朱 清，臧曉南，王振東，馬 帥

(中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控中必不可少的順式作用元件，常用于基因重組表達(dá)等實(shí)驗(yàn)研究中，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)占據(jù)著重要的地位。啟動(dòng)子能夠提供RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，控制著轉(zhuǎn)錄的起始[1-2]。在基因表達(dá)過(guò)程中，啟動(dòng)子的選擇也發(fā)揮了很大的作用[3]，選擇啟動(dòng)活性高的強(qiáng)啟動(dòng)子一直是人們追求的目標(biāo)。

染色體步移技術(shù)是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的技術(shù)基礎(chǔ)上，從已知序列出發(fā)對(duì)鄰近未知的序列進(jìn)行探尋的方法，主要包括反向PCR，接頭介導(dǎo)PCR以及半隨機(jī)引物PCR等[4]。TAIL-PCR由Liu和Whittier[5]率先提出并成功應(yīng)用于自動(dòng)擴(kuò)增和測(cè)序P1與YAC克隆細(xì)胞的插入端序列，以及擬南芥(Arabidopsisthaliana)T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的分離和定位[6]。TAIL-PCR技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便快捷，高效準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)在許多研究中被廣泛應(yīng)用。因此，本實(shí)驗(yàn)利用在半隨機(jī)引物PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良的熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR技術(shù)(TAIL-PCR)，使用3條方向相同且延伸溫度較高的特異性引物與溫度較低的兼并引物進(jìn)行3次嵌套PCR反應(yīng)，對(duì)基因未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。

裂殖壺菌(Aurantiochytriumlimacinum)是一種海洋真菌，因其是DHA等多不飽和脂肪酸(PUFAs)高產(chǎn)菌而得到廣泛關(guān)注。目前已有許多外源啟動(dòng)子運(yùn)用于裂殖壺菌相關(guān)研究的實(shí)例，如鄭楚強(qiáng)構(gòu)建了裂殖壺菌中丙二酸單酰基轉(zhuǎn)移酶(MAT)的過(guò)表達(dá)體系，利用TEF1啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)了MAT基因的過(guò)表達(dá)[7]。楊瑞雄等[8]同樣利用外源TEF1啟動(dòng)子將希瓦氏菌屬的Shewanellasp.SCRC2738的烯酰還原酶(ER)基因替換到裂殖壺菌(A.limacinum)SR21中異源表達(dá)，為調(diào)控裂殖壺菌中PUFAs的合成提供了新的思路。相較于外源啟動(dòng)子的廣泛研究，對(duì)于裂殖壺菌內(nèi)源啟動(dòng)子的探索目前還處于初步階段，本實(shí)驗(yàn)室劉暢對(duì)裂殖壺菌pks1、pks3基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行克隆重組，檢測(cè)了啟動(dòng)子序列的活性，王振東在此基礎(chǔ)上對(duì)兩啟動(dòng)子序列進(jìn)一步完善，得到了更多的順式作用元件[9-10]。pks1、pks2和pks3是裂殖壺菌高效合成脂肪酸的PKS途徑基因簇的3個(gè)基因，其中pks2基因的啟動(dòng)子序列目前尚未有研究。本研究擬對(duì)裂殖壺菌pks2基因的上游序列進(jìn)行研究，探索裂殖壺菌的內(nèi)源啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，為基因工程操作提供有效的基因元件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

裂殖壺菌A.limacinumOUC168，大腸桿菌EscherichiacoliBL21及色氨酸缺陷型酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種；啟動(dòng)子檢測(cè)載體pAcGFP1-1(見圖1(a))以及genome walking試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，酵母表達(dá)載體pYD1(見圖1(b))來(lái)自Invitrogen公司?？寺≥d體pEASY-Blunt-T simple Cloning Vector及菌株感受態(tài)E.coliTrans-T1來(lái)自于北京全式金公司。pks2基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室前期克隆拼接獲得[11]。實(shí)驗(yàn)中涉及到的引物列于表1。

(MCS：多克隆位點(diǎn)；AcGFP1：綠色熒光蛋白基因；SV40 poly(A)signal：SV40早期mRNA多腺苷酸化信號(hào)；f1 ori：f1單鏈DNA來(lái)源，包裝AcGFP1-1的非編碼鏈；AmpR promoter：氨芐西林抗性(β-內(nèi)酰胺酶)啟動(dòng)子；SV40 ori：SV40復(fù)制起點(diǎn)；SV40 promoter：SV40早期啟動(dòng)子；NeoR/KanR：新霉素/卡那霉素耐藥基因；HSV TK poly(A)signal：?jiǎn)渭儼捳畈《拘剀占っ付嘞佘账峄盘?hào)；ori：pUC質(zhì)粒復(fù)制起源。MCS: multiple cloning site; AcGFP1: Aequorea coerulescens green fluorescent protein gene; SV40 poly(A)signal: SV40 early mRNA polyadenylation signal; f1 ori: f1 single-strand DNA origin, packages noncoding strand of AcGFP1-1; AmpR promoter: Ampicillin resistance(β-lactamase)promoter; SV40 ori: SV40 origin of replication; SV40 promoter: SV40 early promoter; NeoR/KanR: Neomycin/Kanamycin resistance gene; HSV TK poly(A)signal: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal; ori: pUC plasmid replication origin.)

表1 引物列表

1.2 方法

1.2.1pks2基因5’端側(cè)翼序列的獲取與分析 根據(jù)pks2基因5’端序列設(shè)計(jì)3條退火要求溫度較高且均為反向的特異性引物，分別命名為SP1、SP2與SP3(見表1)，與genome walking試劑盒中的兼并引物進(jìn)行3次巢氏PCR反應(yīng)，得到目的側(cè)翼序列。之后將序列通過(guò)PlantCARE[12]等進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，得到的pks2啟動(dòng)子序列命名為p2。

1.2.2pks2啟動(dòng)子的引物設(shè)計(jì)及連接克隆載體pEASY-Blunt-T simple Cloning Vector 根據(jù)得到的pks2啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，上、下游分別加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。上游引物為p2-F，下游引物為p2-R(列于表1，下劃線為酶切位點(diǎn)序列)。以裂殖壺菌OUC168的DNA為模板擴(kuò)得pks2啟動(dòng)子序列，并將其連接至pEASY-Blunt-T simpleCloning Vector并轉(zhuǎn)入Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序準(zhǔn)確的質(zhì)粒命名為T-P2。

1.2.3pks2基因啟動(dòng)子連接pAcGFP1-1載體及轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 使用BamHⅠ和HindⅢ分別對(duì)T-P2和pAcGFP1-1載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后利用T4連接酶連接，命名為pAcGFP-P2，轉(zhuǎn)入制備好的E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，篩選驗(yàn)證后將測(cè)序準(zhǔn)確的菌株命名為E.coliBL21-pAcGFP-P2，同時(shí)將空載體pAcGFP1-1轉(zhuǎn)化到E.coliBL21上，并將其命名為E.coliBL21-pAcGFP，用于后續(xù)對(duì)照。

1.2.4pks2基因啟動(dòng)子連接pYD1載體及轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeEBY100 使用NotⅠ和HindⅢ分別對(duì)pAcGFP-P2和pYD1載體雙酶切，膠回收后連接測(cè)序，構(gòu)建好的載體命名為pYD1-GFP-P2。利用酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將其轉(zhuǎn)化到S.cerevisiaeEBY100上，經(jīng)培養(yǎng)基平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，之后提取轉(zhuǎn)化子酵母基因組DNA，以其為模板進(jìn)一步PCR驗(yàn)證測(cè)序，轉(zhuǎn)化好的菌株命名為S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2，同時(shí)使用NotⅠ和HindⅢ雙酶切空載體pAcGFP1-1，得到綠色熒光蛋白gfp基因片段，將其連接pYD1載體再轉(zhuǎn)入S.cerevisiaeEBY100用于后續(xù)對(duì)照，命名為S.cerevisiaeEBY100-GFP。

1.2.5 啟動(dòng)子的原核啟動(dòng)表達(dá)分析 將構(gòu)建好的E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP菌株與實(shí)驗(yàn)室前期保藏的含有pks1和pks3啟動(dòng)子的重組菌株(分別命名為E.coliBL21-pAcGFP-P1，E.coliBL21-pAcGFP-P3)一起接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃活化12 h，之后將活化好的菌液按1%的比例接種至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 h后測(cè)OD600值，將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)離心破碎后制備成蛋白上清樣品，進(jìn)行熒光分析以及SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)。

1.2.6 啟動(dòng)子的真核啟動(dòng)表達(dá)分析 將構(gòu)建好的S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2，S.cerevisiaeEBY100-GFP菌株以及實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的含有pks1以及pks3啟動(dòng)子序列的重組酵母菌株(分別命名為S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1，S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3)一起進(jìn)行表達(dá)。因pYD1質(zhì)粒自身攜帶半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PGAL，而pks2為組成型啟動(dòng)子，所以為了避免PGAL啟動(dòng)子啟動(dòng)綠色熒光蛋白表達(dá)，重組菌株使用含2%葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基進(jìn)行活化，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，按10%比例進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后經(jīng)離心破碎，取蛋白上清樣品進(jìn)行熒光分析，最后用SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pks2基因5’端側(cè)翼序列的獲取與分析

利用設(shè)計(jì)好的特異性引物與兼并引物進(jìn)行3次PCR反應(yīng)后，對(duì)第3次PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2。其中M泳道為marker,第1、2、3、4泳道分別為與試劑盒中4種兼并引物反應(yīng)結(jié)果，除了第1泳道未出現(xiàn)條帶外，其余3個(gè)泳道均出現(xiàn)了大小不一的條帶，對(duì)這些條帶進(jìn)行膠回收后測(cè)序，通過(guò)與pks2基因5’端序列比對(duì)，最終確定得到了長(zhǎng)度為409 bp的pks2基因5’端側(cè)翼序列。

(M: Marker；1、2、3、4: 4種不同兼并引物PCR產(chǎn)物Reaction results of four different degenerate primers.)

將得到的pks2基因5’端側(cè)翼序列運(yùn)用PlantCARE進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(見圖3)，發(fā)現(xiàn)在序列中存在CAAT-box和TATA-box等常見的真核生物啟動(dòng)子作用元件，TATA-box具有確保轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)確開始的作用，而CAAT-box元件能有效的控制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的速率[2,12]。此外，還發(fā)現(xiàn)有參與光響應(yīng)的調(diào)節(jié)元件CAG-motif和G-box，以及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)核心序列，厭氧誘導(dǎo)中重要的調(diào)節(jié)元件ARE等，初步推測(cè)這段序列可能具有啟動(dòng)活性，不僅是一個(gè)組成型啟動(dòng)子，還具備誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)，在特定誘導(dǎo)條件下能夠發(fā)揮功能。

圖3 pks2基因啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)

2.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及重組菌株轉(zhuǎn)化

以裂殖壺菌OUC168的基因組DNA為模板，從pks2基因ATG前409 bp處開始擴(kuò)得啟動(dòng)子序列。膠回收后連接克隆載體，進(jìn)一步酶切后連接啟動(dòng)子檢測(cè)載體pAcGFP1-1得到重組原核表達(dá)載體pAcGFP-P2，重組質(zhì)粒圖譜如圖4所示。將pAcGFP-P2與空載體pAcGFP1-1分別轉(zhuǎn)入提前制備好的E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)單一菌落轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。圖5(a)為載體pAcGFP-P2轉(zhuǎn)E.coliBL21檢測(cè)結(jié)果，使用引物P2-F和GFP-R分別對(duì)轉(zhuǎn)化子和E.coliBL21進(jìn)行PCR，除了泳道4E.coliBL21沒(méi)有出現(xiàn)條帶以外，其余3個(gè)泳道均出現(xiàn)了單一且清晰條帶，且大小與pks2基因啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白gfp基因兩片段加起來(lái)的大小一致(1 129 bp)，證明表達(dá)載體pAcGFP-P2成功轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中。圖5(b)為使用綠色熒光蛋白gfp基因的上下游引物GFP-F與GFP-R對(duì)載體pAcGFP1-1轉(zhuǎn)化檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果顯示除泳道5以E.coliBL21為模板未出現(xiàn)條帶外，泳道6、7均出現(xiàn)單一清晰條帶，大小與gfp基因長(zhǎng)度一致(720 bp),證明載體pAcGFP1-1也成功轉(zhuǎn)化到E.coliBL21中，經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序得到重組菌株E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP。

圖4 重組質(zhì)粒pAcGFP-P2圖譜

((a)載體pAcGFP-P2轉(zhuǎn)化E. coli BL21菌PCR檢測(cè)圖。M：Marker；泳道1、2、3：pAcGFP-P2轉(zhuǎn)化E. coliBL21陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；泳道4.：E. coli BL21菌株。(b)載體pAcGFP1-1轉(zhuǎn)化E. coli BL21菌PCR檢測(cè)圖。M：Marker；泳道5：E. coliBL21菌株；泳道6、7：pAcGFP1-1轉(zhuǎn)化E. coliBL21陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。(a)PCR result of E. coli BL21 transformed by vector pAcGFP-P2.M: Marker; Lanes 1, 2, 3: pAcGFP-P2 transformed E. coli BL21 positive transformant; Lane 4: E. coli BL21.(b)PCR result of E. coli BL21 transformed by vector pAcGFP1-1.M: Marker; Lane 5: E. coli BL21; Lanes 6, 7: pAcGFP1-1 transformed E. coli BL21 positive transformant.)

2.3 真核表達(dá)載體構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

對(duì)之前構(gòu)建好的原核表達(dá)載體使用NotⅠ和HindⅢ雙酶切，連接同樣酶切后的pYD1載體，得到重組真核表達(dá)載體(見圖6)，之后進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。以提取的轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。圖7(a)中使用引物P2-F和GFP-R，除第4泳道由于使用S.cerevisiaeEBY100的DNA為模板而未有條帶外，其余3個(gè)泳道利用載體pYD1-GFP-P2轉(zhuǎn)酵母的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板均出現(xiàn)單一、明亮的條帶，且大小與預(yù)期長(zhǎng)度一致(pks2啟動(dòng)子和gfp基因共計(jì)約1 129 bp)，證明載體pYD1-GFP-P2成功轉(zhuǎn)化到S.cerevisiaeEBY100中，并插入其基因組中；圖7(b)中使用引物GFP-F和GFP-R，除泳道5由于同樣使用S.cerevisiaeEBY100為模板而未出現(xiàn)條帶外，使用載體pYD1-GFP轉(zhuǎn)化酵母的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板的泳道6、7均出現(xiàn)了與綠色熒光蛋白gfp基因長(zhǎng)度相符的單一條帶(720 bp)，證明載體pYD1-GFP也成功轉(zhuǎn)入S.cerevisiaeEBY100中，通過(guò)進(jìn)一步測(cè)序確定重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2和S.cerevisiaeEBY100-GFP。

圖6 重組質(zhì)粒pYD1-GFP-P2圖譜

((a)載體pYD1-GFP-P2轉(zhuǎn)化S. cerevisiae EBY100檢測(cè)圖。M：Marker；泳道1、2、3：pYD1-GFP-P2轉(zhuǎn)化S. cerevisiae EBY100陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；泳道4：S. cerevisiae EBY100菌株。(b)載體pYD1-GFP轉(zhuǎn)化S. cerevisiae EBY100檢測(cè)圖。M：marker；泳道5：S. cerevisiae EBY100菌株；泳道6、7：載體pYD1-GFP轉(zhuǎn)化S. cerevisiae EBY100陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。(a)Detection diagram of vector pYD1-GFP-P2 transformed S. cerevisiae EBY100.M: Marker; Lanes 1,2,3: pYD1-GFP-P2 transformed S. cerevisiae EBY100 positive transformant; Lane 4: S. cerevisiae EBY100.(b)Detection diagram of vector pYD1-GFP transformed S. cerevisiae EBY100.M: Marker; Lane 5: S. cerevisiae EBY100; Lanes 6, 7: pYD1-GFP transformed S. cerevisiae EBY100 positive transformant.)

2.4 啟動(dòng)子的原核啟動(dòng)表達(dá)分析

2.4.1 重組菌株的熒光檢測(cè)分析 對(duì)構(gòu)建好的重組菌株E.coliBL21-pAcGFP-P2，E.coliBL21-pAcGFP以及實(shí)驗(yàn)室保存的E.coliBL21-pAcGFP-P1，E.coliBL21-pAcGFP-P3活化后進(jìn)行熒光檢測(cè)分析，結(jié)果如圖8所示，在488 nm波長(zhǎng)激發(fā)光下，菌株均呈現(xiàn)不同程度熒光發(fā)射峰，且在520 nm左右處出現(xiàn)最高峰，其中重組菌株E.coliBL21-pAcGFP-P2熒光活性最高，菌株E.coliBL21-pAcGFP-P3次之，然后為E.coliBL21-pAcGFP-P1菌株，而E.coliBL21-pAcGFP的熒光強(qiáng)度最低，表明pks1、pks2和pks3基因啟動(dòng)子都具有一定的啟動(dòng)活性，并不同程度啟動(dòng)了綠色熒光蛋白gfp基因的表達(dá)，其中pks2基因啟動(dòng)子活性最高，與其他結(jié)果間差異顯著(P<0.01)。

(GFP：E. coli BL21-pAcGFP菌株；1-GFP：E. coli BL21-pAcGFP-P1菌株；2-GFP：E. coli BL21-pAcGFP-P2菌株；3-GFP：E. coli BL21-pAcGFP-P3菌株GFP: E. coli BL21-pAcGFP strain; 1-GFP: E. coli BL21-pAcGFP-P1 strain; 2-GFP: E. coli BL21-pAcGFP-P2 strain; 3-GFP: E. coli BL21-pAcGFP-P3 strain.)

2.4.2 重組菌株的SDS-PAGE分析以及Western Blot檢測(cè) 對(duì)重組菌株經(jīng)破碎離心后的蛋白上清樣品制樣后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖9(a)所示，其中泳道1為E.coliBL21的總蛋白上清樣品，泳道2、3、4分別為重組的E.coliBL21-pAcGFP-P1、E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP-P3菌株總蛋白上清樣品，與泳道1相比，其余3個(gè)泳道并無(wú)明顯特異性條帶出現(xiàn)，推測(cè)是由于表達(dá)量不高，因此SDS-PAGE條帶不易辨認(rèn)，進(jìn)一步對(duì)樣品使用綠色熒光蛋白gfp基因的特異性抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖9(b)所示，除泳道5E.coliBL21的總蛋白上清樣品未出現(xiàn)明顯條帶外，其余3個(gè)泳道重組的E.coliBL21-pAcGFP-P1、E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP-P3菌株總蛋白上清樣品均在25～30 kDa之間出現(xiàn)一條明顯的條帶，與綠色熒光蛋白大小(26.7 kDa)相符，證明在原核菌株E.coliBL21中，pks1、pks2和pks3基因啟動(dòng)子均啟動(dòng)了綠色熒光蛋白gfp基因的表達(dá)。

((a)原核重組菌株蛋白上清樣品SDS-PAGE圖。M：Marker；泳道1：E. coli BL21上清樣品；泳道2：E. coli BL21-pAcGFP-P1上清樣品；泳道3：E. coli BL21-pAcGFP-P2上清樣品；泳道4：E. coli BL21-pAcGFP-P3上清樣品。(b)原核重組菌株蛋白上清樣品Western Blot圖。M：Marker；泳道5：E. coli BL21上清樣品；泳道6：E. coli BL21-pAcGFP-P1上清樣品；泳道7：E. coli BL21-pAcGFP-P2上清樣品；泳道8：E. coli BL21-pAcGFP-P3上清樣品。(a)SDS-PAGE of prokaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: Marker; Lane 1: E. coli BL21supernatant sample; Lane 2: E. coli BL21-pAcGFP-P1 supernatant sample; Lane 3: E. coli BL21-pAcGFP-P2 supernatant sample; Lane 4: E. coli BL21-pAcGFP-P3supernatant sample.(b)Western Blot of prokaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: Marker; Lane 5: E. coli BL21 supernatant sample; Lane 6: E. coli BL21-pAcGFP-P1supernatant sample; Lane 7: E. coli BL21-pAcGFP-P2 supernatant sample; Lane 8: E. coli BL21-pAcGFP-P3supernatant sample.)

2.5 啟動(dòng)子系列重組菌株的真核表達(dá)分析

2.5.1 重組菌株的熒光檢測(cè)分析 將構(gòu)建好的酵母重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2和S.cerevisiaeEBY100-GFP以及之前保存的菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1和S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3活化后表達(dá)制樣，對(duì)得到的蛋白上清樣進(jìn)行熒光檢測(cè)分析，結(jié)果如圖10，在488 nm激發(fā)光下，菌株出現(xiàn)不同程度熒光發(fā)射峰，且在520 nm左右處出現(xiàn)最高峰。與對(duì)照菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP相比，3種啟動(dòng)子均不同程度的啟動(dòng)了GFP的表達(dá)，其中菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2熒光略強(qiáng)，與其他結(jié)果間差異顯著(P<0.05)，證明pks2基因啟動(dòng)子活性最高，pks3基因啟動(dòng)子次之，pks1基因啟動(dòng)子活性最低，與在原核表達(dá)系統(tǒng)中熒光檢測(cè)結(jié)果一致。

(GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP菌株；1-GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP-P1菌株；2-GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP-P2菌株；3-GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP-P3菌株。GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP strain; 1-GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP-P1 strain; 2-GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP-P2 strain; 3-GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP-P3 strain.)

2.5.2 重組菌株的SDS-PAGE分析以及Western Blot檢測(cè) 將真核重組菌株蛋白上清制樣后同樣進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖11所示。圖11(a)為真核重組菌株SDS-PAGE圖，泳道1為S.cerevisiaeEBY100蛋白樣，泳道2、3、4分別為重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1，S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2，S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3的蛋白上清樣。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在25～30 kDa之間，條帶較為緊密，重組菌株無(wú)法判斷出有明顯區(qū)別于S.cerevisiaeEBY100的條帶出現(xiàn)。圖11(b)為利用綠色熒光蛋白gfp基因特異性抗體進(jìn)一步進(jìn)行的Western Blot檢測(cè)，與S.cerevisiaeEBY100菌株上清樣(泳道5)相比，重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1(泳道6)、S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2(泳道7)和S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3(泳道8)均出現(xiàn)條帶，且大小與綠色熒光蛋白大小一致(26.7 kDa)，證明pks1、pks2和pks3基因啟動(dòng)子都啟動(dòng)了gfp基因的表達(dá)，具有啟動(dòng)活性。

((a)真核重組菌株蛋白上清樣品SDS-PAGE圖。M：Marker；泳道1：S. cerevisiae EBY100上清樣品；泳道2：S. cerevisiae EBY100-GFP-P1上清樣品；泳道3：S. cerevisiae EBY100-GFP-P2上清樣品；泳道4：S. cerevisiae EBY100-GFP-P3上清樣品。(b)真核重組菌株蛋白上清樣品Western Blot圖。M：Marker；泳道5：S. cerevisiae EBY100上清樣品；泳道6：S. cerevisiae EBY100-GFP-P1上清樣品；泳道7：S. cerevisiae EBY100-GFP-P2上清樣品；泳道8：S. cerevisiae EBY100-GFP-P3上清樣品。(a)SDS-PAGE of eukaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: marker; Lane 1: S. cerevisiae EBY100 supernatant sample; Lane 2: S. cerevisiae EBY100-GFP-P1 supernatant sample; Lane 3: S. cerevisiae EBY100-GFP-P2 supernatant sample; Lane 4: S. cerevisiae EBY100-GFP-P3 supernatant sample.(b)Western Blot of prokaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: Marker; Lane 5: S. cerevisiae EBY100 supernatant sample; Lane 6: S. cerevisiae EBY100-GFP-P1 supernatant sample; Lane 7: S. cerevisiae EBY100-GFP-P2 supernatant sample; Lane 8: S. cerevisiae EBY100-GFP-P3 supernatant sample.)

3 討論

本研究利用TAIL-PCR技術(shù)，通過(guò)3次巢氏PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出了pks2基因5’端側(cè)翼序列，經(jīng)分析初步確定了這段序列具有啟動(dòng)子活性。在對(duì)pks2基因啟動(dòng)子序列活性的進(jìn)一步研究中，選用了綠色熒光蛋白gfp基因，為探索在不同宿主中啟動(dòng)子的活性提供了便利條件；同時(shí)通過(guò)選擇常用的原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以及真核釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在E.coliBL21和S.cerevisiaeEBY100中，pks2基因啟動(dòng)子均不同程度的啟動(dòng)了綠色熒光蛋白gfp基因的表達(dá)，這說(shuō)明pks2在原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)中都具有啟動(dòng)活性。

裂殖壺菌具有高效合成脂肪酸的聚酮合酶途徑(PKS途徑)，pks1、pks2和pks3組成了PKS途徑相關(guān)酶的基因簇。目前已有許多針對(duì)參與PKS途徑關(guān)鍵基因和結(jié)構(gòu)酶域的研究，揭示了參與PKS途徑的基因的具體功能以及改造可能性，為構(gòu)建高產(chǎn)DHA的優(yōu)勢(shì)菌株奠定了理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室劉暢[9]克隆了裂殖壺菌pks1、pks3基因的啟動(dòng)子序列，王振東[10]在此基礎(chǔ)上對(duì)兩啟動(dòng)子序列進(jìn)一步延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性并不高，而pks2基因的啟動(dòng)子目前還沒(méi)有被研究。在對(duì)裂殖壺菌進(jìn)行基因改造獲得高產(chǎn)DHA菌株的研究中，常常存在外源基因表達(dá)不夠理想的情況，選擇一個(gè)合適的強(qiáng)啟動(dòng)子，往往能夠提高重組蛋白的表達(dá)[13]。Han等[14]通過(guò)建立β-半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)，比較了在裂殖壺菌中4種啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，利用活性最強(qiáng)的ccg1p啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了裂殖壺菌中ATP-檸檬酸裂解酶和乙酰輔酶a羧化酶的過(guò)量表達(dá)。除了外源啟動(dòng)子的篩選，選用比外源啟動(dòng)子活性更高的內(nèi)源性啟動(dòng)子往往能達(dá)到事半功倍的效果。李杰等[15]在對(duì)轉(zhuǎn)基因鹽藻外源基因表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，利用鹽藻的誘導(dǎo)型內(nèi)源啟動(dòng)子比外源啟動(dòng)子更有利于外源基因的表達(dá)；譚瑋[16]在對(duì)藍(lán)藻中外源基因人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的表達(dá)研究中，使用了藍(lán)藻的2種內(nèi)源啟動(dòng)子，與使用外源啟動(dòng)子相比，均在一定程度上提高了基因的表達(dá)。江賢章等[17]通過(guò)對(duì)海洋破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10的Δ4-脂肪酸脫飽和酶5’端側(cè)翼序列擴(kuò)增分析，得到具有啟動(dòng)子活性的序列；夏曉峰[18]又針對(duì)破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10的Δ5-脂肪酸脫飽和酶5’端側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，同樣得到了一段具有啟動(dòng)子活性的序列，為從基因水平研究破囊壺菌Thraustochytrium中DHA的生物合成奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)得的pks2基因啟動(dòng)子，作為裂殖壺菌的內(nèi)源啟動(dòng)子或許可以用于后續(xù)的研究。

在對(duì)啟動(dòng)子活性的進(jìn)一步比較分析中，發(fā)現(xiàn)新得到的pks2基因啟動(dòng)子具有比pks1、pks3基因啟動(dòng)子更高的啟動(dòng)活性。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)pks1、pks2和pks3基因的啟動(dòng)子序列中都具有CAAT-box，但是CAAT-box的位置有所不同。其中pks2啟動(dòng)子序列中的CAAT-box距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離更近，因而這可能使其調(diào)控效率更高。此外pks2啟動(dòng)子序列中還有參與光響應(yīng)的調(diào)控元件CAG-motif、G-box等，這可能使轉(zhuǎn)錄更容易受到調(diào)控，從而具有更高的轉(zhuǎn)錄效率。

新擴(kuò)增得到的pks2基因啟動(dòng)子雖然包含的順式作用元件并不多，但仍顯現(xiàn)出較高的啟動(dòng)活性，在未來(lái)對(duì)其進(jìn)一步研究或許存在更完整序列與更高活性。總體來(lái)說(shuō)，作為裂殖壺菌以外其他宿主的外源啟動(dòng)子，甚至作為裂殖壺菌內(nèi)源啟動(dòng)子，pks2基因啟動(dòng)子的獲得與成功表達(dá)顯示出其在啟動(dòng)基因表達(dá)中具備的潛力，為裂殖壺菌代謝調(diào)控和合成生物學(xué)研究提供了基因資源。