張 立，周繼紅，謝嘉嘉，焦小強，李玨卉，何逸龍

[深圳市寶安中醫(yī)院(集團)肺病科，廣東 深圳 518100]

新型冠狀病毒感染(新冠感染)是一種由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道傳染疾病。而SARS-CoV-2在傳播過程中極易出現(xiàn)突變，例如德爾塔(Delta)、奧密克戎(Omicron)毒株等，其傳播力隨之增高，除積極研發(fā)特效藥物及疫苗予以防治外，積極發(fā)展中醫(yī)藥特色治療更有利于患者的治療與康復(fù)。

新冠感染屬我國傳統(tǒng)醫(yī)學的“疫病”“瘟疫”之范疇?！耙哽濉敝畾馔庖u機體，首犯華蓋，正邪相爭，肺失宣降，乃致出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱、氣喘、咽痛、疲乏等癥狀。目前中醫(yī)治療的臨床報道多涉及肺、脾、胃等，但對于肺腎兩虛證的治療報道較少。在中醫(yī)疾病傳變中，肺屬金，金生水，肺病則為母病，母病及子，則腎臟受累，故也可出現(xiàn)腎不納氣、腎氣不足、腎不藏精等證型。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學探究淫羊藿、巴戟天在新冠感染肺腎兩虛患者中的療效機理。喘可治注射液由巴戟天、淫羊藿兩味中藥研制而成，其主要是基于補腎法治療肺腎兩虛患者的氣喘、咳嗽等[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一個基于系統(tǒng)生物學理論的研究學科，可分析生物信息系統(tǒng)與疾病網(wǎng)絡(luò)，通過選取重要信號節(jié)點設(shè)計和解析各靶點藥物分子，進而建立網(wǎng)絡(luò)模式，將數(shù)據(jù)可視化，系統(tǒng)地闡明藥物的藥理作用與機制[2]，有助于新藥或中藥復(fù)方的臨床試驗，降低藥物毒性反應(yīng)。

本研究根據(jù)喘可治注射液的主要成分擬定淫羊藿-巴戟天中藥復(fù)方湯劑，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法檢測淫羊藿-巴戟天的主要活性成分與藥理作用靶標，再通過數(shù)據(jù)聚類分析，進而構(gòu)建藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，并利用軟件分析數(shù)據(jù)信號通路，為淫羊藿-巴戟天在新冠感染肺腎兩虛型的治療提供更多理論參考。

1 資料與方法

1.1收集及篩選淫羊藿-巴戟天中的化合物 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)的搜索框中分別輸入“淫羊藿”及“巴戟天”，查找二者所含的全部化合物成分。在臨床上，主要采用口服生物利用度(OB)和生物活性作用分子類藥性(DL)評價活性組分能否成為有效成分[3]。故以O(shè)B≥30%、生物活性分子DL≥0.18為參考，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出兩者所含符合標準的化學成分作為活性成分。

1.2靶標蛋白的篩選及藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在TCMSP中搜索出相應(yīng)的目標蛋白，并利用Uniprot庫(www.uniprot.org/)，將所有的目標蛋白與基因名核對，并剔除無對應(yīng)的基因名稱。利用Cytoscape3.7.2軟件建立藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，并對其進行靶點和結(jié)構(gòu)分析。

1.3淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型潛在作用靶點預(yù)測 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http：//www.genecards.org/)的搜索框中輸入“Corona Virus Disease 2019”或“Novel coronavirus pneumonia”等關(guān)鍵詞搜索與SARS-CoV-2有關(guān)的基因。并將藥物靶點與疾病靶點進行配對，獲得淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的潛在作用靶點。利用Omicshare的云臺繪制Vene圖，把藥物和疾病的目標進行交叉映射，以獲得交叉靶點。

1.4蛋白質(zhì)互相作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將淫羊藿-巴戟天作用于新冠感染肺腎兩虛型的潛在靶標輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，在“Multiple Proteins”界面錄入潛在靶點的列表，并將其物種分類設(shè)定為“Homo Sapiens”(智人)，由此顯示蛋白質(zhì)之間的交互聯(lián)系。以tsv格式存儲，將該文件加載到Cytoscape3.7.2軟件中，利用“Network analyzer”對該系統(tǒng)進行拓撲屬性解析，從而得到該網(wǎng)絡(luò)的核心靶標。

1.5靶點的通路分析 將靶標基因?qū)隖unrich3.1.3進行基因本體(GO)富集分析，將生物過程(BP)、細胞組分(CC)、細胞功能(MF)按照靶標點數(shù)進行排序，獲得條狀圖。將目標蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析，并通過Omicshare(http：//omicshare.com/)繪制KEGG通路的氣泡圖，以達到數(shù)據(jù)的可視化。

2 結(jié) 果

2.1淫羊藿-巴戟天中活性化合物篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索獲得的淫羊藿-巴戟天化合物，共篩選出43個符合標準的活性化合物，其中23個來自淫羊藿，20個來自巴戟天。見表1。

表1 淫羊藿-巴戟天中部分活性化合物的基本信息

續(xù)表1 淫羊藿-巴戟天中部分活性化合物的基本信息

2.2藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 通過Cytoscape軟件組建藥物-活性化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1)。選取等級值與中心度值較高的節(jié)點是關(guān)鍵化合物或靶點。其中排名前5位的活性化合物依次是MOL000098(槲皮素)、MOL000422(山奈酚)、MOL000006(木樨草素)、MOL00358(β谷甾醇)、MOL004373(脫水淫羊藿黃素)，分別可與77、34、28、16、16個靶蛋白產(chǎn)生相互作用。

注：E-M為淫羊藿-巴戟天；菱形表示淫羊藿-巴戟天，八邊形表示新冠感染肺腎兩虛型，中間的矩形表示活性化合物，外周的圓形代表靶點基因。每個邊表示活性化合物、靶標之間的交互作用。圖1 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3預(yù)測淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的潛在作用靶點 在GeneCards上總共獲取了2 831個新冠感染的致病靶點。獲得41個交叉靶點，即淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的作用靶點，見圖2。

注：E-M為淫羊藿-巴戟天。圖2 淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型潛在靶點Vene圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 淫羊藿-巴戟天的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3，將淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的41個潛在靶點基因輸入STRING 中，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，包含367條邊，平均節(jié)點度是17.9，見圖4。從以上圖表中可以看到，在不同的蛋白質(zhì)間聯(lián)系中，白細胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、胱天蛋白酶3(CASP3)、缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)、細胞周期蛋白D1(CCND1)、人類表皮生長因子受體(EGFR)分別位列前6位，證明這些靶蛋白在治療新冠感染肺腎兩虛型中具有重要意義。

圖3 淫羊藿-巴戟天PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的關(guān)鍵靶蛋白信息

2.5靶點GO富集分析及KEGG通路分析 將淫羊藿-巴戟天作用于新冠感染的41個潛在靶點輸入Funrich 3.1.3軟件，獲得GO富集條目802個。共包含720個生物過程、29種細胞組分及53個細胞功能。把排名前10的富集基因條目通過Funrich3.1.3軟件工具繪制條形圖(圖5)。生物過程主要體現(xiàn)在信號傳遞、代謝、細胞間通信、能量路徑、蛋白質(zhì)代謝等；細胞組分主要集中在細胞質(zhì)、細胞核、細胞外、核漿等；細胞功能主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、氧化還原酶活性等。通過分析共獲得125條KEGG通路，主要涉及磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、脂質(zhì)核動脈粥樣硬化、卡波西氏肉瘤皰疹病毒感染、腫瘤相關(guān)mRNA、人巨細胞病毒感染、艾巴氏病毒感染等。篩選前20條富集基因通路并繪制氣泡圖(圖6)。Y軸代表所選信號通路，X軸表示各通路所占比例，氣泡面積表示通路富集基因數(shù)大小，選取其中關(guān)鍵通路構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。

圖5 GO分子功能分析圖

圖6 淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型KEGG通路富集氣泡圖

圖7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

新冠感染是因感染SARS-CoV-2而引起的急性呼吸道傳染性疾病，感染后的潛伏期多為1～14 d，疾病早期傳染性較強，可經(jīng)飛沫、密切接觸、氣溶膠等途徑傳播。新冠感染的常見臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、干咳、乏力、鼻塞、咽痛、流涕、肌痛、腹瀉、味覺或嗅覺減退等[4]，若不盡早干預(yù)，可迅速發(fā)展為重癥，出現(xiàn)呼吸衰竭、循環(huán)障礙，甚者危及生命。

世界衛(wèi)生組織在2020年1月31日發(fā)布了新冠感染的報告，新冠感染疫情是全球范圍內(nèi)的一次重大公共衛(wèi)生事件。根據(jù)國家疾控中心相關(guān)數(shù)據(jù)，截至2022年1月，我國累計報告13萬多例感染病例，全國性疫情已經(jīng)基本得到控制，但隨著變異毒株的傳播，如Delta、Omicron，部分地區(qū)仍有報道散發(fā)病例。目前，全球多個國家中檢出了SARS-CoV-2變異株，如Delta、Alpha、Eta、Lota、Beta等[5]，而奧密克戎變異株B.1.1.529于2021年11月24日首次在南非被發(fā)現(xiàn)，并于全球出現(xiàn)蔓延[6]。

在新冠感染的治療方面，西醫(yī)以對癥、支持治療居多。中醫(yī)認為，該病屬“濕毒疫”[7]、“寒濕疫”[8]等范疇，可配合中醫(yī)相關(guān)輔助治療，有利于改善癥狀，縮短治療時間。新冠感染是一個全身性、系統(tǒng)性疾病，病變可累及肺外多個系統(tǒng)及臟器，外邪侵襲，首犯華蓋，當邪毒化熱，母病及子，消灼下焦陰液，或灼傷腎臟脈絡(luò)，腎失納氣藏精之功，機體精微下泄，可見血尿、蛋白尿等[9]。肺失宣降，母病及子，導(dǎo)致腎不納氣、腎氣不足，出現(xiàn)咳嗽、氣喘等表現(xiàn)，同時可伴隨疲倦乏力、腰膝酸軟、形寒肢冷、小便清長、舌淡紅、苔白、脈沉細等證候，所以肺腎兩虛患者可予以補益先天之本而溫陽補腎，納氣平喘止咳，顧護正氣，有利于患者康復(fù)。喘可治注射液穴位注射可治療肺腎兩虛型肺系疾病，如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支氣管炎等，而其主要成分正是淫羊藿和巴戟天。

淫羊藿歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，性味辛、甘、溫，可補腎助陽、祛風濕、強筋骨[10]。內(nèi)含淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ/Ⅱ、寶藿苷Ⅰ/Ⅱ等，均有雄激素樣和植物雌激素樣活性，可提高實驗動物的性機能，促進外周T細胞免疫功能，促使血清超氧化物歧化酶活性增強。尚有抗骨質(zhì)疏松、抗輻射、抗腫瘤、抗肺纖維化等作用[11-12]。淫羊藿苷能夠調(diào)節(jié)T淋巴細胞的平衡，增強體內(nèi)殺傷細胞的活性，從而提高機體的免疫力[13]。巴戟天歸腎肝二經(jīng)，性味甘辛、微溫，亦可補益腎陽、祛風濕、強筋骨。其含有的單糖、多糖、樹脂等可抗應(yīng)激，巴戟天多糖可以作用于免疫器官及免疫相關(guān)細胞，能有效改善T細胞的免疫功能[14]。巴戟天能明顯提高IL-2、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及γ干擾素的表達水平，對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠具有良好治療作用[15]。上述研究已明確了淫羊藿-巴戟天在調(diào)節(jié)免疫、抗應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、抗肺纖維化等方面的作用，且能增強機體體液免疫及細胞免疫能力，從而為淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型提供充分的相關(guān)藥理依據(jù)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析方法，對43種淫羊藿-巴戟天的活性成分進行了分析，得到了41個淫羊藿-巴戟天對新冠感染肺腎兩虛型的有效靶點，表明淫羊藿-巴戟天能夠通過多靶點、多成分治療新冠感染肺腎兩虛型。通過“藥物-化合物-靶點”的交叉網(wǎng)絡(luò)分析檢測關(guān)鍵活性化合物，按照中心度數(shù)值、等級值排列顯示槲皮素、山奈酚、木樨草素、β谷甾醇位于前列。槲皮素主要存在于蔬果、綠茶等中[16]，具有抗炎、抗菌、祛痰止咳、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等功能[17]，其可抑制TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子產(chǎn)生從而治療脂多糖引起的肺炎[18]。山奈酚可抗病毒、抗氧化、抗炎、提高免疫力[19]，此外，山奈酚尚可調(diào)節(jié)miR21/PTEN 相關(guān)信號通路，導(dǎo)致非小細胞肺癌A549細胞增殖抑制，從而起到抗腫瘤功效[20]。有研究表明木樨草素同樣可抑制A549細胞的活性、克隆形成、進一步遷移，與肌醇聯(lián)合使用可下調(diào)p-PDK1和p-Akt的表達，從而增強其抑制作用[21]。β-谷甾醇具有多種生物活性，如抑制炎癥、抑制細菌、抗氧化、降低膽固醇、類激素等[22]。β-谷甾醇可下調(diào)核因子-κB信號傳導(dǎo)通路的活化，保護內(nèi)毒素所致小鼠的肺損傷[23]。本研究篩選出的活性化合物涉及抗病毒、抗炎、肺損傷、抗腫瘤等方向，可覆蓋病毒性肺炎。通過分析淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型PPI網(wǎng)絡(luò)中的40個靶點蛋白，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓撲解析結(jié)果顯示，IL-6、VEGFA、CASP3、HIF1α、CCND1、EGFR是淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的核心標靶。

IL-6是引發(fā)新冠感染患者“細胞因子風暴”的一種重要炎性細胞因子[24]，主導(dǎo)了新冠感染的發(fā)生與進展過程，其表達水平與病情嚴重程度呈明確正相關(guān)[25]。IL-6具有多重生物活性，是主要與細胞炎性反應(yīng)相關(guān)的炎性細胞因子，IL-6的增加則可能對機體功能形成不良影響，有研究表明，IL-6受體阻斷劑能夠用于治療新冠感染[26]，所以對新冠感染患者后期的細胞因子風暴的治療尤為重要[27]。槲皮素與IL-6、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2與SARS-CoV-2的親和力接近推薦用藥，作用于IL-6調(diào)節(jié)多條信號通路，從而證明其對新冠感染具有一定的療效。VEGFA是促血管內(nèi)皮細胞生長的因子，能夠特異性地作用于內(nèi)皮細胞，參與增加毛細血管通透性，進而誘導(dǎo)血管生成，尚可促進細胞遷移，抑制細胞凋亡。新冠感染患者由于體內(nèi)細胞因子分泌，病灶血管滲透性增加，因而引起多器官系統(tǒng)的損傷，出現(xiàn)高熱、肺炎、呼吸衰竭[28]。因此，通過調(diào)控VEGFA通道可緩解病毒性肺炎患者的癥狀。CASP3是一種與細胞死亡密切相關(guān)的蛋白酶，能夠加速肺腺癌細胞的凋亡，降低其增殖、生長、遷移和侵襲能力[29]。CASP3與由細胞毒性T淋巴細胞顆粒酶B介導(dǎo)的殺傷作用靶細胞相關(guān)，是細胞壞死、凋亡信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵性效應(yīng)酶[30]。HIF1α的活性與血管生成相關(guān)，其與炎性反應(yīng)、腫瘤生長及缺氧適應(yīng)等相關(guān)。有研究表明，血清HIF1α高水平表達與老年慢性阻塞性肺疾病患者肺功能損傷加重相關(guān)[31]。CCND1表達異常時出現(xiàn)細胞周期紊亂，導(dǎo)致細胞無限增殖形成腫瘤。有研究表明，多種信號通路可通過抑制CCND1的表達，從而抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲[32]。EGFR信號通路能夠影響氣道黏液的產(chǎn)生，當其通路開放增加，會導(dǎo)致氣道內(nèi)黏蛋白分泌增加。研究表明，通過抑制EGFR通路，能夠下調(diào)黏蛋白5AC的表達，從而干預(yù)氣道黏液的高分泌，能夠有效治療慢性阻塞性肺疾病[33]。以上就是淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的主要核心標靶，主要涉及炎性細胞因子、炎性反應(yīng)、氣道分泌、血管內(nèi)皮生成、細胞增殖與凋亡等方面。

淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型的靶點GO富集生物學過程主要包含信號傳導(dǎo)、細胞間通信、代謝、能量路徑、蛋白質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、氧化還原酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、細胞質(zhì)、細胞核、核漿等。上述生物學過程在淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型中均具有重要作用。KEGG通路富集分析共獲得125條通路，主要包括PI3K/Akt信號通路、卡波西氏肉瘤皰疹病毒感染、脂質(zhì)核動脈粥樣硬化、人巨細胞病毒感染、艾巴氏病毒感染、腫瘤相關(guān)性mRNA等。本研究GO富集生物學過程及KEGG通路分析結(jié)果集中于病毒感染、細胞代謝、酶活性等方面，其中PI3K/Akt信號通路是新冠感染肺腎兩虛型的重要靶標通路。

有研究表明，PI3K/Akt是病毒的一種重要靶標通路，與細胞生長、轉(zhuǎn)錄翻譯、細胞凋亡等進程密切相關(guān)，參與多種病毒的調(diào)控，如流感病毒、柯薩奇病毒、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒[34-37]。PI3K/Akt信號通路主要分布在人體各個臟器組織，主要功能是控制炎癥、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖、控制代謝等，在呼吸道和肺部炎癥中發(fā)揮了重要作用[38]。動物實驗表明，PI3K抑制劑能夠抑制甲型流感病毒感染引起的病毒性肺炎小鼠肺組織中一氧化氮生成及炎性反應(yīng)[39]。此外，尚有研究證明，PI3K/Akt抑制劑可能是新冠感染治療的潛在靶點[40]。因此，抑制PI3K/Akt信號通路可減少SARS-CoV-2感染后的肺損傷，能夠用于治療新冠感染。

綜上所述，淫羊藿-巴戟天所含的化合物中槲皮素、山奈酚、木樨草素、β谷甾醇在治療新冠感染肺腎兩虛型中起到關(guān)鍵作用。淫羊藿-巴戟天中共檢索獲得65個潛在靶點，其中治療新冠感染肺腎兩虛型的交叉靶點是41個，即其中約63%的靶點均與治療新冠感染肺腎兩虛型相關(guān)。而治療新冠感染肺腎兩虛型的核心標靶為IL-6、VEGFA、CASP3、HIF1α、CCND1、EGFR，主要與炎性反應(yīng)、細胞因子、氣道高分泌、血管內(nèi)皮生成、細胞增殖凋亡相關(guān)。而GO富集生物學過程和KEGG通路分析主要體現(xiàn)于相關(guān)病毒感染、細胞代謝、酶學活性等，其中PI3K/Akt信號通路是新冠感染肺腎兩虛型的重要靶標通路，能夠為新冠感染肺腎兩虛型的治療提供更多藥理學依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學闡述了淫羊藿-巴戟天治療新冠感染肺腎兩虛型是多靶點、多路徑PPI的研究結(jié)果，為擴展喘可治注射液的臨床應(yīng)用范圍提供了一定的藥理學理論基礎(chǔ)。但本研究仍存在一定的不足，中藥復(fù)方湯劑的服用需因人制宜加以辨證論治而制定，且中藥復(fù)方中的藥物之間也可能存在相互作用，但目前數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)仍不全面，忽略了藥物及成分之間相互作用、中藥成分藥量的影響因素等，所以其具體機制尚需更進一步的深入研究及臨床試驗證明。