袁燕平，肖漢偉，汪亮亮△

(1.九江學院附屬醫(yī)院病理科，江西 九江 332000；2.九江市濂溪區(qū)人民醫(yī)院病理科，江西 九江 332000)

在日常病理工作中，快速冷凍切片技術是眾多病理學方法中極其重要而又特殊的一種方法，其是輔助臨床外科醫(yī)生進行手術操作的重要手段。在實際工作中，對于快速冷凍切片的質(zhì)量要求是非常嚴格的，既要求短時間完成病理制片和診斷，又要求確保最終診斷結論的準確性[1-2]。在整個快速病理診斷工作過程中，影響最后診斷結果的因素很多，包括取材位置、切片質(zhì)量、染色和診斷醫(yī)生的水平等，而制片過程中使用的組織冷凍包埋劑也是非常重要的影響因素之一[3-5]。冷凍切片包埋劑也稱最佳切削溫度(OCT)包埋膠，是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，廣泛用于病理冷凍切片工作中，其用途是在冰凍切片時支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，常溫時候呈液態(tài)，-20 ℃時則為固態(tài)，其能夠在低溫條件下包裹組織，以便進行連續(xù)的組織切片，減少皺折及碎裂。因為OCT包埋膠混合物為水溶性物質(zhì)，故在組織沖水時可溶于水，所以在以后的染色過程中不會增加背景染色。OCT包埋膠具有支持性好、凝固快、不易形成結晶等優(yōu)點，但是其價格偏高，工作中如大量使用會導致成本顯著提高，因此，有眾多病理工作者嘗試用普通膠水代替進口OCT包埋膠，最終也獲得了非常理想的結果，這些普通膠水在使用時也能制作出染色合格、對比良好的蘇木精-伊紅(HE)染色切片[6-9]。多年來，九江學院附屬醫(yī)院病理科在冷凍切片工作中已使用過多款國產(chǎn)普通膠水，觀察到不同膠水之間的性能表現(xiàn)差異巨大。為了找出一種最接近OCT包埋膠性能的膠水，本研究選取了多款市面常見的膠水，橫向?qū)Ρ攘似湓诶鋬銮衅械氖褂眯Ч?，最終找到了其中性能最優(yōu)、最接近專用OCT包埋膠的替代品，現(xiàn)將實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 九江學院附屬醫(yī)院手術室送檢的新鮮外科手術標本30例，包括胃黏膜、甲狀腺、子宮肌瘤、皮膚、卵巢等5種標本，各6例。

1.2材料及設備 進口LeicaCM3050S冷凍切片機，Leica公司生產(chǎn)的OCT包埋膠，北京雪奧文化用品制造有限責任公司生產(chǎn)的雪奧牌膠水，得力集團有限公司生產(chǎn)的得力牌膠水，汕頭市源盛文化用品實業(yè)有限公司生產(chǎn)的博寶牌膠水，南昌天鵝文教用品廠生產(chǎn)的天鵝飛騰合成膠水；酒精、二甲苯和染色試劑等。

1.3方法 (1)切片機預冷：先將冷凍切片機預冷降至-20 ℃，在實際切片過程中根據(jù)不同組織的需求調(diào)節(jié)樣本夾頭的溫度。(2)取材：將進口OCT包埋膠、各種普通膠水分別滴加到組織樣品托上，將每例新鮮標本切取大小相似組織5塊，組織厚度約3 mm。將組織分別放置于滴有包埋膠的樣品托上，再次滴加包埋劑將組織全部覆蓋。(3)冷凍：將樣品托立即放入冷凍切片機內(nèi)的樣本卡槽內(nèi)，再根據(jù)組織類型調(diào)節(jié)切片機溫度至所需溫度。(4)切片：當包埋劑與組織均凍結成白色或者透明體后，開始切片，所有組織切片厚度均設定為5 μm，切好后立即將組織直接貼附在干凈載玻片上，隨后切片放入甲醇固定液中固定1 min。(5)染色：切片經(jīng)過自來水沖洗30 s后，所有切片按照相同的實驗流程，進行HE染色。(6)每例冰凍標本染色結束后，接著進行組織脫水透明浸蠟，制作石蠟標本并進行常規(guī)HE染色。(7)將冷凍切片與石蠟切片進行對照，觀察切片質(zhì)量，包括組織結構完整性、細胞收縮和變形程度，同時要對冷凍切片和相對應的石蠟切片結果之間進行比較，染色完成的切片交給2名診斷醫(yī)生進行鏡下觀察，給出診斷，并且給每張切片進行評分。

1.4染色結果評判 (1)不同膠水切片間比較：由2名病理診斷醫(yī)生采用雙盲法進行打分，對5種不同包埋膠制作的冷凍切片HE染色質(zhì)量進行評估。切片HE染色質(zhì)量的評分標準參照《臨床技術操作規(guī)范：病理學分冊》中關于HE染色切片質(zhì)量基本標準評分，總分為100分，共分四級，≥90分評為甲級，75～<90分評為乙級，60～<75分評為丙級，<60分評為丁級。診斷醫(yī)生首先評判染色質(zhì)量是否符合診斷要求，如果不符則直接評為0分，不再進行后續(xù)評分，只有染色質(zhì)量符合診斷要求時，才根據(jù)細胞核、細胞質(zhì)染色強度、核漿對比度，以及與石蠟切片染色情況比較，再對切片進行判讀評分，每種標本得分取平均值，保留小數(shù)點后兩位。(2)各組冷凍切片與對應石蠟切片間比較：診斷醫(yī)生對各組切片進行診斷后統(tǒng)計結論，分析各組標本的冰凍常規(guī)診斷符合率。

2 結 果

2.1不同膠水間表現(xiàn)及各組冷凍切片質(zhì)量評分比較 本實驗中5種不同膠水之間的冷凍切片質(zhì)量評分比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=8.141,P<0.001)；其中OCT包埋膠和雪奧膠水之間的冷凍切片質(zhì)量評分基本相同，差異無統(tǒng)計學意義(P= 0.452)；而OCT包埋膠或雪奧膠水與其他3個品牌膠水之間比較，其冷凍切片質(zhì)量評分均相對優(yōu)異，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，得力、飛騰、博寶膠水三者之間的冷凍切片質(zhì)量評分相同，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。不同膠水間在制作冷凍切片中的使用效果見圖1。OCT包埋膠和雪奧膠水制作冷凍切片病理圖見圖2。不同膠水制作胃黏膜冷凍切片檢查中的使用效果及病理圖見圖3。

表1 5種不同膠水在不同組織中的制片質(zhì)量評分分)

2.2各組診斷結果 在5組標本之間，冷凍切片的診斷結論和對應的石蠟切片之間的診斷結論均一致，符合率達到100.0%。

注：A、B示5種不同膠水在冷凍切片中的使用，1為OCT包埋膠，2為雪奧，3為博寶，4為得力，5為飛騰；C示專用的OCT包埋膠和普通膠水在低溫冷凍后的外形，可以看到普通膠水呈現(xiàn)透明樣外觀，而OCT包埋膠呈現(xiàn)乳白色的外觀，二者不同；D示普通膠水由于本身比較稀薄，滴加后出現(xiàn)流淌現(xiàn)象，其對組織的包裹覆蓋性略差。圖1 不同膠水在制作冷凍切片中的使用效果

注：A1、A2為OCT包埋膠，A2為放大后效果；B1、B2為雪奧膠水，B2為放大后效果；2種膠水在甲狀腺組織的冷凍切片中的表現(xiàn)幾乎一致，組織細胞著色鮮明，胞核胞漿分界清楚。圖2 OCT包埋膠和雪奧膠水制作冷凍切片的病理圖(HE染色，A1、B1：4×，A2、B2：20×)

注：A中示1為OCT包埋膠，2為雪奧，3為博寶，4為得力，5為飛騰；肉眼觀察各組膠水表現(xiàn)差異不大，OCT包埋膠(B)相對比較黏稠一些；而顯微鏡下結果顯示OCT包埋膠(B)和雪奧膠水(C)2種膠水的表現(xiàn)總體較好，切片的細胞染色鮮艷，紅藍色對比度好，而其余3種膠水(D為博寶，E為得力，F(xiàn)為飛騰)表現(xiàn)相對較差，細胞核著色不均勻，部分細胞核發(fā)灰發(fā)空。圖3 不同膠水在制作胃黏膜冷凍切片檢查中的使用效果及病理圖(B～F：HE染色，20×)

3 討 論

對于臨床病理工作而言，術中快速冷凍切片與診斷技術已成為一項不可或缺的技術手段，其是借助冷凍切片機的低溫來迅速冷凍組織，接著再對冷凍組織進行切片、固定、染色及封片等一系列操作，最后由診斷醫(yī)生借助顯微鏡對切片良惡性進行診斷的一種方法[2-3,10]。一般來說，術中冷凍切片診斷必須在較短的時間內(nèi)(一般為30 min)對送檢組織的良惡性、腫瘤的邊緣組織是否存在浸潤或淋巴結內(nèi)是否存在癌轉移等情況進行快速而又準確的判斷，從而幫助外科醫(yī)生確定手術的范圍及方式[11]?？焖倮鋬銮衅夹g省略了組織的前處理過程，直接在低溫條件下進行切片，而想要實現(xiàn)低溫條件下切片依靠的就是組織冷凍包埋劑，即OCT包埋膠。以往使用的OCT包埋膠均為進口產(chǎn)品，價格昂貴，近年來也有國產(chǎn)OCT包埋膠出現(xiàn)，其性能已經(jīng)接近進口產(chǎn)品，但是價格依然在每150毫升200～300元，總體上看使用成本比較高。一直以來，許多病理工作者都在嘗試尋找一種便宜而又實用的OCT包埋膠替代品，許多實驗證實普通的文具膠水就具有和OCT包埋膠相類似的作用，兩者都是無色透明液體，冷凍后都有著與組織塊相近的韌度，能起到良好的支撐、填塞和凝固作用。市面上文具膠水的主要成分多為聚乙烯醇、白乳膠、硬脂酸鈉、滑石粉、乙二醇、蔗糖等，這些物質(zhì)的水溶性均較好[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)，普通膠水制作的切片，沒有出現(xiàn)脫片，而且染色效果穩(wěn)定，透亮度好，玻片上也無膠水殘留，最終的切片質(zhì)量完全合格，與進口OCT包埋膠相比毫不遜色。不同標本先進行冷凍切片后再進行石蠟切片，兩者的診斷均符合，一致性較好，表明這5種不同膠水制作的切片其實均能滿足快速病理診斷的要求，唯一不同的是不同膠水制作的冷凍切片之間存在著質(zhì)量的差別，盡管這些差別是微小的，但是對于診斷醫(yī)生，更優(yōu)良的切片意味著診斷時更準確和更快速地診斷[13]。

快速冷凍切片時，當切片機冷凍室、組織樣本、包埋劑和刀片之間的溫度達到平衡時，此時即可獲得高質(zhì)量的冷凍切片。由于不同組織的構成成分不同，脂質(zhì)構成比存在差異，導致各個樣本的OCT包埋膠實際上各不相同，正常工作中需要不斷調(diào)整切片溫度。OCT包埋膠是由高分子聚合物構成的黏稠無色透明液體，其冷凍速度和軟硬度與絕大部分組織細胞相近，冷凍組織在接觸冷凍切片機刀刃的一瞬間，局部溫度快速升高并且發(fā)生局部融化，緊接著切開的組織薄片暴露于冷凍機室中而又被再次冷凍，這一過程不斷重復，周而復始就實現(xiàn)了冷凍情況下的連續(xù)切片[4]。一般來說，普通膠水中通常含有較多水分，這會造成冷凍組織過程中形成大量的細小晶體，這些晶體會擠壓組織，甚至會導致細胞發(fā)生破裂，最終會影響到組織HE染色的形態(tài)結構，讓原本該有的組織細胞發(fā)生變異，給診斷醫(yī)生造成相當程度的診斷障礙，進而導致診斷出現(xiàn)差錯[14-16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，普通膠水多為透明樣液體，外觀呈水樣，滴加到組織上后很快就流淌開來，無法完全包裹住組織塊，導致切片時非常容易出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，其可能的原因是組織自身的張力過大，而組織周圍又缺乏膠水的牽拉，最終導致卷曲。而雪奧牌膠水則表現(xiàn)良好，其性狀黏稠，含水量較少，滴加到組織周圍后能完全包裹住組織。其冷凍變硬的速度和OCT包埋膠幾乎相當，在切片時也不會出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象。本實驗已經(jīng)初步證明了雪奧牌膠水在冷凍速度和冷凍切片質(zhì)量上均優(yōu)于其他普通膠水，達到或者接近進口OCT包埋膠性能，下一步將繼續(xù)研究普通膠水和OCT包埋膠包埋后的組織內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸的保存情況，進一步明確普通膠水在病理工作中的應用價值。