阿麗米熱·伊力哈木，卡米力江·買買提明，美爾瓦提，李朝陽

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 1.整形外科；2.頜面外科；3.臨床心理科 新疆 烏魯木齊 830001）

深部燒傷、嚴(yán)重外傷或感染后皮膚的異常修復(fù)均可導(dǎo)致組織內(nèi)成纖維細(xì)胞（Fibroblasts，F(xiàn)B）過度增殖以及增生性瘢痕（Hypertrophic scars，HS）的形成[1-2]。HS會導(dǎo)致嚴(yán)重的畸形及其他不良反應(yīng)，給患者精神上造成巨大痛苦。盡管目前瘢痕治療方法較多，但均很難獲得理想效果[3]。脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是一種從脂肪組織中分離出來的重要干細(xì)胞類型，具有易獲取、多向分化、增殖潛力高和自我更新等特性[4]。外泌體（Exosome，Exo）是徑粒大小40～100 nm的細(xì)胞外小囊泡，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為，充當(dāng)細(xì)胞間通訊工具[5]。ADSCs來源Exo是ADSCs旁分泌釋放的重要成分，具有多種生物學(xué)活性。組織再生需要多種生長因子、蛋白酶、祖細(xì)胞和產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞所組成的協(xié)調(diào)“網(wǎng)絡(luò)”，作為細(xì)胞間的信使，ADSCs來源Exo能夠通過調(diào)控成纖維細(xì)胞的遷移和增殖、促進新生血管形成以及不同組織中的其他特定功能，從而在組織創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮積極作用[5-6]。microRNA（miRNA）作為特定信使RNA的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。目前，關(guān)于miRNA與增生性瘢痕發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究越來越多。研究表明，miR-145在ADSCs來源Exo中過表達能影響細(xì)胞的生物學(xué)行為進而發(fā)揮相關(guān)作用，例如促進軟骨形成、抑制炎癥反應(yīng)[7]，而其在ADSCs來源Exo對人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HSF）增殖與凋亡中的功能尚未見報道。鑒于此，本研究以HSF細(xì)胞作為研究對象，將過表達miR-145的ADSCs來源Exo與HSF細(xì)胞共培養(yǎng)，探究這一體系下HSF細(xì)胞增殖與凋亡的變化及具體分子機制，以期為增生性瘢痕的臨床治療研究提供新依據(jù)與新方案。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本：增生性瘢痕組織取自醫(yī)院整形外科，為燒傷或術(shù)后6個月以上的瘢痕患者的瘢痕組織標(biāo)本。其中男3例，女1例，年齡22～41歲，平均年齡為（27±8）歲。脂肪組織取自醫(yī)院進行吸脂術(shù)的患者，女3例，年齡25～35歲，平均年齡為（27±5）歲。實驗前所有患者均被告知了研究目的，獲得同意并簽署了手術(shù)知情同意書。

1.1.2 主要試劑：Ⅰ型膠原酶、青霉素、鏈霉素和DMEM培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司，胎牛血清購于杭州四季青生物公司，Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實時定量PCR試劑盒購于大連?；锟萍脊?，通用型外泌體提取試劑盒購于江蘇凱基生物有限公司，PKH67細(xì)胞膜染色試劑盒購于北京百奧萊博生物公司，EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司，RIPA裂解液、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒和ECL發(fā)光液購于上海碧云天生物研究所，GAPDH、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、CD63、CD81、CD9和TSG101抗體均購于英國Abcam公司，含miR-145過表達慢病毒載體和陰性對照miR-NC慢病毒載體的構(gòu)建、包裝均有上海生工生物工程有限公司完成，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.2.1.1 HSF細(xì)胞分離與培養(yǎng)：將增生性瘢痕組織剪成大小約1 cm3的組織塊，添加0.1 mg/mlⅠ型膠原酶溶液，37℃下培養(yǎng)3 h，濾過，以300×g離心5 min，添加含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d換液1次，待細(xì)胞匯集率達到80%以上時，0.25%胰酶消化，取傳代3～5代后的HSF細(xì)胞進行后續(xù)研究。

1.2.1.2 ADSCs分離與培養(yǎng)：在脂肪組織中添加0.1 mg/mlⅠ型膠原酶溶液，消化后，以300×g離心5 min，棄去上清液，添加含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d換液1次，待細(xì)胞匯集率達到80%以上時，0.25%胰酶消化并傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。取第3代細(xì)胞，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/毫升，取100μl細(xì)胞懸液，分別加入CD44、CD90及CD105單抗，室溫避光條件下孵育30 min，PBS洗滌并重懸，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞各表面標(biāo)志物表達情況。

1.2.2 脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)染：調(diào)整對數(shù)生長期ADSCs的密度，按照1×105個/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。分別將含miR-145過表達的慢病毒和對應(yīng)陰性對照miR-NC的慢病毒添加至細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)以感染ADSCs，病毒感染比率值為50:1，兩組細(xì)胞分別記為miR-145-ADSCs組和miR-NC-ADSCs組，并以正常培養(yǎng)的ADSCs作為對照，記為ADSCs組。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄原液，添加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，72 h后以1 mg/L嘌呤霉素進行篩選，獲得穩(wěn)定過表達miR-145的細(xì)胞株。

1.2.3 實時熒光定量PCR：收集轉(zhuǎn)染后獲得的ADSCs，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以獲得的cDNA為模版，設(shè)計miR-145和內(nèi)參基因U6的上、下游引物序列，具體如下：miR-145上游引物：5’-GTCCAGTTTTCCCAGG-3’，下游引物：5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用熒光實時定量PCR系統(tǒng)檢測miR-145表達水平，具體參照試劑盒說明書執(zhí)行，擴增程序設(shè)置為：95℃ 3 min，循環(huán)1次；95℃ 12 s、62℃40 s、95℃ 15 s，循環(huán)45次，實驗重復(fù)3次。擴增結(jié)束后，根據(jù)2-△△Ct法計算miR-145相對表達量。

1.2.4 外泌體提取與鑒定：收集轉(zhuǎn)染后48 h各處理組ADSCs上清液，采用密度梯度離心法分離ADSCs來源的Exo。在4℃下以300×g離心10 min，保留上清，3 000×g離心15 min，保留上清，10 000×g離心30 min，保留上清，0.22 μm濾膜過濾，添加外泌體提取試劑液A，混均勻，4℃下靜置12 h，再在4℃下以10 000×g離心60 min，棄上清，留沉淀，在沉淀中加入保存液試劑B，輕輕吹打混勻，將樣品保存于-80℃?zhèn)溆谩２捎猛干潆婄R觀察顆粒物的形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析儀檢測粒徑分布，Western blot檢測Exo表面標(biāo)志性蛋白CD63、CD81、CD9和TSG101的表達情況。

1.2.5 Western blot檢測：取制備的ADSCs來源Exo或各組ADSCs，添加RIPA裂解液進行裂解，提取總蛋白并定量。通過10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（1:1 000），4℃與膜共孵育過夜；次日，TBST洗膜，加入對應(yīng)二抗（1:5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶，并通過Image J軟件測定各蛋白表達水平。

1.2.6 外泌體與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)：調(diào)整對數(shù)生長期HSF細(xì)胞的密度，按照1×105個/孔接種于96孔板中，實驗具體分組與處理如下：對照組，正常培養(yǎng)的HSF細(xì)胞；Exo組，使用含10μg/ml ADSCs來源Exo的培養(yǎng)基培養(yǎng)HSF細(xì)胞；miRNC-Exo組，使用含10μg/ml轉(zhuǎn)染miR-NC的ADSCs來源Exo的培養(yǎng)基培養(yǎng)HSF細(xì)胞；miR-145-Exo組，使用含10μg/ml轉(zhuǎn)染miR-145的ADSCs來源Exo的培養(yǎng)基培養(yǎng)HSF細(xì)胞。按照分組建立細(xì)胞培養(yǎng)體系后，將各處理組細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，結(jié)束后收集細(xì)胞，進行后續(xù)實驗研究。

1.2.7 免疫熒光染色：取制備的ADSCs來源Exo，重懸于PBS溶液中，加入PKH67染料并混勻，4℃下避光染色20 min，以10 000×g離心30 min，棄上清，洗去多余染料，重懸于PBS溶液中備用。將HSF細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后添加PKH67熒光標(biāo)記的ADSCs來源Exo，孵育12 h后，PBS洗滌，DAPI染核10 min，洗滌、封片、干燥，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察PKH67熒光標(biāo)記的ADSCs來源Exo被HSF細(xì)胞攝取情況。

1.2.8 EdU染色：收集1.2.6處理后的各組HSF細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度按照1×105個/孔接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。添加10μmol/L EdU進行染色處理，PBS洗滌后，滴加Apollo567避光孵育30 min，DAPI染核，洗滌后封片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況，攝取圖片，紅色代表EdU+陽性細(xì)胞胞核。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)：收集1.2.6處理后的各組HSF細(xì)胞，0.25%胰酶消化，加入1×Binding Buffer制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，吸取100μl移入流式管，分別依次加入5μl FITC-Annexin Ⅴ與5μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，離心后加入400μl 1×Binding Buffer重懸，立即通過流式細(xì)胞儀上機檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)觀察與鑒定：通過倒置顯微鏡觀察可見，原代ADSCs培養(yǎng)至第3天時細(xì)胞貼壁生長，呈纖維細(xì)胞樣，束狀；培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞為均一長梭形，增殖速度較快，密集生長，呈旋渦狀排列，見圖1A～B。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測第3代ADSCs的表面標(biāo)志物CD44、CD90及CD105表達，結(jié)果顯示，CD44、CD90及CD105的表達率分別為99.1%、97.9%、90.9%，均為陽性表達，見圖1B。由此說明成功分離到ADSCs細(xì)胞。

圖1 ADSCs形態(tài)與鑒定

2.2 ADSCs轉(zhuǎn)染效率檢測：實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，miR-145-ADSCs組細(xì)胞中miR-145相對表達量顯著高于ADSCs組和miR-NC-ADSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 實時熒光定量PCR檢測各組ADSCs中miR-145表達

2.3 過表達miR-145的ADSCs來源外泌體鑒定：在透射電鏡下觀察分離顆粒物，可見其呈杯狀或球狀，為囊泡，測量到粒徑峰值約分布在100 nm處，見圖3A～B。經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，外泌體標(biāo)志蛋白CD63、CD81、CD9和TSG101均呈陽性表達，見圖3C。由此說明分離的顆粒物為外泌體。

圖3 ADSCs來源外泌體的鑒定

2.4 過表達miR-145的ADSCs來源外泌體被HSF細(xì)胞攝取情況：將ADSCs來源外泌體與HSF細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過熒光顯微鏡可見HSF細(xì)胞周圍有綠色熒光標(biāo)記的外泌體表達，且PKH67標(biāo)記的外泌體分布于HSF細(xì)胞核周圍，說明該外泌體可被HSF細(xì)胞所攝取，見圖4。

圖4 熒光顯微鏡觀察外泌體被HSF細(xì)胞的攝取情況（100×）

2.5 過表達miR-145的ADSCs來源外泌體對HSF細(xì)胞增殖的影響：通過EdU染色HSF細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與對照組比較，Exo組HSF細(xì)胞內(nèi)紅色熒光染色細(xì)胞數(shù)目明顯減少，EdU+陽性細(xì)胞百分率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Exo組比較，miR-145-Exo組HSF細(xì)胞內(nèi)紅色熒光染色細(xì)胞數(shù)目進一步減少，EdU+陽性細(xì)胞百分率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而miR-NC-Exo組與Exo組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5～6。

圖5 EdU染色檢測各組HSF細(xì)胞增殖情況（100×）

圖6 各組EdU+陽性細(xì)胞情況

2.6 過表達miR-145的ADSCs來源外泌體對HSF細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)檢測HSF細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果顯示，Exo組HSF細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而相較于Exo組，miR-145-Exo組的細(xì)胞凋亡率顯著增加差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR-NCExo組與Exo組比較差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7～8。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HSF細(xì)胞凋亡率

圖8 各組HSF細(xì)胞凋亡情況

Western blot檢測HSF細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2以及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表達水平，檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Exo組細(xì)胞內(nèi)cleavedcaspase-3和Bax的蛋白相對表達量顯著上調(diào)，Bcl-2、COL-Ⅰ及COL-Ⅲ蛋白相對表達量顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Exo組比較，miR-145-Exo組細(xì)胞內(nèi)cleaved-caspase-3和Bax的蛋白相對表達量顯著上調(diào)，同時，Bcl-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白相對表達量均顯著下調(diào)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖9～10。

圖9 Western blot檢測HSF細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表達

圖10 Western blot檢測HSF細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表達

3 討論

HS本質(zhì)上是一種纖維增生性疾病，其外部特征是凸起、紅色、結(jié)節(jié)、無彈性的瘢痕形成，與正常瘢痕相比，其消退緩慢且不完全自愈。目前，主要采用非手術(shù)方法和手術(shù)切除進行治療，非手術(shù)方法主要包括局部壓縮、有機硅膜粘附、激光療法、冷凍療法、皮質(zhì)類固醇局部注射和放療，然而，這些方法均有一定的局限性或副作用，可能涉及較長的治療周期與嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至誘發(fā)腫瘤；此外，手術(shù)切除經(jīng)常會導(dǎo)致復(fù)發(fā)、功能障礙和外觀惡化等，可見，以上方法均不能達到滿意的治療效果[3,8]。因此，探究新型有效的方法來預(yù)防和治療瘢痕增生已成為皮膚科和整形外科領(lǐng)域的一項重要研究內(nèi)容。

ADSCs來源Exo參與協(xié)調(diào)組織再生、免疫功能、組織穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞行為等過程。Exo攜帶親代ADSCs的特定內(nèi)容，包括DNA、RNA、脂質(zhì)、細(xì)胞因子以及酶，Exo能夠保護其運輸?shù)奈镔|(zhì)免于降解，并且在血液中高度穩(wěn)定，從而有效地將分子物質(zhì)運送到靶細(xì)胞，現(xiàn)已用于靶向藥物遞送和作為再生醫(yī)學(xué)的基因載體[9]。研究表明，ADSCs來源Exo阻止了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，增加TGF-β3與TGF-β1的比率。此外，ADSCs來源Exo通過激活ERK/MAPK通路增加皮膚真皮成纖維細(xì)胞內(nèi)MMP3表達，促進細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，從而促進傷口愈合并減少瘢痕形成[10]。本研究通過在體外采用ADSCs來源Exo處理增生性瘢痕中的HSF細(xì)胞后，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖活性下降，促進了細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)了促凋亡蛋白cleaved-caspase-3和Bax的表達，抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。本研究結(jié)果進一步證明了ADSCs來源Exo可能具有抑制或減少增生性瘢痕形成的作用。

miRNA與靶基因的相互作用是復(fù)雜的，其可直接結(jié)合到目標(biāo)mRNA的3'UTR區(qū)域來負(fù)調(diào)控目標(biāo)基因的表達，從而發(fā)揮相應(yīng)的功能作用[11]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與了HS的生長與發(fā)展過程，其表達與HSF細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、增殖、分化和凋亡有關(guān)。例如，Zhang等[12]研究報道指出miR-130a可以通過靶向CYLD促進Akt活化，從而誘導(dǎo)HS中的成纖維細(xì)胞增殖；Zhou等[13]研究證實miR-519d通過抑制HS中成纖維細(xì)胞的增殖并促進細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制瘢痕形成的作用?，F(xiàn)已知miR-145與腫瘤發(fā)生、心肌損傷和血管生成密切相關(guān)[14-16]，還有研究揭示了miR-145與HS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Zhu等[17]報道指出過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑通過上調(diào)miR-145的表達，抑制了TGF-β/SMAD3信號通路的激活，從而抑制HS形成；Wang等[18]研究表明miR-145在肥厚性瘢痕組織中表達降低，并與SOX-9表達呈負(fù)相關(guān)，還說明了miR-145通過下調(diào)SOX-9的表達來抑制成纖維細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進成纖維細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，miR-145過表達ADSCs來源的Exo能夠進一步抑制HSF細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡，這從miRNA水平闡述了ADSCs來源外泌體對HSF細(xì)胞的作用。

HS發(fā)生發(fā)展與眾多纖維化相關(guān)基因密切相關(guān)，先前已有研究揭示了瘢痕組織形成與膠原代謝失衡之間的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕來源的HSF細(xì)胞比正常成纖維細(xì)胞具有更大的增殖能力與合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力[19]。Exo在傷口愈合早期階段通過合成Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原促進膠原蛋白重塑，而在晚期階段則通過抑制膠原蛋白的合成而減少瘢痕形成。而在HS形成過程中，膠原蛋白的表達上調(diào)意味著細(xì)胞外基質(zhì)的積累，從而促進了HSF細(xì)胞的原纖維形成[20]。在本研究中，利用miR-145過表達ADSCs來源的Exo處理HSF細(xì)胞后，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的蛋白表達水平均下調(diào)，說明膠原合成受到抑制，該作用有利于減少HS的形成。

綜上所述，本研究表明ADSCs來源的Exo能夠有效傳遞miR-145來抑制HS內(nèi)HSF細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡，通過進一步下調(diào)COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表達抑制HSF細(xì)胞內(nèi)膠原合成，從而減少瘢痕的生成，這對于臨床上開發(fā)HS新的治療方案提供了實驗證據(jù)。但關(guān)于miR-145調(diào)控HSF細(xì)胞的具體分子機制及其在體內(nèi)是否也能夠發(fā)揮有效作用，有待后續(xù)進行相關(guān)實驗探究。