網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。結(jié)果表明，比利時(shí)杜鵑花RhDFR蛋白具有一個(gè)NADPH結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)底物特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

如圖3所示，采用NetPhos網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，RhDFR蛋白存在25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸16個(gè)，蘇氨酸12個(gè)，酪氨酸6個(gè)。

圖3 RhDFR蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Analysis of RhDFR protein phosphorylation sites

如圖4所示，采用Protscale對(duì)RhDFR蛋白疏水性進(jìn)行分析。RhDFR蛋白質(zhì)存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其中第194位最高為3.056；第97和98位最低為-2.333。結(jié)果表明，RhDFR蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。

圖4 RhDFR蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of RhDFR

如圖5所示，利用SOPMA對(duì)RhDFR基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，有132個(gè)氨基酸參與形成α螺旋，有44個(gè)氨基酸參與形成延伸鏈，有20個(gè)氨基酸參與形成β-轉(zhuǎn)角和有144個(gè)氨基酸參與形成無(wú)規(guī)則卷曲，分別占38.37%、13.95%、5.81%和41.86%。RhDFR蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)組成。

圖5 RhDFR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted secondary structure of RhDFR protein

如圖6所示，采用Swiss Model網(wǎng)站對(duì)RhDFR蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，RhDFR蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，含有無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈結(jié)構(gòu)。

圖6 RhDFR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Predicted tertiary structure of RhDFR protein

如圖7所示，利用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)，RhDFR基因編碼的氨基酸與鳳仙花(Impatiensglandulifera)、獼猴桃(Actinidiachinensis)、矢車菊(Centaureacyanus)、仙客來(lái)(Cyclamengraecum)、斑點(diǎn)矢車菊(Centaureamaculosa)、向日葵(Helianthusannuus)、雪蓮(Saussureainvolucrata)、越橘(Vacciniumcorymbosum)和紫錐果菊(Echinaceapurpurea)中的DFR蛋白相似性分別為78.53%、88.41%、76.52%、81.40%、77.23%、74.86%、76.52%、92.75%和71.79%。結(jié)果表明，RhDFR蛋白含有與一個(gè)NADPH結(jié)合的保守基序和一個(gè)特異結(jié)合區(qū)，因此初步推測(cè)RhDFR蛋白為DFR蛋白的編碼序列。

圖7 RhDFR與不同物種DFR蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.7 Amino acid sequence comparison of RhDFR with DFR proteins of different species

如圖8所示，利用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，從NCBI中下載其他物種的目的蛋白序列。比利時(shí)杜鵑花RhDFR蛋白與越橘DFR(Vacciniumcorymbosum，AHK23093.1)親緣關(guān)系最近。

圖8 RhDFR與其他植物DFR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.8 Phylogenetic tree analysis of RhDFR and other plant DFR proteins

2.3 比利時(shí)杜鵑花瓣不同發(fā)育時(shí)期DFR活性的變化

如圖9所示，在紅色與白色比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期DFR活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，紅色比利時(shí)杜鵑花在初開(kāi)期DFR活性最高，而白色比利時(shí)杜鵑花在盛開(kāi)期DFR活性最高。在紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期，白色比利時(shí)杜鵑花在盛開(kāi)期和衰亡期的DFR活性高于相應(yīng)紅色比利時(shí)杜鵑花，其活性分別約為紅色比利時(shí)杜鵑花的1.31和1.26倍。而紅色比利時(shí)杜鵑花在花苞期和初開(kāi)期DFR活性高于白色比利時(shí)杜鵑花，其DFR的活性分別約為白色比利時(shí)杜鵑花的1.33和1.23倍。

不同小寫字母表示不同花期在0.05水平差異顯著性，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著性，圖11同圖9 比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期RhDFR活性Different normal letters indicate significant differences at 0.05 level,and different capital letters indicate that they differ significantly at 0.01 level,the same as Fig.11Fig.9 RhDFR activity at different development stages in R. hybridum Hort.

2.4 比利時(shí)杜鵑花不同器官及花瓣不同發(fā)育時(shí)期DFR基因的空間表達(dá)特性

2.4.1 比利時(shí)杜鵑花不同組織RhDFR基因表達(dá)量如圖10所示，利用qRT-PCR技術(shù)在紅色和白色比利時(shí)杜鵑花葉子、花瓣、雄蕊和雌蕊中分析了RhDFR基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，在比利時(shí)杜鵑花不同器官中，RhDFR表達(dá)量存在明顯差異。紅色和白色比利時(shí)杜鵑花RhDFR表達(dá)量均在花瓣中最高，顯著高于其他器官，其次是葉子，最低的是雄蕊。紅色比利時(shí)杜鵑花不同組織的RhDFR基因表達(dá)量高于白色比利時(shí)杜鵑花，其中紅色比利時(shí)杜鵑花葉子、雄蕊、雌蕊和花瓣DFR基因表達(dá)量分別約為白色比利時(shí)杜鵑花的1.56、1.27、1.10和1.40倍。

不同小寫字母表示不同組織間在0.05水平差異顯著性，不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著性圖10 比利時(shí)杜鵑花RhDFR在不同器官中的表達(dá)Different normal letters indicate significant differences at 0.05 level,and different capital letters indicate that they differ significantly at 0.01 levelFig.10 Expression of RhDFR in R. hybridum Hort.in different organs

2.4.2 比利時(shí)杜鵑花花瓣不同發(fā)育時(shí)期RhDFR基因表達(dá)量從圖11可知，在杜鵑花4個(gè)階段的生長(zhǎng)過(guò)程中，紅色和白色比利時(shí)杜鵑花花瓣中RhDFR的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，紅色比利時(shí)杜鵑花在初開(kāi)期表達(dá)量最大，而白色比利時(shí)杜鵑花在盛開(kāi)期表達(dá)量最大。紅色比利時(shí)杜鵑花中RhDFR的基因表達(dá)量均高于同期白色比利時(shí)杜鵑花RhDFR基因表達(dá)量。其中，紅色比利時(shí)杜鵑花在花苞期、初開(kāi)期、盛開(kāi)期和衰亡期的花瓣RhDFR基因表達(dá)量約為白色比利時(shí)杜鵑花的1.58、5.65、1.43和1.79倍。

圖11 比利時(shí)杜鵑花RhDFR在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.11 Expression of RhDFR in R. hybridum Hort.petals at different periods

2.5 RhDFR蛋白制備和純化

如圖12所示，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28-RhDFR和空載質(zhì)粒pET-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌(BL21)中，以空載質(zhì)粒pET-28轉(zhuǎn)入大腸桿菌作為蛋白陰性對(duì)照。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分析，可溶性重組蛋白大小約為38 kD，與預(yù)期大小相近。結(jié)果說(shuō)明RhDFR蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)前對(duì)照菌；2.誘導(dǎo)表達(dá)菌體；3和4為未加IPTG誘導(dǎo)劑對(duì)照菌的沉淀和上清液；5和6為加入IPTG誘導(dǎo)劑表達(dá)菌體的沉淀和上清液圖12 重組RhDFR蛋白的10% SDS-PAGE分析M.Protein standard;1.Control bacteria before induction;2.Induced expression organisms;3 and 4 are precipitates and supernatants of control bacteria without IPTG inducer;5 and 6 are precipitates and supernatants of expression organisms with IPTG inducer addedFig.12 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhDFR protein

如圖13所示，使用His60鎳超流樹(shù)脂和重力柱對(duì)加入IPTG誘導(dǎo)劑的上清液中pET-28-RhDFR重組質(zhì)粒進(jìn)行蛋白純化。用10% SDS-PAGE凝膠電泳分析，純化后的RhDFR蛋白大小約為38 kD，與理論值相近。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1為純化后的重組質(zhì)粒pET-28-RhDFR圖13 重組RhDFR蛋白純化后的10% SDS-PAGE分析M.Protein standard;1 The purified recombinant plasmid pET-28-RhDFRFig.13 10% SDS-PAGE analysis of recombinant RhDFR protein after purification

3 討 論

二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)基因在植物中表現(xiàn)出很強(qiáng)的序列保守性。通過(guò)生物信息學(xué)分析中，在比利時(shí)杜鵑花花青素生物合成中，RhDFR含有一個(gè)NADPH結(jié)合的保守基序和一個(gè)特異結(jié)合區(qū)，與玫瑰(Rosarugosa)RrDFR1[25]、矮牽牛(Petuniahybrida)PhDFR[25]、滇牡丹(Paeoniadelavayi)PdDFR[26]、羽衣甘藍(lán)(Ornamental Kale)BoDFR[27]、滇牡丹DFR[28]和紅花CtDFR1(CarthamustinctoriusL.)[29]蛋白結(jié)合位點(diǎn)相同。RhDFR基因序列所編碼的氨基酸序列與其他物種DFR編碼的氨基酸序列具有較高的相似性，具有相應(yīng)的保守區(qū)域、活性位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)等，因此推測(cè)他們編碼相同的蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，RhDFR蛋白與越橘DFR蛋白親緣關(guān)系最近。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù)從比利時(shí)杜鵑花中克隆RhDFR的基因序列，RhDFR全長(zhǎng)1 253 bp，ORF長(zhǎng)度為1 035 bp，編碼344個(gè)氨基酸；RhDFR蛋白為酸性、帶負(fù)電荷穩(wěn)定的親水性蛋白。

潘怡辰[30]研究表明黑粒小麥(Black-greined what)在灌漿期DFR活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相同，在紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期DFR活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)，紅色比利時(shí)杜鵑花在初開(kāi)期DFR活性最高，而白色比利時(shí)杜鵑花在盛開(kāi)期DFR活性最高，研究表明紅色和白色比利時(shí)杜鵑花具有RhDFR活性。在國(guó)內(nèi)外研究中未發(fā)現(xiàn)其他觀賞性植物DFR活性的檢測(cè)。利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同器官及花瓣不同發(fā)育時(shí)期RhDFR基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析，從不同器官中的基因表達(dá)量來(lái)看，RhDFR基因在花瓣中的表達(dá)水平最高，其中紅色比利時(shí)杜鵑花不同組織的RhDFR基因表達(dá)量高于白色比利時(shí)杜鵑花。這與葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum)MaDFR[7]、黃芩SbDFR[15]基因的表達(dá)量趨勢(shì)一致，在花瓣中DFR基因的表達(dá)水平最高。在紅色和白色比利時(shí)杜鵑花花瓣發(fā)育的不同階段，RhDFR在紅花發(fā)育到初開(kāi)期時(shí)表達(dá)水平最高，白花則在盛開(kāi)期的表達(dá)水平最高。嚴(yán)朋飛等[31]發(fā)現(xiàn)威氏綠絨蒿(Meconopsiswilsonii)在開(kāi)花過(guò)程中MwDFR基因表達(dá)量也呈先上升再下降的趨勢(shì)；齊宇[32]報(bào)道玫瑰DFR基因表達(dá)量也呈先上升再下降的趨勢(shì)，并在初開(kāi)期達(dá)到峰值，均與RhDFR表達(dá)結(jié)果相同。結(jié)果證明，在紅色和白色比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育時(shí)期DFR活性和基因表達(dá)量都呈正相關(guān)。紅色和白色比利時(shí)杜鵑花DFR活性及基因表達(dá)量分別在初開(kāi)期和盛開(kāi)期最高。

本實(shí)驗(yàn)在成功克隆獲得比利時(shí)杜鵑花RhDFR基因的基礎(chǔ)上構(gòu)建pET-28-RhDFR重組表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。研究顯示，與潘麗晶等[33]石斛蘭(Dendrobium)DenDFR基因的原核表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果相符。在原核表達(dá)體系中，二氫黃酮醇 4-還原酶(DFR)融合蛋白在上清液中表達(dá)[34]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本研究中在37 ℃誘導(dǎo)4 h條件下pET-28-RhDFR目的蛋白以可溶性形式存在[34-35]。本試驗(yàn)使用His60鎳超流樹(shù)脂和重力柱對(duì)pET-28-RhDFR重組質(zhì)粒進(jìn)行蛋白純化，純化后的RhDFR蛋白大小約為38 kD，與理論值相近。

本研究以紅色和白色比利時(shí)杜鵑花的不同器官和不同發(fā)育時(shí)期花瓣為實(shí)驗(yàn)材料，克隆得到RhDFR基因，并對(duì)RhDFR基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，也對(duì)比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育階段RhDFR活性檢測(cè)；還通過(guò)qRT-PCR分析RhDFR基因在比利時(shí)杜鵑花不同發(fā)育階段和雌蕊、雄蕊、花瓣和葉片中的表達(dá)量；同時(shí)成功制備pET-28-RhDFR重組蛋白。比利時(shí)杜鵑花RhDFR基因克隆及表達(dá)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究首次克隆得到的比利時(shí)杜鵑花二氫黃酮醇4-還原酶(RhDFR)基因，并對(duì)該基因表達(dá)量和蛋白進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。上述研究表明，杜鵑花中RhDFR活性的功能多樣化，DFR基因與比利時(shí)杜鵑花花瓣的顏色有關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)深入探討杜鵑花花色調(diào)控分子機(jī)制有著重要意義，也為進(jìn)一步研究RhDFR基因功能奠定了基礎(chǔ)。