周翔 劉志文 成平 張三勇 許向青 姜文玲 唐程遠(yuǎn) 賀理宇

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腎內(nèi)科·腎臟疾病與血液凈化學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410011)

膜性腎病(Membranous nephropathy，MN)是一種免疫復(fù)合物沉積于腎小球基底膜并伴基底膜增厚等病理改變?yōu)樘卣鞯哪I小球疾病[1-2]，根據(jù)病因分類，大約有五分之四的患者無明確病因稱之為特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy，IMN)，另外20%的MN常常繼發(fā)于其他疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、乙型病毒性肝炎等，稱之為繼發(fā)性膜性腎病。此外，藥物、毒物、腫瘤或環(huán)境因素等也可以引起繼發(fā)性膜性腎病[3]。鞣花酸(Ellagic acid，EA)是一種存在于各種軟質(zhì)水果、堅果和其他植物組織中的天然多酚，有研究[4-5]證實，EA在潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸癌等多種疾病中具有抗氧化和抗炎等作用。在腎臟疾病中，亦有研究[6]報道，EA可以通過抑制腎組織氧化應(yīng)激而對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。哺乳動物不育系20樣激酶(Mammalian sterile 20-like kinase 1，MST1)基因是Hippo信號通路中的關(guān)鍵基因[7]，核因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是一種重要的細(xì)胞抗氧化轉(zhuǎn)錄因子[8]。且已有文獻[9]報道，Mst1-Nrf2通路可以調(diào)控機體的氧化應(yīng)激，既往采用丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)和過氧化酶(Catalase，CAT)這3個比較公認(rèn)的機體抗氧化能力作為監(jiān)測指標(biāo)的研究[10]提示，EA可能通過Mst1- Nrf2通路抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激從而緩解阿霉素誘導(dǎo)的大鼠局灶節(jié)段性腎小球硬化。EA是否可通過Mst1- Nrf2通路改善MN的腎臟損傷尚少文獻報道。通過尾靜脈注射陽離子化牛血清白蛋白(Cationic bovine serum albumin，C-BSA)構(gòu)建的MN大鼠模型是應(yīng)用廣泛且成熟的動物模型之一[11-12]，本研究中利用此模型來評估EA在MN干預(yù)治療中可能的作用和機制，以期為臨床MN的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠(SPF級、8周齡)購自于湖南斯萊克景達公司，在保證正常飲食飲水、晝夜規(guī)律等適宜其生長的常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗動物的飼養(yǎng)和處理均遵循醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會的規(guī)范和條例。

1.2 主要試劑及儀器 鞣花酸購自于美國Sigma公司；C-BSA購自于美國Chondrex公司；GSH-PX測試盒、GSH檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒和CAT檢測試劑盒購自于南京建成生物公司；HE染色液、蘇木素分色液、多聚甲醛等購自于武漢塞維爾生物公司；cDNA 合成試劑盒、SYBR green QPCR擴增試劑盒購自于TaKaRa公司。使用的主要儀器包括美國Roche公司生產(chǎn)的實時熒光定量PCR儀、美國賽默飛公司生產(chǎn)的NanoDrop 2000 分光光度計、美國MD公司生產(chǎn)的多功能酶標(biāo)儀、重慶博士泰生產(chǎn)的全自動特定蛋白分析儀、德國徠卡公司生產(chǎn)的熒光顯微鏡及石蠟切片機等。

1.3 方法

1.3.1 膜性腎病大鼠模型的構(gòu)建、藥物干預(yù)及標(biāo)本處理 將剛購置的大鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組，實驗組和模型組各8只，對照組6只。MN大鼠模型制備過程如下：①預(yù)免疫處理：將1 mg C-BSA與0.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)和等量弗氏不完全佐劑充分震蕩，得到混合液體。之后每次將0.1 mL混合液體注射于模型組和實驗組大鼠的腹股溝、腋下等皮下部位，隔日一次，共注射3次，對照組不注射C-BSA，其余處理同模型組。②正式免疫處理：將2.5 mg C-BSA與1 mL的PBS充分混勻得到混合液體，實驗組和模型組大鼠注射0.5 mL混合液體，對照組大鼠單純注射同劑量PBS。都通過大鼠尾靜脈注射，且注射頻率為連續(xù)4周、每周3次。4周后通過特定蛋白分析儀測定的各組大鼠24 h尿蛋白定量結(jié)果，若模型組結(jié)果大于20 mg/L則考慮構(gòu)建成功。③藥物干預(yù)：造模成功后，實驗組按200 mg/kg體重腹腔注入鞣花酸，注射頻率為每日一次、持續(xù)4周，模型組注入等體積生理鹽水。④四周后各組大鼠行異氟烷麻醉后處死,收集24 h尿液，常溫下2000 rpm、離心10 min，取上清液-80℃凍存。通過腹主動脈收集血液，常溫下4000 rpm、離心10 min，取上層血清-80℃凍存。摘取腎臟標(biāo)本剪成小塊后分為兩份，一份用多聚甲醛固定后，石蠟包埋；其余分裝后-80℃凍存。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測方法 ①利用全自動生化儀測定血清膽固醇(Cholesterol，CHO)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、白蛋白(Alb)。②利用重慶博士泰全自動特定蛋白分析儀檢測尿總蛋白(Urinary total protein n，UTP)、尿白蛋白(Urinary albumin，Ualb)、尿1-MG、尿2-MG、尿NAG、尿NGAL和尿RBP等。③采用TBA法按試劑盒說明書步驟測定腎組織中MDA。④采用DTNB法按試劑盒說明書步驟測定腎組織中GSH。⑤采用鉬酸銨法按試劑盒說明書步驟測定腎組織中CAT的活性。

1.3.3 石蠟切片的免疫 熒光腎組織石蠟包埋后切片，按常規(guī)免疫組化操作順序脫蠟、水化、封閉、加抗體、封片等步驟后，使用熒光顯微鏡觀察。

1.3.4 實時熒光定量PCR 腎組織用Trizol處理后提取總RNA并測定RNA濃度，再用常規(guī)PCR儀反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再根據(jù)試劑說明書流程采用RT-PCR檢測，使用Roche專業(yè)軟件進行相對定量法分析。

2 結(jié)果

2.1 鞣花酸對C-BSA誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病模型常用臨床指標(biāo)的改善作用 分別檢測3組大鼠模型的Scr、BUN、Alb、24 h UTP、CHO和腎小管性尿蛋白各指標(biāo)水平(α1-MG、β2-MG、RPB、NAG和NGAL)。與對照組相比，模型組大鼠的Scr、BUN、Alb、24 h UTP及CHO水平均明顯惡化加重(P<0.05)。但當(dāng)使用了鞣花酸干預(yù)后，與模型組大鼠相比，實驗組大鼠各項指標(biāo)均顯著好轉(zhuǎn)(P<0.05)(見表1)。對于腎小管性尿蛋白，與對照組相比，模型組大鼠的尿α1-MG、尿β2-MG、尿RBP、尿NAG和尿NGAL水平均明顯升高(P<0.05)，但當(dāng)使用了鞣花酸干預(yù)后，與模型組相比，實驗組大鼠各項指標(biāo)均明顯下降(P<0.05)。見表2。

表1 3組大鼠模型血肌酐、尿素氮、血清白蛋白、24 h尿總蛋白和血膽固醇檢測結(jié)果Table 1 Results of serum creatinine,blood urea nitrogen,serum albumin,24-hour urine protein and blood cholesterol in rat models of the three groups

表2 3組大鼠模型腎小管性尿蛋白檢測結(jié)果Table 2 Results of renal tubular urinary protein in rat models of the three groups

2.2 鞣花酸緩解C-BSA誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病的腎臟病理損傷 各組采用HE染色和IgG免疫熒光檢測來衡量其病理損傷程度。結(jié)果顯示，對照組大鼠腎臟組織中腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰，免疫熒光染色IgG沉積較少；模型組大鼠腎小球體積明顯增大，部分腎小管萎縮消失；免疫熒光染色示IgG沿系膜區(qū)及毛細(xì)血管壁呈顆粒樣沉積。但當(dāng)使用了鞣花酸干預(yù)后，上述病理損傷明顯減輕。見圖1。

圖1 鞣花酸緩解C-BSA誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病的腎臟病理損傷(400×)Figure 1 Ellagic acid alleviates renal pathological damage induced by C-BSA in rats with MN注：A.HE染色；B.IgG的免疫熒光

2.3 鞣花酸緩解C-BSA誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病的氧化應(yīng)激 模型組MDA含量明顯高于對照組(P<0.05)，實驗組MDA水平較模型組明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，模型組的GSH和CAT的水平均顯著降低，抗氧化能力減弱(均P<0.05)，而在使用了鞣花酸干預(yù)后，GSH和CAT的水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。說明使用鞣花酸干預(yù)后可以顯著提升C-BSA誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病的抗氧化能力。見表3。

表3 3組大鼠模型血清丙二醛、谷胱甘肽和過氧化氫酶檢測結(jié)果Table 3 Results of serum malondialdehyde,glutathione and catalase in rat models of the three groups

2.4 鞣花酸可抑制Mst1的表達，促進Nrf2的表達 與對照組比較，模型組Mst1 mRNA表達升高，Nrf2 mRNA表達下降(均P<0.05)，但當(dāng)使用了鞣花酸干預(yù)后，與模型組相比，Mst1 mRNA表達下降，Nrf2 mRNA表達升高(均P<0.05)。同時，通過蛋白免疫印跡也進一步確定鞣花酸治療可以抑制MN大鼠MST1蛋白表達、促進NRF2蛋白表達(P<0.05)。提示鞣花酸可能通過Mst1-Nrf2通路對C-BSA誘導(dǎo)的MN大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。見圖2。

圖2 鞣花酸可抑制Mst1的表達，促進Nrf2的表達(n=4)Figure 2 Ellagic acid inhibited the expression of Mst1 and promoted the expression of Nrf2注：A.RT-PCR檢測Mst1 mRNA的表達;B.RT-PCR檢測Nrf2 mRNA的表達;C.蛋白免疫印跡檢測MST1和NRF2蛋白的表達。GAPDH作為內(nèi)對照。與模型組比較，①P<0.05

2.5 Mst1和 Nrf2 mRNA表達與MN大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析 為進一步明確Mst1 和 Nrf2 mRNA表達與MN大鼠腎臟氧化應(yīng)激的相關(guān)性，分別分析了MN大鼠Mst1和 Nrf2 mRNA表達與氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH和CAT的相關(guān)性。Spearman's相關(guān)分析顯示，Mst1 mRNA表達與MDA呈正相關(guān)(r=0.7539 )(見圖3A)，與GSH和CAT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9117和r=-0.8478)(見圖3B、圖3C)。Nrf2 mRNA表達與MDA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7267)(見圖3D),與GSH和CAT呈正相關(guān)(r=0.8012和r=0.7423)(見圖3E、圖3F)。結(jié)果提示Mst1和Nrf2參與調(diào)控了C-BSA誘導(dǎo)的MN大鼠的氧化應(yīng)激。

圖3 Mst1和 Nrf2 mRNA表達與MN大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis of Mst1 and Nrf2 mRNA expression and renal oxidative stress index in MN rats注：A～C.Mst1 mNA表達與氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH和CAT的相關(guān)性分析 ；D～F.Nrf2 mRNA表達與氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、GSH和CAT的相關(guān)性分析

3 討論

膜性腎病臨床通常伴隨有大量蛋白尿，其他表現(xiàn)為沒有癥狀或不是腎臟疾病引起的蛋白尿[13-14]。目前在臨床上IMN的治療十分困難，預(yù)后不佳，因此，找到一個切實可行的治療方案具有十分重要的意義[15]。盡管關(guān)于IMN的發(fā)病機制截至目前也沒有被完全闡明，但既往已有研究證實氧化應(yīng)激在IMN的進程中有重要價值[16-17]。有研究[18]證實，Mst1缺乏可以減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激，Nrf2基因激活后能夠抑制線粒體活性氧(ROS)和炎癥因子的產(chǎn)生[19]，所以Mst1-Nrf2通路參與了細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)反應(yīng)[20]。盡管目前關(guān)于Mst1-Nrf2通路介導(dǎo)的抗氧化作用的研究得到了很大的進展，但關(guān)于Mst-Nrf2通路在膜性腎病中的作用尚不明確。

鞣花酸是植物天然多酚化合物，已有研究[21-23]證實，EA在多種疾病中具有抗氧化和抗炎等作用。在腎臟疾病中，有文獻[6]報道，鞣花酸可以通過抑制腎組織氧化應(yīng)激而對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。既往研究[10]也提示鞣花酸可能通過Mst1- Nrf2通路抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激從而緩解阿霉素誘導(dǎo)的大鼠局灶節(jié)段性腎小球硬化。那么EA是否可通過Mst1- Nrf2通路抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而改善MN的腎臟損傷尚未有研究證實。

在本研究中，采用了應(yīng)用廣泛且成熟的膜性腎病大鼠模型[11-12]，待模型構(gòu)建成功后，通過鞣花酸的干預(yù)進而分析鞣花酸MN大鼠的治療作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與膜性腎病大鼠組相比，鞣花酸干預(yù)組的Scr、BUN、Alb、總蛋白定量、CHO和腎小管性尿蛋白各組分均顯著好轉(zhuǎn)。同時，通過免疫熒光檢測等也發(fā)現(xiàn)通過鞣花酸的干預(yù)治療對減輕膜性腎病大鼠的腎臟病理損傷作用明顯。此外，實驗組腎組織GSH和CAT的水平均顯著上調(diào)，而MDA水平降低，說明使用鞣花酸干預(yù)后可以顯著提升C-BSA誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病的抗氧化能力。在機制上分析，與模型組相比，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠Mst1 mRNA表達下降，Nrf2 mRNA表達增加，提示鞣花酸可能通過Mst1-Nrf2通路對膜性腎病大鼠發(fā)揮腎臟保護作用。但是本實驗研究僅僅檢測了Mst1和Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平變化，關(guān)于鞣花酸是否真正通過Mst1-Nrf2通路而發(fā)揮腎臟保護作用尚需進一步的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，鞣花酸可能通過Mst1-Nrf2通路減輕腎組織的氧化應(yīng)激從而緩解C-BSA誘導(dǎo)的膜性腎病大鼠的腎臟病變，在膜性腎病的防治中具備潛在臨床運用價值，但其具體的作用機制仍需進一步深入研究。