王澤華，陳東宇，孫 慧，王 帥，王喜樂，黃 偉，胡文巖，劉永利，余 洋

（沈陽沈化院測試技術有限公司安全評價中心，沈陽 110141）

氟啶蟲酰胺（Flonicamid）是由日本石原產業(yè)株式會社發(fā)現(xiàn)的吡啶酰胺（或煙酰胺）類殺蟲劑[1]，主要用于防治農作物上的刺吸式口器害蟲，尤其對蚜蟲高效。氟啶蟲酰胺是一種選擇性殺蟲劑，對蜜蜂、草蛉、寄生蜂、瓢蟲等天敵昆蟲表現(xiàn)出很好的安全性[2]。放射性同位素示蹤技術是以放射性核素作為示蹤劑對研究對象進行標記并檢測的微量分析方法，該技術具有示蹤、直觀、簡便、痕量和準確等特點[3-5]。人們利用各種現(xiàn)代化分析測試手段開展了大量研究工作。然而，在諸多研究分析方法中，放射性同位素示蹤技術以獨特的優(yōu)勢成為國際公認的研究藥物代謝及處置的最有效手段之一[6-10]。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質，可以用現(xiàn)代放射性檢測儀器，如液體閃爍計數(shù)分析儀和在線同位素檢測儀等，追蹤藥物在體內的分布、含量變化及排泄等[11]；通過將示蹤劑引入動物體內，研究其在動物體內吸收、分布、代謝及消減等動態(tài)過程中的規(guī)律。目前對氟啶蟲酰胺的研究大多集中于環(huán)境、作物中的殘留與毒性安全評價，而有關其在動物體內的研究相對較少，至今未見在蛋雞排泄的研究報道。因此本研究采用14C標記氟啶蟲酰胺，研究其在蛋雞體內的排泄，為進一步研究該物質的毒理作用機制和毒物安全評價提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

99.2%氟啶蟲酰胺原藥，國家農藥質量監(jiān)督檢驗中心（沈陽）；14C標記氟啶蟲酰胺（比活度：51.74 mCi/mmol），無錫貝塔醫(yī)藥科技有限公司；閃爍液，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），Sigma-Aldrich公司；明膠膠囊，浙江天龍膠丸有限公司。

Tricarb-2910型液體閃爍計數(shù)分析儀（LSC），配備QuantaSmart 4.00操作軟件，美國Perkin Elmer儀器公司；高效液相色譜-在線同位素檢測儀（HPLC-ARC），配備Empower 3與ARC101 2.8.0.142B操作軟件，美國Waters與ARC儀器公司；Harvey OX-501型生物氧化燃燒儀，美國Harvey儀器公司；超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；BP211D型十萬分之一電子天平、Milli-Q超純水機，德國Sartorius公司；移液器，德國Eppendorf公司。

海蘭蛋雞，遼陽縣柳壕鎮(zhèn)北方牧業(yè)。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

動物室溫度為24.0～28.0℃，濕度為30%～71%，自動控制光照，12 h光照，12 h黑暗。試驗動物使用過程完全接受沈陽沈化院測試技術有限公司動物管理委員會（IACUC）的監(jiān)督。試驗前所有蛋雞飼養(yǎng)于家禽動物房中不銹鋼飼育籠內，蛋雞產蛋期配合飼料喂養(yǎng)。飼料及飲用水不包含任何影響試驗結果的污染物，試驗期間動物自由飲水，每日飼喂2次。

試驗設空白對照組和給藥組，空白對照組1只蛋雞，給藥組10只蛋雞。采用膠囊經口方式給藥，給藥劑量設定為10 mg/kg飼料，每只動物每天給藥量為1.12 mg，即每天經口給予膠囊1粒，連續(xù)給藥7 d；空白對照組每天經口給予安慰劑（空白膠囊）。

1.3 給藥溶液的配制

精確稱?。?4C］氟啶蟲酰胺40.00 mg于25 mL的容量瓶中，加入未標記氟啶蟲酰胺60.07 mg，用甲醇溶解并定容，得到質量濃度為4 mg/mL的供試藥劑溶液，貼好標簽，備用。

1.4 給藥膠囊的制備

根據每只動物每天的給藥量，結合給藥溶液的質量濃度計算每個膠囊所需試藥溶液的體積；移取280μL的試藥溶液于明膠膠囊中，在通風櫥中用氮氣吹干溶劑后封口，共制作72粒試藥膠囊，將膠囊置于塑料瓶中，貼好標簽，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 給藥膠囊中試藥的穩(wěn)定性考察

氟啶蟲酰胺試藥溶液配制完成后，用甲醇稀釋為8μg/mL的溶液，取2個平行樣品，采用HPLC-ARC測定其放射化學純度；在最后1次給藥完成后，將剩余的膠囊打開1粒，置于50 mL的離心管中，加入15 mL甲醇，超聲提取3次，每次提取10 min。合并3次的提取液于50 mL的容量瓶中，甲醇定容，稀釋至接近的濃度，測定稀釋液（平行2個樣品）的放射化學純度，通過比較2次的測定結果評價給藥膠囊中試藥的穩(wěn)定性。按式（1）計算偏差。2次測定的放射化學純度偏差不超過±10%，則符合試驗檢測要求。

1.6 同位素稀釋試藥比活度的測定

取適量供試藥劑溶液，用甲醇稀釋成4μg/mL，取2個100μL平行樣品，分別加入10 mL Ultima Gold閃爍液后，采用LSC測定放射性活度濃度。按式（2）計算未標記供試藥劑的比活度。

式中：A為測定活度，Bq；V為量取體積，μL；C為質量濃度，mg/mL，a為稀釋后比活度，Bq/mg。

1.7 總放射性殘留與物質平衡回收率試驗

1.7.1 樣品的采集及儲藏

在給藥期間，每日上午給藥前和下午各收集雞蛋1次，空白組每天收集的雞蛋去殼后，冷凍保存在-20℃的冰箱中；將下午收集的給藥組10只雞蛋去殼，與第2天上午收集的雞蛋混合作為同一天的樣品，冷凍保存在-20℃的冰箱中。第7次給藥后，動物宰殺前收集的雞蛋作為第7 d的樣品；稱重記錄每天雞蛋樣品的重量，冷凍保存在-20℃的冰箱中。

每天給藥前收集空白組與給藥組蛋雞的排泄物，將相同時間段的給藥組10只蛋雞的糞便樣品混合，末次（宰殺前）收集后用80%甲醇-水清洗糞盤，將給藥組10只蛋雞的清洗液混合。記錄每天糞便及末次清洗液的重量，冷凍保存在-20℃的冰箱中。

1.7.2 樣品處理

雞蛋：雞蛋樣品解凍，混勻；稱取0.25±0.000 5 g樣品于閃爍瓶中，每個樣品2個平行；加入0.8 mL的超純水，混勻后，加入20 mL的Ultima Gold閃爍液，利用液體閃爍計數(shù)分析儀進行總放射性殘留的分析。

糞便清洗液：樣品解凍，混勻；稱取0.5±0.000 5 g樣品于閃爍瓶中，每個樣品2個平行；加入10 mL的閃爍液Ultima Gold，利用液體閃爍計數(shù)分析儀進行總放射性殘留的分析。

糞便：樣品解凍，將不同時間段的空白糞便樣品混合，給藥組各時間段的糞便樣品單獨處理，向糞便樣品中加入50%的乙腈-水溶液，浸泡30 min后勻漿；混勻后稱重，記錄各時間段勻漿液的重量。稱取勻漿液樣品約0.5±0.000 5 g于燃燒盤中（2個平行樣品），隨后置于70℃烘箱中烘干；烘干后的樣品進行氧化燃燒，生成的[14C]CO2經Carbo-Sorb E與Permafluor E+（3∶5，V/V）混合閃爍液吸收，利用液體閃爍計數(shù)分析儀進行總放射性殘留的分析。

1.7.3 總放射性殘留與物質平衡回收率分析

根據液體閃爍計數(shù)分析儀分析結果，按式（3）～（6）分別計算回收量、樣品總殘留量、回收量占比、平衡回收率。

式中：m回收為回收量，mg；A試樣、A空白分別為試樣和空白樣品的放射性活度測定值，Bq；m試樣為測定量，g；a為稀釋后比活度，Bq/mg；C樣品為樣品總殘留量，mg/kg；m樣品為樣品量，mg。每天給藥量，mg/(只·d)。

2 結果與分析

2.1 給藥膠囊的穩(wěn)定性分析

給藥前藥溶液放射化學純度平均值為99.9%，給藥結束時膠囊提取液放射化學純度平均值為100%，2次測定的放射化學純度偏差為0.101%，說明在給藥過程中膠囊中的供試物質穩(wěn)定。2次平行樣品給藥前后的HPLC-ARC在線放射性譜圖見圖1。

圖1 給藥前后給藥溶液的HPLC-ARC在線放射性譜圖

2.2 給藥溶液同位素稀釋后的比活度

根據給藥溶液的測定濃度計算出2個平行樣品的放射性活度濃度分別為10 490 000、10 426 167 Bq/mL，根據放射性活度濃度及質量濃度計算經未標記氟啶蟲酰胺稀釋后的給藥溶液比活度分別為2 622 500、2 606 542 Bq/mg，平均值為2 614 521 Bq/mg（表1）。此處的給藥溶液同位素稀釋后的平均比活度用于物質平衡回收量的計算。

表1 給藥溶液同位素稀釋后的比活度

2.3 總放射性殘留與物質平衡回收率

試驗結果表明，雞蛋樣品的殘留量為0.239～1.570 mg/kg，氟啶蟲酰胺的回收量為0.107～0.597 mg，總回收量為2.364 mg，占總給藥量的3.01%；糞便樣品的殘留量為4.73～12.70 mg/kg，氟啶蟲酰胺的回收量為5.08～16.30 mg，總回收量為69.58 mg，占總給藥量的88.8%；糞便清洗液樣品的殘留量為0.756 mg/kg，氟啶蟲酰胺的回收量為0.675 mg，占總給藥量的0.861%（表2）。根據以上雞蛋、糞便和糞便清洗液樣品的回收率結果，可以計算給藥氟啶蟲酰胺后受試物質的總物質平衡回收率為92.7%。由此可以發(fā)現(xiàn)氟啶蟲酰胺在蛋雞體內主要通過糞便排泄，雞蛋中的排泄量較低。

表2 雞蛋、糞便和糞便清洗液樣品的總放射性殘留與物質平衡回收率

3 結論

本研究利用放射性同位素示蹤技術研究氟啶蟲酰胺在蛋雞體內的排泄，通過雞蛋、糞便及清洗液中回收率結果可以得出，氟啶蟲酰胺主要通過糞便排泄，雞蛋中的殘留量較少。本研究考慮蛋雞排泄后，糞盤上會有殘留，用80%甲醇-水充分清洗獲得糞便淋洗液并進行測定，以保證總物質回收率計算的準確性。蛋雞給氟啶蟲酰胺7 d后總回收率為92.7%，說明放射性物質在蛋雞體內其他組織中分布較少。總物質平衡回收率的研究結果也為氟啶蟲酰胺在蛋雞體內代謝產物的研究奠定基礎。該方法是跟蹤農藥及其代謝產物最有效的手段，能準確定量地測定農藥及其代謝產物，追蹤農藥的轉移和轉變[12]。利用同位素標記化合物的示蹤作用，能夠在保證生物樣品原有屬性的同時，快速精確地得到原始總殘留，為合理使用農藥提供試驗數(shù)據。