陳靜靜 陳麗霞 趙莉莉 楊永明 楊喜花,

(1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，山西 太原 030013)

糖尿病是由胰島素分泌受損和對(duì)胰島素敏感的靶器官反應(yīng)能力下降所引起的一種以高血糖為特征的代謝性疾病，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)占所有糖尿病的患者的95%以上[1]，胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是其發(fā)病機(jī)制之一，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)IR時(shí)，胰島素作用的靶器官(主要是肝臟、脂肪、骨骼肌)對(duì)葡萄糖的利用率下降[2]，引起血糖升高，而細(xì)胞間與細(xì)胞內(nèi)的血糖濃度升高將導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激改變分子和細(xì)胞成分，影響細(xì)胞機(jī)制，進(jìn)一步加重IR[3]。

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)名貴中藥，與人參、鹿茸并列為三大補(bǔ)品，有著極高的藥用價(jià)值，其活性組分及中成藥制品(如百令膠囊、金水寶膠囊)在防治糖尿病及其并發(fā)癥上發(fā)揮著重要作用[4-5]。貓棒束孢(Isaria felina，IF)是從天然冬蟲夏草蟲草體中分離得到的一株真菌，由中國科學(xué)院微生物研究所郭英蘭教授鑒定為貓棒束孢Isaria felina(DC.：Fr.)Fr，被中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏 (保藏號(hào)：CGMCC NO.0706)。前期我們已完成對(duì)貓棒束孢成分的分析測定，其藥效成分主要有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇等[6]，具有免疫調(diào)節(jié)[7]、抗腫瘤[8]、腎臟保護(hù)[9]等藥理作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)IF能夠降低T2DM血糖，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，本試驗(yàn)探討IF對(duì)胰島素抵抗Hep G2細(xì)胞模型的改善作用及可能機(jī)制，為其治療2型糖尿病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肝癌Hep G2細(xì)胞由山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院王東新教授惠贈(zèng)，由山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院傳代保種。IF由山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院自制。胰島素注射液(江蘇萬邦生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：H10890001)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)20070501)、DMEM培養(yǎng)基(Biological Industries，批號(hào)：2045184)、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為：20211126、522P054)。葡萄糖(GLU)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物科技公司，批號(hào)分別為：20210629、20220312、20220310)；IRS-1、PI3K、Akt試劑盒(凡科維商城，批號(hào)分別為：202205、202202、202202)。

1.2 儀器與設(shè)備 311型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Sun Rise酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)；Leica 090-135.001倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Olympus CX21FS1型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)；HR-40 II A2型生物安全柜(青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司)；KDC-2044型低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 Hep G2細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng) 利用含10%胎牛血清、1%青、鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2飽和濕度下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法確定細(xì)胞給藥安全范圍 將高糖DMEM培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，設(shè)立正常組和干預(yù)組，干預(yù)組加入含有貓棒束孢(終濃度為5、10、20、40、80、160、320、640 μg·mL-1)的細(xì)胞培養(yǎng)基200 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.3.3 MTT法確定胰島素誘導(dǎo)安全范圍 將高糖DMEM培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，設(shè)立正常組和干預(yù)組，干預(yù)組加入含有胰島素(終濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol·L-1)的細(xì)胞培養(yǎng)基200 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，用MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.3.4 細(xì)胞分組及上清中葡萄糖含量測定 將高糖DMEM培養(yǎng)的Hep G2細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，除正常組外其余孔加入含胰島素10-8mol·L的高糖DMEM培養(yǎng)基200 μL，誘導(dǎo)48 h后，吸棄原培養(yǎng)基，分別設(shè)立正常組(NC)、模型組(MC)、IF低劑量(IF-L)組、IF高劑量(IF-H)組，正常組和模型組加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，各給藥組加入含貓棒束孢水提取液(5、10 μg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)基200 μL，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，用葡萄糖試劑盒檢測上清液中的葡萄糖含量，以正常孔葡萄糖含量減去各孔葡萄糖含量計(jì)算出每孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.3.5 氧化應(yīng)激水平測定 根據(jù)MDA、SOD試劑盒說明書測定各分組IR-Hep G2細(xì)胞中MDA、SOD的水平。

1.3.6 ELISA檢測IRS-1/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白含量 根據(jù)IRS-1、PI3K、Akt試劑盒說明書測定各分組IR-Hep G2細(xì)胞中IRS-1、PI3K、Akt的含量。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響 各劑量組的貓棒束孢處理后的Hep G2細(xì)胞存活率均高于對(duì)照組(P<0.05)。IF濃度在5 μg·mL-1和10 μg·mL-1對(duì)細(xì)胞生長無顯著促進(jìn)作用，因此濃度選用5 μg·mL-1和10 μg·mL-1。見表1。

表1 不同濃度貓棒束孢處理后對(duì)Hep G2細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effects of different concentrations of IF on survival rate in Hep G2 cells

2.2 胰島素對(duì)細(xì)胞存活率的影響 除10-5mol·L-1組外，其余劑量組經(jīng)胰島素處理后的Hep G2細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在處理48 h后，只有10-8mol·L-1劑量組對(duì)細(xì)胞生長無顯著抑制作用，綜合選用10-8mol·L-1的胰島素誘導(dǎo)48 h建立IR-Hep G2模型。見表2。

表2 不同濃度胰島素處理后對(duì)Hep G2細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of insulin on survival rate in Hep G2 cells

2.3 貓棒束孢對(duì)IR-Hep G2細(xì)胞模型的影響 與正常組比較，模型組IR-Hep G2細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著下降(P<0.01)，說明IR-Hep G2模型建造成功。與模型組比較，各濃度貓棒束孢干預(yù)后的IR-Hep G2細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著上升(P<0.01)，說明貓棒束孢能夠恢復(fù)IR-Hep G2細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力。見圖1。

圖1 貓棒束孢對(duì)IR-Hep G2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Figure 1 Effects of IF on glucose consumption in IR-Hep G2 cells注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

2.4 氧化應(yīng)激水平測定 與正常組相比，模型組IR-Hep G2細(xì)胞的SOD含量顯著下降(P<0.01)，MDA含量顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，貓棒束孢(5 μg·mL-1)干預(yù)后的IR-Hep G2細(xì)胞的SOD含量顯著上升(P<0.01)，MDA含量顯著下降(P<0.01)，貓棒束孢(10 μg·mL-1)干預(yù)后只顯著升高M(jìn)DA含量(P<0.01)。見圖2。

圖2 貓棒束孢對(duì)IR-Hep G2細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響Figure 2 Effects of IF on oxidative stress of IR-Hep G2 cells注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01

2.5 對(duì)IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響 與正常組相比，模型組IR-Hep G2細(xì)胞的IRS-1、PI3K、Akt的含量顯著降低(分別為P<0.01、P<0.01、P<0.05)，與模型組相比，貓棒束孢(5 μg·mL-1)干預(yù)后，IRS-1、PI3K、Akt的含量顯著上升(分別P<0.01、P<0.01、P<0.01)，貓棒束孢(10 μg·mL-1)干預(yù)后，只有PI3K的含量顯著上升(P<0.05)，見表3。

表3 貓棒束孢對(duì)Hep G2細(xì)胞IRS-1、PI3K、Akt含量的影響Table 3 Effects of IF on contents of IRS-1、PI3K、Akt in Hep G2 cells

3 討論

肝臟是人體最大的糖代謝器官，通過糖酵解、肝糖原的合成與分解、糖異生等途徑參與機(jī)體對(duì)葡萄糖的代謝，是胰島素作用的靶器官之一。Hep G2細(xì)胞是一種與肝細(xì)胞極為相似的肝胚胎瘤細(xì)胞株，具有肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性，由Hep G2細(xì)胞建立的IR模型是公認(rèn)的用于研究IR發(fā)生機(jī)制的理想模型[10]，常用于研究降糖藥物的作用機(jī)制。IR是機(jī)體對(duì)生理濃度的胰島素的敏感反應(yīng)性低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種病理狀態(tài),主要表現(xiàn)為胰島素抑制肝臟葡萄糖釋放以及外周組織 (脂肪和肌肉) 利用葡萄糖能力下降[11]。本實(shí)驗(yàn)通過將Hep G2細(xì)胞置于1×10-8mol·L-1的胰島素中48 h建立IR模型，并給予IF干預(yù)，結(jié)果顯示，IF能夠提高IR-Hep G2的葡萄糖消耗量，改善糖代謝。

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多，抗氧化防御功能損害，導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化狀態(tài)失衡，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的氧化損傷[12-13]，自由基與脂質(zhì)結(jié)合后，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA，因此MDA的定量被廣泛用作氧化生物標(biāo)志物，以評(píng)估組織中氧自由基含量及細(xì)胞損傷程度[14]。SOD是酶抗氧化防御系統(tǒng)中的重要組成成員，是對(duì)抗氧化應(yīng)激的第一道生理防線，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要的作用，能夠清除超氧陰離子自由基O2-并保護(hù)細(xì)胞免受損傷[15-17]。高血糖是引起氧化應(yīng)激和氧化物產(chǎn)生的最重要的原因之一，氧化應(yīng)激在胰島素抵抗中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，氧化應(yīng)激程度增加被認(rèn)為有助于糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[14]。已有研究[18]證實(shí)，抗氧化治療可以逆轉(zhuǎn)肥胖小鼠模型中脂肪組織的胰島素抵抗，抗氧化劑補(bǔ)充劑不僅可以降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，改變膜性質(zhì)來改善胰島素作用并降低葡萄糖水平[19]，也對(duì)糖尿病繼發(fā)性并發(fā)癥有效。IRS-1/PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖代謝最主要的信號(hào)通路，正常狀態(tài)下通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮著調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)的作用，SOD分泌不足，MDA產(chǎn)生過多，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)會(huì)抑制胰島素與IRS-1的結(jié)合，進(jìn)一步抑制胰島素受體(InsR)和PI3K的磷酸化，導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)異常，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用能力受損，胰島素敏感性降低，繼而又加重胰島素抵抗程度[20]，血糖持續(xù)升高促進(jìn)T2DM的發(fā)生。本研究中，IF可以通過緩解IR-Hep G2細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，恢復(fù)胰島素與IRS的結(jié)合，通過PI3K/AKT信號(hào)途徑調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝，發(fā)揮胰島素生理學(xué)效應(yīng)。

4 結(jié)論

IF能夠提高IR-Hep G2細(xì)胞模型中葡萄糖的消耗量，提高SOD含量，降低MDA含量，改善細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并通過調(diào)控IRS/PI3K/AKT信號(hào)通路改善胰島素抵抗。該試驗(yàn)從細(xì)胞層面敘述了貓棒束孢對(duì)胰島素抵抗改善的上游信號(hào)作用機(jī)制，后續(xù)將繼續(xù)探討貓棒束孢對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路下游靶向糖原合成激酶3和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4的調(diào)控機(jī)制。