嚴一杰 魏麗娟 孫建紅 張開顏 李雷

(海南省人民醫(yī)院眼科，海南 ?？?570000)

視力障礙是全球性疾病負擔，也是致盲的重要原因。隨著我國人口老齡化的發(fā)展趨勢，年齡相關性白內障(Age-related cataract，ARC)的發(fā)病率也越來越高，現已成為可逆性視力障礙和失明的首要原因[1-2]。目前，ARC的發(fā)病機制尚不完全明確，但已知該疾病發(fā)生發(fā)展與紫外線輻射、氧化應激、代謝紊亂、藥物和其他毒性因素有關[3]。對ARC發(fā)展過程中的具體分子機制進行深入研究和闡明，尋找該疾病的病因，開發(fā)有效的抗白內障藥物，預防、延緩甚至逆轉晶狀體混濁，最大限度地保護患者的視覺功能[4]，這些對于減輕ARC患者壓力和社會經濟負擔具有重要的理論和社會意義。

Rho相關激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protein kinase 2，ROCK2)也稱為Rho相關卷曲螺旋形成蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，是蛋白激酶A、G和C(PKA/PKG/PKC)家族的成員。ROCK有兩個高度同源的異構體，即ROCK1和ROCK2，現已證實ROCK2參與細胞多種生物學過程，例如增殖、凋亡、收縮、粘附和遷移等[4-5]，在病理過程中，ROCK2的過度活化會導致血管內皮損傷，內皮細胞的遷移也受到ROCK途徑的調控[6]。此外，ROCK2在包括視網膜在內的許多器官中均有表達，而其過度表達會導致多種眼部疾病的發(fā)生，如糖尿病視網膜病變和青光眼[7-8]。但關于ROCK2在ARC中的相關作用及機制報道較少。本研究通過檢測ARC晶狀體前囊膜中ROCK2表達后，利用H2O2誘導人晶狀體上皮細胞建立體外ARC模型，觀察下調ROCK2表達對人晶狀體上皮細胞自噬及氧化損傷的影響，探討ROCK2在白內障病理過程中可能的作用及其機制，同時為白內障靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2020年6月～2021年4月在我院進行超聲乳化白內障吸出術的ARC患者20例，獲取晶狀體前囊膜，男11例，女9例，年齡51～72歲，平均(58.91±5.43)歲，并取眼科標本庫中無眼科疾病、眼球結構完整且晶狀體透明的前囊膜。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 主要材料 人晶狀體上皮細胞系HLE-B3(中國科學院上海細胞庫)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；H2O2(美國Sigma公司)；免疫組織化學染色試劑盒(北京索萊寶生物公司)；Lipofectamine?RNAiMAX(美國 Invitrogen公司)；Trizol、反轉錄及熒光定量試劑盒(日本Takara公司)；免疫熒光染色試劑盒(上海翌圣生物公司)；MTT試劑盒、Bradford蛋白測定試劑盒、ECL試劑液和DCFH-DA試劑盒(上海碧云天生物研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗人ROCK2單克隆抗體、兔抗人Beclin-1、LC3-II、LC3-Ⅰ、GAPDH多克隆抗體及生物素標記山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司)；自噬雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3(美國GeneCopoeia公司)；sh-NC和sh-ROCK2載體均有廣州銳博生物公司合成構建，引物序列交由上海生工生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 將ARC及正常晶狀體前囊膜清洗后，立即置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，組織塊連續(xù)切片，獲得厚度約為4 μm的切片。通過60℃烤箱烤片，浸入枸櫞酸緩沖液煮沸10 min，進行熱抗原修復，再置于0.3%過氧化氫中室溫孵育10 min，以10%山羊血清室溫封閉后，采用稀釋的兔抗人ROCK2單克隆抗體(1：200)作為第一抗體，與切片在4℃下共孵育過夜。PBS沖洗切片后，滴加稀釋的生物素標記山羊抗兔IgG抗體(1∶1000)，室溫繼續(xù)共孵育1 h。利用DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察染色情況，捕獲圖像，其中黃色至棕色顆粒即為陽性表達，隨機選擇5個視野，Image J軟件分析所選區(qū)域的平均密度。

1.3.2 細胞轉染與分組 將凍存的HLE-B3細胞取出，置于37℃水浴鍋中融化，再以1000 rpm/min離心3 min，棄上清，在沉淀中加入含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，吹打成單細胞懸液，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基。實驗分組與處理具體如下：①對照組：HLE-B3細胞正常培養(yǎng)。②H2O2組：100 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細胞24 h。③sh-NC+H2O2組：轉染sh-NC至HLE-B3細胞，以100 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細胞24 h。④sh-ROCK2+H2O2組：轉染sh-ROCK2至HLE-B3細胞，以100 μmol·L-1H2O2處理HLE-B3細胞24 h。利用Lipofectamine?RNAiMAX分別將sh-NC和sh-ROCK2序列轉染至HLE-B3細胞，嚴格參照試劑盒說明書操作。

1.3.3 實時熒光定量PCR Trizol試劑提取轉染后HLE-B3細胞總RNA，通過反轉錄操作合成cDNA。以cDNA為模板，根據實時熒光定量PCR試劑盒說明檢測擴增，以定量ROCK2 mRNA的表達水平，選擇β-actin作為內參基因。反應系統的程序設置為：95℃預變性3 min，1次循環(huán)；95 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，42次循環(huán)。實驗重復3次，反應結束后，采用2-ΔΔCt法計算ROCK2的mRNA相對表達量。引物序列如下：ROCK2上游5′- ATTCAGCAGCTGGAATCTAA-3′，下游5′-GTCTCTTCTCCAGTTCTAC-3′；β-actin上游5′-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCT-A-3′，下游5′- AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3′。

1.3.4 Western blot 在轉染后或各處理組的HLE-B3細胞中加入預冷RIPA緩沖液，冰上裂解，通過4000 rpm離心15 min以提取總蛋白，Bradford法定量。制備10%SDS-PAGE凝膠，將提取的各組蛋白樣品等量上樣后，凝膠電泳分離，再電轉至PVDF膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入各稀釋的一抗抗體，4℃下共孵育過夜。棄去原液，TBST洗膜，加入對應的二抗，室溫繼續(xù)孵育1 h，TBST洗膜。利用ECL顯色，凝膠成像系統拍攝各個蛋白條帶，以GAPDH作為內參蛋白，Image J軟件分析灰度值，計算各目的蛋白的相對表達量。

1.3.5 MTT法 取生長狀態(tài)良好的HLE-B3細胞，調整密度按1×105個/孔植入96孔板內，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜后，按照1.3.2分4組進行對應處理，結束后，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h，加入50 μL 1×MTT至待測細胞孔，混勻，37℃孵育 4 h，洗掉上清，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床振蕩10 min，待結晶物完全溶解，酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度值(OD值)。

1.3.6 透射電鏡觀察 收集各處理組HLE-B3細胞，以2000 rpm離心5 min，利用4%多聚甲醛和4%戊二醛混合液固定細胞。將細胞樣品包埋并制備成超薄切片，以3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。透射電鏡下觀察細胞內自噬體，并捕獲細胞超微結構圖像。

1.3.7 細胞免疫熒光染色 將各處理組HLE-B3細胞接種于共聚焦小皿中，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至貼壁，加入mRFP-GFP-LC3病毒液感染細胞，MOI為50，繼續(xù)孵育2～6 h后，棄掉原培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，封片液封片，共聚焦顯微鏡觀察染色情況，攝取圖片，結果中兩種熒光融合后出現的黃色斑點代表自噬體，融合后出現的紅色斑點代表自噬溶酶體，通過對不同顏色斑點的計數來判斷細胞內自噬流水平，每組隨機選擇3個視野，計數100個細胞中的紅點與黃點數目來定量自噬水平。

1.3.8 DCFH-DA法 首先在 DCFH-DA試劑液加入無血清培養(yǎng)液進行稀釋(比例為1∶1000)，收集各處理組HLE-B3細胞，以2000 rpm離心5 min，棄上清，加入稀釋的DCFH-DA重懸細胞，調整密度按2×104個/孔植入24孔板內，37℃下孵育20 min，期間每隔5 min輕晃1次。結束后，以1000 rpm離心10 min，PBS洗滌細胞并將沉淀重懸，通過流式細胞儀進行檢測分析ROS。

1.3.9 氧化反應指標測定 采用細胞裂解液裂解各處理組HLE-B3細胞，收集上清液，并進行蛋白電量。按照試劑盒說明書處理樣品，酶標儀測定對應波長下各孔A值，檢測各組細胞內超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量。

2 結果

2.1 ROCK2在ARC患者晶狀體囊膜中的表達 免疫組化染色檢測ARC晶狀體囊膜中ROCK2表達，以正常晶狀體囊膜作為對照，經檢測發(fā)現，ARC晶狀體囊膜中染色強度較正常組織明顯增加，ROCK2表達增強(見圖1A)。Western blot檢測結果進一步顯示，與正常組織比較，ARC晶狀體囊膜中ROCK2相對蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，見圖1B。

圖1 年齡相關性白內障患者晶狀體囊膜中ROCK2表達檢測Figure 1 Detection of ROCK2 expression in the lens capsule of age-related cataract patients注：A.免疫組織化學染色檢測ROCK2表達(400×)；B.Western blot檢測ROCK2蛋白表達。與正常組織比較，①P<0.05

2.2 HLE-B3細胞轉染效果檢測 HLE-B3細胞轉染后，通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果顯示，與對照組和sh-NC組比較，sh-ROCK2組細胞中ROCK2的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均顯著降低(P<0.05)，說明轉染sh-ROCK2后成功下調HLE-B3細胞中ROCK2表達水平，見圖2。

圖2 HLE-B3細胞轉染效率測定Figure 2 Determination of transfection efficiency of HLE-B3 cells注：與對照組比較，①P<0.05；與sh-NC組比較，②P<0.05

2.3 下調ROCK2對H2O2刺激下晶狀體上皮細胞增殖活性的影響 MTT法檢測各處理組HLE-B3細胞增殖活性，結果顯示，與對照組比較，H2O2組在轉染后24、48、72 h，細胞增殖活性均顯著下降(P<0.05)；而相較于H2O2組，細胞轉染sh-ROCK2后經H2O2處理時，其增殖活性均顯著升高(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組HLE-B3細胞增殖活性比較Figure 3 Comparison of the proliferation activity of HLE-B3 cells in each group

2.4 下調ROCK2對H2O2誘導的晶狀體上皮細胞自噬的影響 通過透射電鏡觀察各處理組HLE-B3細胞內自噬情況，對照組細胞內內質網結構緊密，未見自噬體，H2O2組和sh-NC+H2O2組細胞胞質內均可見多個由單層膜或雙層膜的自噬體，數目明顯多于對照組，sh-ROCK2+H2O2組細胞偶有自噬體，數目較H2O2組明顯減少(見圖4)。通過免疫熒光染色觀察各組HLE-B3細胞內自噬流，與對照組比較，H2O2組細胞內紅色斑點和黃色斑點的熒光強度均明顯增強，說明H2O2明顯激活了自噬溶酶體和自噬體水平(P<0.05)；與H2O2組比較，sh-ROCK2+H2O2組細胞內紅色斑點和黃色斑點的熒光強度均明顯減弱，細胞內自噬溶酶體和自噬體水平受到抑制(P<0.05)(見圖5)。Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，H2O2組HLE-B3細胞中Beclin-1蛋白相對表達量顯著升高，LC3-II/LC3-Ⅰ比值顯著上調(P<0.05)；與H2O2組比較，sh-ROCK2+H2O2組細胞中Beclin-1蛋白相對表達量顯著降低，LC3-II/LC3-Ⅰ比值顯著下調(P<0.05)，見圖6。

圖4 各組HLE-B3細胞內自噬體觀察(10000×)Figure 4 Observation of autophagosomes in HLE-B3 cells in each group 注：箭頭所指為自噬體

圖5 各組HLE-B3細胞內自噬流水平(100×)Figure 5 Intracellular levels of autophagy in HLE-B3 cells in each group 注：紅色斑點是自噬溶酶體(mRFP)；黃色斑點是自噬體(mRFP+GFP)

圖6 各組HLE-B3細胞中自噬相關蛋白表達Figure 6 Autophagy-related protein expression in HLE-B3 cells in each group注：與對照組比較，①P<0.05；與H2O2組比較，②P<0.05

2.5 下調ROCK2對H2O2誘導的晶狀體上皮細胞氧化應激反應的影響 DCFH-DA法檢測各處理組HLE-B3細胞內ROS水平，H2O2組細胞ROS水平較對照組顯著上升(P<0.05)；而sh-ROCK2+H2O2組細胞ROS水平較H2O2組則顯著下降(P<0.05)(見圖7)。H2O2組HLE-B3細胞中SOD和GSH-Px的活性均顯著低于對照組(P<0.05)，MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)；而相較于H2O2組，sh-ROCK2+H2O2組細胞中SOD和GSH-Px的活性均顯著升高，MDA含量則顯著降低(P<0.05)，見表1。

圖7 各組HLE-B3細胞內ROS水平檢測Figure 7 Detection of ROS levels in HLE-B3 cells in each group注：與對照組比較，①P<0.05；與H2O2組比較，②P<0.05

表1 各組HLE-B3細胞SOD和GSH-Px活性及MDA含量比較Table 1 Comparison of SOD and GSH-Px activities and MDA content of HLE-B3 cells in each group

3 討論

根據世界衛(wèi)生組織數據顯示，由白內障引起的失明約占所有失明人數的50%，而且還在以每年0.4～120萬的速度增長，其中ARC的比例最高[2]。迄今為止，手術切除仍是ARC唯一有效的治療方法，但手術風險、術后并發(fā)癥及社會經濟負擔等因素均限制該療法[9-10]。因此，開發(fā)安全且低成本的方案來預防或治療ARC，是當前眼科疾病臨床研究的一項重點內容。

在Rho家族成員中，RhoA不僅在調節(jié)細胞骨架、維持細胞形態(tài)、平滑肌細胞收縮等細胞活動中起重要作用，而且參與調節(jié)多種生物學活動，如平滑肌細胞增殖與細胞粘附。在細胞代謝過程中，Rho蛋白以磷酸鳥嘌呤三核苷酸(GTP)和磷酸鳥嘌呤二核苷酸(GDP)結合形式存在，通過GDP磷酸化和GTP去磷酸化之間的相互轉換，誘導或終止細胞級聯激活的反應[11-12]。ROCK2作為小GTP酶Rho亞家族的下游效應子，在與Rho中GTP酶相互作用后被激活，并通過一系列途徑作用于細胞骨架及其靶蛋白，從而發(fā)揮多種生物學效應[4,13]。目前，關于ROCK2在疾病中的研究較為廣泛，且多項研究證明抑制ROCK2可在一些疾病中發(fā)揮積極作用，如Knipe等[14]研究指出ROCK1和ROCK2均有助于博萊霉素誘導的肺損傷后組織纖維化的發(fā)展，而在ROCK1或ROCK2單倍體不足的小鼠中ROCK1或ROCK2的表達降低能夠減輕其受博萊霉素誘導的肺纖維化；Yang等[15]發(fā)現ROCK2抑制劑Ripasudil通過調節(jié)ROCK2/eNOS信號通路抑制脂多糖誘導的肺微血管內皮細胞凋亡和炎癥反應。此外，關于ROCK2在眼科疾病中的研究也已有報道，Gao等[16]研究表明ROCK2抑制劑Ripasudil通過上調miR-136-5p表達可減輕視網膜色素上皮細胞的炎癥損傷，經驗證還發(fā)現miR-136-5p對ROCK1和ROCK2均有靶向作用；Hida等[17]研究指出抑制ROCK通路能夠顯著抑制視網膜靜脈阻塞的惡化，減少視網膜水腫與非灌注區(qū)的大小，并改善了視網膜血流量。本研究結果顯示，通過靶向下調HLE-B3中ROCK2的表達后能夠抑制H2O2誘導的HLE-B3細胞增殖活性的下降。這一結果同樣也提示，抑制ROCK2表達能夠減輕H2O2誘導下人晶狀體上皮細胞的損傷，推測這可能對于ARC造成的人晶狀體上皮細胞損傷起到改善作用。

隨著年齡的增長，眼部的不同組織會發(fā)生一系列變化，包括線粒體代謝失調、葡萄糖和脂質利用模式改變、甲基化代謝物積累以及?；撬岽x受損，這些變化都可能歸因于眼病的發(fā)生[18]。同時，內源性抗氧化劑如SOD和GSH-Px的活性明顯降低，而ROS的產生卻增加，ROS的過量產生對包括DNA和蛋白質在內的生物分子造成了結構性損傷，阻礙眼部相關受損細胞核和線粒體DNA的修復過程，從而導致細胞基因組的不穩(wěn)定、細胞衰老和年齡相關疾病的發(fā)生[19-21]。本研究中，在H2O2誘導下HLE-B3細胞發(fā)生了氧化損傷，而下調HLE-B3細胞中ROCK2表達能夠明顯抑制ROS水平，降低MDA含量，并提高SOD和GSH-Px的活性，對H2O2誘導下HLE-B3細胞的氧化損傷起到一定的保護作用。

自噬是一種進化上保守的分解代謝過程，負責依賴溶酶體的降解和再循環(huán)，在維持真核生物的細胞內穩(wěn)態(tài)和活力方面發(fā)揮著重要作用。在細胞自噬過程中，可以降解異常物質和功能失調的細胞器，以滿足和維持細胞的代謝需要，因此，自噬可由多種應激信號誘導，例如饑餓、缺氧、電離輻射、化療藥物以及感染等[22-23]。在一些情況下，自噬可以在細胞中起到機制保護作用，然而，過度自噬引起過度降解，從而對機體造成不利影響，能夠引起自噬性細胞死亡。越來越多的研究報道指出自噬與多種眼部疾病有關，如自噬失調會損害小梁網房水流出的通路并促進青光眼的惡化[24]，晶狀體在氧化應激下過度的自噬反應會導致細胞活力喪失從而進一步促進白內障的發(fā)展[25]。現已知，過量的ROS會通過觸發(fā)線粒體氧化應激，進而導致過度自噬發(fā)生[26]，本研究檢測結果同樣顯示，經H2O2誘導下HLE-B3細胞ROS水平升高，同時，細胞內自噬體和自噬溶酶體增加，自噬相關蛋白Beclin-1相對表達量顯著升高，LC3-II/LC3-Ⅰ比值也顯著上調，細胞出現過度自噬現象。通過進一步研究發(fā)現，在下調HLE-B3細胞中ROCK2表達后細胞內自噬體和自噬溶酶體均減少，自噬相關蛋白Beclin-1相對表達量顯著降低，LC3-II/LC3-Ⅰ比值顯著下調，由此說明，下調HLE-B3細胞中ROCK2表達抑制了H2O2誘導下的過度自噬，從而發(fā)揮了相關的功能作用。隨著醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，臨床上治療白內障的方法也在增多，并不斷提高與完善，生物靶向治療現也已成為國內外學者在ARC方面研究的熱點內容，包括一些抗晶狀體上皮細胞增生藥物的局部應用，或者通過制備轉染抗晶狀體上皮細胞抗體和免疫毒素的載體以抑制晶狀體上皮細胞的增生等[27]。本研究結果也為ARC的生物靶向治療研究提供了新的思路。隨著生物靶向治療進一步臻熟和臨床應用，相信ARC將得到有效的防治。但ARC的發(fā)生涉及多種致病因素，需要從多方位著手以探究有效的綜合防治策略。

4 結論

本研究結果提示，ROCK2在ARC晶狀體前囊膜中高表達，下調人晶狀體上皮細胞系HLE-B3中ROCK2表達能夠明顯改善H2O2誘導下細胞內的過度自噬以及氧化損傷，對該細胞達到較好的保護作用。