李東賓 徐婧 何立平 許志斌 沈登鋒

（1.浙江省寧波市林場(chǎng)，浙江 寧波 315440；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040）

杜鵑花屬（Rhododendron）是北半球最大的木本植物屬，屬內(nèi)植物大多株形古樸優(yōu)雅、花色豐富艷麗，具有極高的觀賞價(jià)值，是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花，在世界園藝界也占有重要地位[1]。中國(guó)是野生杜鵑花屬植物資源最豐富的國(guó)家，有720種，其中特有種450種[2]。浙江省杜鵑花資源有17種2變種及1變型（不包括栽培種）[3]，浙東四明山區(qū)域有自然分布的為映山紅（R.simsii）、滿山紅（R.mariesii）、華頂杜鵑（R.huadingense）、羊躑躅（R.molle）、馬銀花（R.ovatum）、云錦杜鵑（R.fortunei）6種，隸屬于4個(gè)亞屬[4]。

遺傳多樣性是生物多樣性的本質(zhì)，是物種適應(yīng)環(huán)境的核心基礎(chǔ)和進(jìn)化的內(nèi)在動(dòng)力，也是保護(hù)生物學(xué)研究重點(diǎn)工作，可為物種保護(hù)及利用提供適宜的策略[5]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)體系日益成熟，利用分子標(biāo)記技術(shù)探究評(píng)估種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系已成為一種常用方法[6]。EST-SSR分子標(biāo)記隨轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的成熟開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單，具有信息量大、共顯性、通用性高等特點(diǎn)[7]，已被廣泛運(yùn)用于龜峰山杜鵑花[8]、西雙版納苦茶[9]、邵武碎銅茶[10]、貴州刺梨[11]、額濟(jì)納濕地多枝檉柳[12]等種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究和親緣關(guān)系分析，并取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

四明山區(qū)域地處浙東寧波市西南 部，位 于121°0′31″～121°25′33″E，29°32′13″～29°59′56″N，光照充足，雨量充沛，屬于典型的北亞熱帶氣候[13]。區(qū)域內(nèi)地形復(fù)雜，山勢(shì)險(xiǎn)峻，溝谷縱橫，植物資源豐富，是寧波最重要的生態(tài)保護(hù)區(qū)和水源涵養(yǎng)地。四明山區(qū)域分布著國(guó)內(nèi)最大規(guī)模的華頂杜鵑野生種群，華頂杜鵑為浙江省特有種，觀賞價(jià)值高，自然分布區(qū)域狹窄，種群數(shù)量稀少，并且在系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要價(jià)值[14]，已被列為浙江省珍稀瀕危植物、國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。華頂杜鵑1990年才被發(fā)現(xiàn)于天臺(tái)華頂山，因獨(dú)特的形態(tài)特征其分類歸屬尚存爭(zhēng)議，顏士輝[15]、李美芹[16]等做了華頂杜鵑的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及親緣關(guān)系分析，均未能明確解決它的分類歸屬問(wèn)題。本文利用EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行四明山區(qū)域內(nèi)野生杜鵑花資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，從分子角度分析區(qū)域內(nèi)杜鵑花資源的種群遺傳多樣性和親緣關(guān)系以及華頂杜鵑的分類歸屬問(wèn)題，旨在為該區(qū)域內(nèi)野生杜鵑花的資源保護(hù)、種群恢復(fù)、種質(zhì)創(chuàng)新提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對(duì)象為在四明山區(qū)域有自然分布的映山紅、滿山紅、華頂杜鵑、云錦杜鵑、馬銀花和羊躑躅6種野生杜鵑花資源。測(cè)試樣品于2021年9月在四明山國(guó)家森林公園內(nèi)海拔600～800m野生杜鵑花分布比較集中的區(qū)塊內(nèi)尋找目標(biāo)野生杜鵑花資源并取樣，每個(gè)種采樣15個(gè)單株，單株距離要大于30m，每株采集3～5片健康幼嫩葉片，迅速置于盛有變色硅膠的密封袋干燥保存。采集完成后帶回實(shí)驗(yàn)室用液氮處理后存于-70℃超低溫冰箱，用于DNA提取。

1.2 DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

采用改良CTAB法[17]提取試驗(yàn)樣品總DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行杜鵑花DNA分子量檢測(cè)，用紫外分光光度計(jì)（nano drop 2000）檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量和濃度，最終統(tǒng)一將不同樣品的DNA濃度稀釋至50ng/μL于-20℃放置備用。

1.3 EST-SSR引物的篩選

參照紅馬銀花的12對(duì)多態(tài)性好且穩(wěn)定的EST-SSR引物序列[18]進(jìn)行本試驗(yàn)引物的篩選，每種杜鵑花隨機(jī)選擇3個(gè)基因組DNA作為模板對(duì)12對(duì)引物進(jìn)行篩選，選取條帶擴(kuò)增清楚，多態(tài)性高的引物用來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)材料的群體遺傳多樣性分析。引物由上海生物工程公司合成，篩選出的引物在正引物的5'末端進(jìn)行熒光標(biāo)記。PCR體系20μL：10μL 2×Taq plus PCR MasterMix ，1μL 50μg/mL模板DNA、0.3μL 10uM 的正向引物和反向引物、和去離子水補(bǔ)足至20μL。PCR 擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，53～58℃退火30s，72℃延伸45s，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)；72℃最終延伸7min，最后4℃保存終止反應(yīng)。利用毛細(xì)管電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，使用genemarker 2.0進(jìn)行結(jié)果的確認(rèn)和讀取。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

使用GenAlex 6.41估算6個(gè)種群的遺傳參數(shù)，包括位點(diǎn)比較等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、shannon多樣性指數(shù)（I）、群體內(nèi)固定系數(shù)（F）等來(lái)衡量6個(gè)杜鵑種群內(nèi)遺傳多樣性的水平。并計(jì)算種群間遺傳分化系數(shù)（Fst）、基因流（Nm）、Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離、親緣關(guān)系及主成分分析(PCoA)和分子方差分析（AMOVA）等，并根據(jù) Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離，利用 NTSYSpc 2.10e軟件非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)對(duì)各居群進(jìn)行聚類來(lái)分析種群間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

使用6個(gè)不同種的杜鵑花基因組DNA進(jìn)行了12對(duì)EST-SSR引物組合篩選，共篩選出6對(duì)電泳條帶清楚，多態(tài)性高的引物組合用于試驗(yàn)樣品的遺傳分析。

表1 篩選出的6對(duì)EST-SSR引物的序列信息

2.2 6種杜鵑花資源的遺傳多樣性分析

根據(jù)GenAlex分析結(jié)果（表2）可知，四明山6種野生杜鵑花的遺傳多樣性參數(shù)差異明顯。等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）為1.75～5.50、1.33～2.87，均表現(xiàn)為馬銀花最大，華頂杜鵑最小。馬銀花和華頂杜鵑的觀測(cè)雜合度（Ho）＞期望雜合度（He），其余4種則Ho＜He。Shannon’s多樣性指數(shù)（I）比較得出，馬銀花和羊躑躅的遺傳多樣性顯著高于華頂杜鵑，排序?yàn)轳R銀花＞羊躑躅＞映山紅＞云錦杜鵑＞滿山紅＞華頂杜鵑。比較F固定指數(shù)可知，映山紅0.621最高，滿山紅和云錦杜鵑接近于0，而華頂杜鵑最低為-0.385。

表2 6個(gè)杜鵑花屬種群遺傳多樣性指數(shù)

由表3可知，四明山野花杜鵑生資源種群間遺傳分化系數(shù)Fst為0.125～0.420，平均值0.274，馬銀花與華頂杜鵑種群間的遺傳分化最大，與羊躑躅種群間的遺傳分化最??；種群間基因流(Nm)為 0.345～1.743，平均值0.786，馬銀花與羊躑躅種群間的基因流最大，與華頂杜鵑種群間的基因流最小。野生杜鵑種群的分子方差(AMOVA)分析顯示(表4)，31%的遺傳變異存在于種群間，69%的遺傳變異存在于種群內(nèi)。

表3 6個(gè)杜鵑花屬種群成對(duì)分化系數(shù)及基因流分析

表4 6個(gè)杜鵑花屬種群分子方差（AMOVA）分析

2.3 6種杜鵑花資源的親緣關(guān)系分析

由表5可知，6種杜鵑花親緣關(guān)系為0.114～0.816，遺傳距離為0.203～2.173。其中馬銀花和滿山紅遺傳距離最大為2.220，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)為0.109；滿山紅與華頂杜鵑遺傳距離最小為0.252，親緣關(guān)系最近為0.778。利用 Nei's遺傳距離，采用平均聚類法對(duì)6種杜鵑花自然種群進(jìn)行聚類分析（圖1），6種野生杜鵑花資源明顯聚為2組4類，映山紅、滿山紅和華頂杜鵑聚為1類，其他3種單獨(dú)為1類。利用 GenAlEx 分析種群間主成分分析(圖2)，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為 66.26%和20.64%，累計(jì)貢獻(xiàn)率86.90%。圖中2個(gè)種的距離越近，說(shuō)明其遺傳背景差異越小，親緣關(guān)系越近。結(jié)果表明，映山紅、滿山紅和華頂杜鵑明顯聚在一起，與其他3種彼此距離較遠(yuǎn)，此結(jié)果和基于Nei's 遺傳距離得出的聚類結(jié)果一致。

表5 6個(gè)杜鵑屬種群遺傳距離和親緣關(guān)系

圖1 6個(gè)杜鵑花的聚類分析圖

圖2 6個(gè)杜鵑花種群的PCA分析

3 討 論

3.1 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是衡量一個(gè)物種環(huán)境適應(yīng)力和進(jìn)化潛力的重要指標(biāo)，是物種生存和進(jìn)化的內(nèi)在基礎(chǔ)，遺傳多樣性越高，適應(yīng)性越強(qiáng)和進(jìn)化潛力越大[12]。本研究選用了同屬植物紅馬銀花的12對(duì)EST-SSR引物篩選出了6對(duì)擴(kuò)增效果好、多態(tài)性高的引物進(jìn)行了四明山區(qū)域內(nèi)6種杜鵑花屬植物的遺傳多樣性分析，表明杜鵑花屬植物的遺傳背景具有很高的相似性，引物的通用性較好，所用的EST-SSR引物可推廣應(yīng)用于更多杜鵑花屬植物。結(jié)果顯示四明山區(qū)域內(nèi)的馬銀花 (He=0.583，I=1.216)、羊躑躅（He=0.558，I=1.048）、云錦杜鵑(He=0.456，I=0.822)跟同屬的其他杜鵑相比擁有很高的遺傳多樣性，這和相關(guān)杜鵑花遺傳多樣性研究結(jié)論基本一致[16,18,19]。調(diào)查區(qū)域內(nèi)羊躑躅種群的數(shù)量極少，但其遺傳多樣性卻不低，推測(cè)造成這種現(xiàn)象的原因是區(qū)域內(nèi)近期花木種植造成的羊躑躅適生環(huán)境破壞和因其獨(dú)特的藥用價(jià)值帶來(lái)的大肆采挖導(dǎo)致的居群數(shù)量驟減，這和紅馬銀花[18]、白桫欏[20]、櫨菊木[21]的致瀕因素一致。華頂杜鵑He、I兩個(gè)遺傳多樣性參數(shù)均為6種杜鵑花資源中最低（He=0.190，I=0.298），表明華頂杜鵑在四明山野生杜鵑花種群中遺傳多樣性水平最低。再加上其生境島狀狹域分布、野外數(shù)量很少、種群結(jié)構(gòu)多為衰退型[22]，屬于典型的極小種群瀕危植物，如果不及時(shí)加以保護(hù)，其潛在的基因資源就會(huì)隨植株的消亡而消失。依據(jù)Nagylaki[23]的理論，固定指數(shù)（F）大于0的映山紅和羊躑躅存在較高的近交現(xiàn)象，云錦杜鵑和滿山紅固定指數(shù)接近0以自由交配為主，馬銀花和華頂杜鵑固定指數(shù)小于0，主要以異交為主。

遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)可以用來(lái)描述種群間的分化程度，種群間分化系數(shù)越大，基因流越小，則種群間差異就越大。四明山野生杜鵑種群間的Fst均值為0.274，大于貴州百里杜鵑（Fst=0.133）[24]和大別山地區(qū)杜鵑（Fst=0.175）[25]種群間的遺傳分化系數(shù)，并且超過(guò)0.25，說(shuō)明四明山區(qū)域內(nèi)杜鵑花資源已存在很大的遺傳分化?；蛄鳎∟m）大于1時(shí)，種群間的基因交流比較廣泛，能夠抵制種群間由遺傳漂變引起的遺傳分化，而基因流小于1，則種群間基因交流受阻，遺傳分化加重[26]。四明山野生杜鵑花種群間基因流均值0.786，表明種群間基因交流受阻。本研究中華頂杜鵑與馬銀花的遺傳分化系數(shù)最大、基因流最小，表明該區(qū)域內(nèi)兩種杜鵑花的差異最大。6種杜鵑自然種群的分子方差(AMOVA)分析顯示，31%的遺傳變異存在于種群間，69%的遺傳變異存在于種群內(nèi)。表明種群間已出現(xiàn)明顯分化，該結(jié)果與種群間遺傳分化系數(shù)得出的結(jié)論相一致。

3.2 親緣關(guān)系分析

四明山6種野生杜鵑花資源隸屬于4種杜鵑花亞屬，其中云錦杜鵑屬于常綠杜鵑亞屬（Subgen.Hymenanthes(Blume)K.Koch），馬銀花屬于馬銀花亞屬（Subgen.AzaleastrumPlanch.ex K.Koch），羊躑躅屬于羊躑躅亞屬（Subgen.Pentanthera(G.Don) Pojarkova），映山紅和滿山紅屬于映山紅亞屬（Subgen.Tsutsusi(G.Don)Pojarkova）。本研究聚類結(jié)果和PCA分析結(jié)果一致，均表現(xiàn)為映山紅和滿山紅具有很近的親緣關(guān)系，符合經(jīng)典系統(tǒng)分類；結(jié)果還顯示馬銀花和羊躑躅也有較近的親緣關(guān)系，這和李美芹[16]、張哲瑋[27]、黃承玲[28]的聚類結(jié)果基本一致；以上都表明了本研究得出的親緣關(guān)系具有較好的準(zhǔn)確性。華頂杜鵑為丁炳揚(yáng)1990年才發(fā)現(xiàn)的新種[29]，根據(jù)其落葉習(xí)性、小枝具柔毛和葉3～5枚假輪生狀密集枝頂，將其歸入映山紅亞屬輪葉杜鵑組，但其種子形態(tài)具有許多獨(dú)特之處，與其余種類均明顯不同[30]。后來(lái)章月皎以花芽、葉芽、花粉以及種子形態(tài)特征為依據(jù)認(rèn)為華頂杜鵑應(yīng)該屬于羊躑躅亞屬的成員[14]。顏士輝等做了華頂杜鵑ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及親緣關(guān)系的初步分析，結(jié)果對(duì)華頂杜鵑的分類地位沒(méi)有得到明確結(jié)論[15]。李美芹等以寧波地區(qū)的杜鵑花種質(zhì)資源為研究材料開(kāi)發(fā)EST-SSR引物并探究遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，聚類結(jié)果顯示華頂杜鵑和云錦杜鵑聚為一類[16]，但華頂杜鵑和云錦杜鵑植株形態(tài)和特性均差異很大，很難劃歸于同一類群。本研究通過(guò)篩選的ESTSSR引物對(duì)華頂杜鵑的遺傳多樣性和親緣關(guān)系做了分析，結(jié)果顯示華頂杜鵑與滿山紅親緣關(guān)系最近，與羊躑躅和馬銀花親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本結(jié)論與丁炳揚(yáng)最初根據(jù)其形態(tài)特征作出的分類歸屬一致，佐證了華頂杜鵑隸屬于映山紅亞屬輪生葉杜鵑組的結(jié)論。但結(jié)論仍然受到樣本量的代表性和ESTSSR分子標(biāo)記的引物以及方法局限性的限制，后續(xù)可利用其他分子標(biāo)記或者基因測(cè)序等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

優(yōu)先保護(hù)瀕危植物有助于延緩物種多樣性的流失、維護(hù)生態(tài)平衡以及促進(jìn)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展，對(duì)我國(guó)生物多樣性保護(hù)具有重要意義[31]。羊躑躅具有很高的藥用價(jià)值，花、果實(shí)和根等均可供藥用，可祛風(fēng)除濕、舒筋活血、鎮(zhèn)痛止痛。雖然試驗(yàn)結(jié)果顯示其仍具有較高的遺傳多樣性水平，但因人為掠奪式挖掘，導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)植株急劇減少，建議采取搶救式種質(zhì)資源異地保存，輔以種苗擴(kuò)繁的資源保護(hù)措施。華頂杜鵑具有眾多特異的植物學(xué)性狀，在杜鵑花屬植物的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育中具有重要的研究?jī)r(jià)值，其種群數(shù)量極少、遺傳多樣性水平低，屬于典型的極小種群瀕危植物。建議在就地保護(hù)和遷地保育的基礎(chǔ)上，開(kāi)展人工多種源種苗繁育并嘗試野外回歸工作，增加野外種群的植株數(shù)量、優(yōu)化種群的年齡結(jié)構(gòu)、豐富種群的遺傳多樣性，緩解其瀕危程度。