張文博，潘興魯，董豐收，吳小虎，徐 軍，鄭永權(quán)

（1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

西瓜屬一年生蔓生藤本植物，果肉味甜，能降溫去暑；種子含油，可作為消遣食品；果皮藥用，有清熱、利尿、降血壓之效。中國是世界上最大的西瓜產(chǎn)地。西瓜作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，各地栽培，品種甚多，以新疆、甘肅蘭州、山東德州、江蘇東臺(tái)等地最為有名。在我國危害西瓜的主要病害有枯萎病、炭疽病、病毒病、白粉病、霜霉病等。以上病害會(huì)導(dǎo)致西瓜葉片脫落、幼苗枯萎，最終導(dǎo)致植株死亡，影響西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。春雷霉素作為一種農(nóng)醫(yī)兩用的抗菌素，不僅能夠針對(duì)西瓜主要病害起到良好的防治效果，而且對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)生物急性毒性極低。春雷霉素可通過干擾致病菌細(xì)胞內(nèi)部與氨基酸代謝相關(guān)的酯酶系統(tǒng)，影響蛋白質(zhì)的合成，從而抑制菌絲伸長(zhǎng)和細(xì)胞顆?；痆1-2]，因此對(duì)蔬菜、瓜果和水稻等作物的多種細(xì)菌和真菌性病害具有較好的防治作用[3]。此外，春雷霉素對(duì)人畜無毒，被農(nóng)業(yè)部列為可在無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)上使用的推薦農(nóng)藥[2]。日本和歐盟規(guī)定春雷霉素在水果中的最大殘留限量（MRL）均為0.2 mg/kg[4]，我國規(guī)定春雷霉素在西瓜中MRL值為0.1 mg/kg。

春雷霉素的極性大，水溶性強(qiáng)，無特征紫外吸收峰，在液相色譜柱上的保留時(shí)間短，不能與雜質(zhì)完全分離，從而給檢測(cè)帶來困難。Insmed Pharmaceuticals公司[5]采用柱前衍生化的方法，延長(zhǎng)了其在色譜柱上的保留時(shí)間，并具有特殊紫外吸收峰，但該方法操作復(fù)雜且衍生化過程中含有毒氣體氟化氫，危害較大。牛長(zhǎng)群等[6]采用反相離子對(duì)高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定了發(fā)酵液中的春雷霉素，通過加入離子對(duì)試劑改變保留時(shí)間，避免了衍生化過程帶來的麻煩，但該方法靈敏度較低，不能滿足痕量分析的要求。吳國旭等[7]在牛長(zhǎng)群等[6]的基礎(chǔ)上通過改變流動(dòng)相對(duì)2%春雷霉素水劑進(jìn)行了檢測(cè)，但該方法對(duì)試劑、酸堿度和溫度有著特定的要求，且保留時(shí)間較長(zhǎng)，不利于大量樣品的快速檢測(cè)。

本研究以西瓜為試驗(yàn)對(duì)象，采用固相萃取柱凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，旨在建立靈敏度高、凈化效果好的春雷霉素在西瓜中的殘留分析方法，為春雷霉素在西瓜上的正確、安全使用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

供試試劑：春雷霉素鹽酸鹽水合物標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.8%），北京勤誠亦信科技有限公司；2%春雷霉素可濕性粉劑，江西省高安金龍生物科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸、氨水，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司；甲醇（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Oasis MCX固相萃取柱，美國Waters公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱量一定量的春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品，使用超純水配制1 000 mg/kg的儲(chǔ)備液10 mL，然后用超純水梯度稀釋成0.01、0.05、0.1、0.5 mg/kg和1 mg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3 田間試驗(yàn)

殘留試驗(yàn)參照NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[8]進(jìn)行設(shè)計(jì)。選取10個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)，分別是內(nèi)蒙古、山西、寧夏、北京、山東、上海、安徽、湖南、貴州和廣西。每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)置1個(gè)處理小區(qū)和1個(gè)對(duì)照小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為50 m2。施藥劑量為30 g a.i./hm2，于西瓜收獲前14 d第1次施藥，于收獲前7 d第2次施藥，施藥間隔期為7 d。施藥方式為兌水噴霧，用水量為900 L/hm2。最終殘留試驗(yàn)于最后1次施藥后7、10 d采集西瓜樣品。采樣時(shí)，每個(gè)小區(qū)采集2份獨(dú)立樣品。去除果柄后用四分法取不相鄰2瓣，切成小塊后勻漿，將制備好的樣本放入聚四氟乙烯材質(zhì)容器內(nèi)，貼好標(biāo)簽，儲(chǔ)存于-18℃冷庫。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g粉碎均勻的西瓜全瓜樣品于50 mL的離心管中，加入10 mL 1%甲酸-甲醇，于1 400次/min振蕩10 min，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，向沉淀物再次加入10 mL 1%甲酸-甲醇，重復(fù)1次以上步驟。合并2次上清液后，使用1%甲酸-甲醇定容至25 mL，渦旋2 min混合均勻，待凈化。

使用5 mL甲醇和5 mL超純水預(yù)淋洗MCX固相萃取柱，取5 mL西瓜提取液至MCX固相萃取柱中，收集流出的提取液，待提取液流盡后，重復(fù)1次上述操作，隨后依次使用5 mL超純水和5 mL甲醇淋洗MCX固相萃取柱。真空抽至近干，加入8 mL的2%氨水甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于50 mL的圓底燒瓶中，于80 r/min，35℃旋蒸至近干，用1 mL甲醇-水（1∶1，V/V）復(fù)溶，渦旋混合均勻后過0.22μm有機(jī)濾膜，待進(jìn)樣。

1.5 液相色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件。流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.2%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：3.0μL；柱溫：35℃。采用梯度洗脫模式，具體洗脫參數(shù)見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件。多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描；電離源模式：電噴霧離子源；掃描模式：正離子模式；離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：350℃；GS1：50 psi；GS2：60 psi；在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，春雷霉素的定性離子對(duì)為380.50＞200.40（m/z），DP電壓為50.97 V，CE電壓為16.29 V，定量離子對(duì)為380.50＞112.40（m/z），其DP電壓為50.97 V，CE電壓為23.94 V。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基質(zhì)效應(yīng)。樣品的基質(zhì)效應(yīng)（ME）[9]按式（1）計(jì)算。

式中：基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果為正數(shù)表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，結(jié)果為負(fù)數(shù)表示基質(zhì)抑制效應(yīng)；弱基質(zhì)效應(yīng)為-20%≤ME≤20%；中等基質(zhì)效應(yīng)為-50%≤ME＜-20%或20%＜ME≤50%；強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)為ME＜-50%或ME＞50%[10-11]。

膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。依據(jù)衛(wèi)生部2002年發(fā)布的《中國不同人群消費(fèi)膳食分組食譜》中的膳食結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和已制定的春雷霉素最大殘留限量（MRLs），結(jié)合規(guī)范殘留試驗(yàn)中值（STMR）或最大殘留限量（MRL），可按式（2）計(jì)算農(nóng)藥的國家估算每日攝入量（NEDI），再依據(jù)農(nóng)藥的每日允許攝入量（ADI），按式（3）計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)商（RQ）[12-14]。

式中：STMRi為農(nóng)藥在某種食品中的規(guī)范殘留中值，mg/kg；Fi為一般人群對(duì)該食品的消費(fèi)量，kg；bw為中國人均體重，kg（一般以63 kg計(jì)）；ADI為農(nóng)藥的每日允許攝入量mg/(kg bw)。

當(dāng)RQ≤100%時(shí)，表示其風(fēng)險(xiǎn)可以接受，RQ值越小，風(fēng)險(xiǎn)越小；當(dāng)RQ＞100%時(shí)，表示有不可接受的慢性風(fēng)險(xiǎn)，RQ值越大，風(fēng)險(xiǎn)越大[15-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

在優(yōu)化流動(dòng)相條件時(shí)，分別采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸水、甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，并采用梯度洗脫法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入微量甲酸不僅有助于改善峰型，而且有助于提高待測(cè)物離子化效率，從而提高待測(cè)化合物的檢測(cè)靈敏度，且甲醇相較于乙腈響應(yīng)值更高且峰型較好。因此，最終選擇以甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

在優(yōu)化質(zhì)譜條件時(shí)，采用濃度為1 mg/kg的春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。在正、負(fù)離子模式下分別進(jìn)行全掃，發(fā)現(xiàn)正離子模式下響應(yīng)相對(duì)較高，故選用正離子模式。進(jìn)一步采用MS2掃描模式確定子離子，在MRM模式下對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并選擇信號(hào)較高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。在該條件下，春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為0.418 min。

2.2 SPE固相小柱的選擇

QuEChERS技術(shù)目前廣泛用于樣品的前處理，僅需幾步就可以完成對(duì)樣品的提取凈化，方便快捷，但其對(duì)去除干擾物質(zhì)的能力較SPE柱略差。本研究首先嘗試采用QuEChERS方法進(jìn)行處理，在未使用凈化劑時(shí)，空白基質(zhì)在目標(biāo)化合物出峰位置有很強(qiáng)的干擾，無法識(shí)別目標(biāo)化合物。在使用PSA、C18和GCB對(duì)樣品進(jìn)行凈化后，結(jié)果顯示，目標(biāo)物與雜質(zhì)仍難以實(shí)現(xiàn)分離（圖1a）。因此，本研究考慮選用SPE柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。MCX柱具有陽離子交換機(jī)理，其對(duì)堿性物質(zhì)有著獨(dú)特的選擇性，適合堿性物質(zhì)與中性和酸性物質(zhì)的分離提取，對(duì)于弱堿性的春雷霉素具有很好的保留能力，可以達(dá)到良好的凈化效果（圖1b）。

圖1 不同凈化方式的春雷霉素色譜圖

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

洗脫液在洗脫過程中，不僅可將目標(biāo)物洗脫還能將雜質(zhì)洗脫，因此本研究先對(duì)淋洗進(jìn)行了優(yōu)化。分別使用溶劑和基質(zhì)液配制標(biāo)準(zhǔn)樣品，比較4、6、8、10、12 mL洗脫液的洗脫效率。結(jié)果顯示，洗脫液在達(dá)到8 mL后淋洗效率最高（圖2a），之后略有下降并開始趨于穩(wěn)定，故選用8 mL洗脫液洗脫。使用溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品在第1次上樣后的淋洗效率為95%，而使用基質(zhì)液配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品在第1次上樣后的淋洗效率僅為57.3%，將流出液重復(fù)上樣，其淋洗效率才符合要求（圖2a），故在實(shí)際樣品檢測(cè)中采用重復(fù)2次上樣再進(jìn)行淋洗和洗脫。

春雷霉素水溶性大，采用乙腈提取效果不佳，故在本研究中采用1%甲酸-甲醇作為提取液，在添加濃度為0.1 mg/kg的條件下，對(duì)比樣品提取1次和提取2次的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)樣品提取1次時(shí)的回收率僅為45.6%，提取2次時(shí)的回收率為75.3%（圖2b），因此在實(shí)際樣品檢測(cè)中用1%甲酸-甲醇提取2次。

圖2 淋洗曲線與不同提取方式的回收率

2.4 工作曲線、基質(zhì)效應(yīng)與定量限

參考春雷霉素的限量標(biāo)準(zhǔn)以及儀器的靈敏度，使用空白樣品提取液和溶劑分別配制濃度范圍為0.01～1 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.5節(jié)的儀器操作條件進(jìn)行分析。春雷霉素的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和西瓜基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程分別為y=502.15x-1 169.1（R2=0.999 8）；y=122.16x-1 885.5（R2=0.990 2）。結(jié)果表明，其在0.01～1 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，滿足分析要求。

在對(duì)樣品進(jìn)行提取時(shí)，一些樣品中的共同提取物會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的離子化產(chǎn)生影響[18-19]。結(jié)果表明，西瓜中春雷霉素的基質(zhì)效應(yīng)為-75.7%，表現(xiàn)為較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了補(bǔ)償，以提高定量的準(zhǔn)確性。

2.5 準(zhǔn)確度、精密度與定量限

稱取5 g空白的西瓜全瓜樣品，加入春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品，其加標(biāo)水平分別為0.01、0.1 mg/kg和1 mg/kg。按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平平行測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0.01～1 mg/kg加標(biāo)范圍內(nèi)，西瓜全瓜樣品中的春雷霉素平均回收率為71.0%～79.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.7%～4.9%，說明該方法具有較好的精密度及準(zhǔn)確度，可以滿足春雷霉素殘留分析的要求。相關(guān)譜圖見圖3。本試驗(yàn)中以最低添加水平確定定量限（LOQ），定量限為0.01 mg/kg。

圖3 實(shí)際樣品色譜圖

表2 春雷霉素在西瓜中加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)與膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

為了驗(yàn)證方法的可靠性和實(shí)用性，運(yùn)用本方法對(duì)西瓜田間實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定。田間試驗(yàn)于10個(gè)試驗(yàn)地點(diǎn)進(jìn)行，距最后1次施藥7 d后，春雷霉素在西瓜中的規(guī)范殘留中值（STMR）不超過0.01 mg/kg，最高殘留值（HR）為0.047 mg/kg。

結(jié)合我國農(nóng)藥登記情況和我國居民的人均膳食結(jié)構(gòu)，普通人群對(duì)春雷霉素的國家估算每日攝入量（NEDI）為0.070 3 mg，日允許攝入量為7.119 mg，風(fēng)險(xiǎn)商（RQ）為0.99%，該研究結(jié)果說明其對(duì)一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。其膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果見表3。

表3 春雷霉素膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

（續(xù)表3）

3 結(jié)論

本研究建立了西瓜中春雷霉素殘留分析方法。樣品采用1%甲酸-甲醇提取，Oasis MCX固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，有效降低了樣品基質(zhì)的干擾，提高了分析的靈敏度和準(zhǔn)確度。方法定量限為0.01 mg/kg。在0.01～1 mg/kg加標(biāo)水平下，春雷霉素在西瓜中的平均回收率為71.0%～79.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～4.9%。該方法前處理過程簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度均能達(dá)到殘留分析要求。田間實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果表明，按照推薦劑量（30 g a.i./hm2）施用春雷霉素，其在西瓜上的殘留試驗(yàn)中值不超過0.01 mg/kg，最高殘留值為0.047 mg/kg。膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明，普通人群對(duì)春雷霉素的國家估算每日攝入量為0.070 3 mg，風(fēng)險(xiǎn)商為0.99%，遠(yuǎn)小于100%，說明春雷霉素對(duì)一般人群健康不會(huì)產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。