黃微星 萬玲君 黃幻 王威 雷新環(huán) 袁赤亭 章禮煒

骨骼作為人體運動系統(tǒng)的重要器官，在體內(nèi)發(fā)揮著保護、代謝、支持、運動、造血等功能。在正常機體的骨代謝中，成骨細胞所介導(dǎo)的骨形成作用與破骨細胞所介導(dǎo)的骨吸收作用至關(guān)重要，使骨量維持在動態(tài)平衡的狀態(tài)[1]。起源于骨髓單核巨噬細胞的破骨細胞，是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的終末分化細胞。絕經(jīng)后的女性，由于體內(nèi)缺乏雌激素，使得破骨細胞數(shù)目增加及功能異常，骨吸收速度提高，出現(xiàn)明顯的骨量丟失現(xiàn)象，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2]。此外，破骨細胞分化異?；钴S在腫瘤骨轉(zhuǎn)移、類風濕性關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)置換假體周圍骨溶解等疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[3]。由此可見，抑制破骨細胞分化是防治骨量丟失疾病的重要靶點之一。蓽茇酰胺提取自胡椒科胡椒屬植物蓽茇，是一種天然生物堿，具有抗腫瘤、抗血小板凝集、抗炎、降血脂、保護神經(jīng)等作用，但是其在骨代謝領(lǐng)域的功能尚未揭示[4-5]。本研究旨在通過體外實驗探討蓽茇酰胺對破骨細胞分化的影響及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量16～20 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司[SCXK（滬）2018-0004]，飼養(yǎng)于浙江大學(xué)臺州醫(yī)院公共科研平臺SPF動物房[SYXK（浙）2019-0030]。小鼠在室溫20～25℃，濕度40%～60%，24 h自然光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，不限制飲水及進食，相關(guān)飼養(yǎng)及操作經(jīng)浙江大學(xué)臺州醫(yī)院動物倫理委員會審批（tzyy-2019033）。

1.2 試劑和儀器 蓽茇酰胺粉末（批號：HY-N2329）購自美國MedChemExpress公司，高速離心后使用二甲基亞砜（批號：ST038，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）溶解制成100 mmol/L母液，分裝后置于-80℃冰箱保存。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（批號：315-02）購自美國Peprotech公司；NF-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）（批號：P00226）、總 RNA 提取試劑（批號：R1100）均購自北京索萊寶科技有限公司；α-改良型MEM培養(yǎng)基（批號：SH30265.01）購自美國Hyclone公司；澳洲特級FBS（批號：10099-141）購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號：K1018）購自美國APExBIO公司；cDNA第一鏈合成試劑盒（批號：R123-01）、SYBR Green熒光實時定量PCR試劑盒（批號：Q121-02）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。PBS（批號：C0221）、胰酶細胞消化液（批號：C0201）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（批號：C0222）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；24孔Osteo Assay Surface骨細胞表面培養(yǎng)板（批號：3987）購自美國Corning公司；破骨細胞特征性標志酶抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號：BZ-OC02）購自蘇州必中生物科技有限公司。Multiskan SkyHigh全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher公司，ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，DM IL LED倒置實驗室顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠骨髓來源單核巨噬細胞（bone marrow-derived monocytes/macrophages，BMMs）提取與培養(yǎng) 解剖小鼠，收集小鼠脛腓骨置于無菌PBS中，剔凈肌肉、生長板及黏附其上的韌帶等結(jié)締組織，3次無菌PBS漂洗后，于股骨近端、脛骨遠端暴露骨髓腔，使用1 ml針筒抽取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔。將分離的骨髓使用含10%血清的α-改良型MEM培養(yǎng)基重懸后1 500 r/min離心4 min，倒掉上清液后使用含30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基重懸，接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，過夜。第2天去除細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并用無菌PBS沖洗3次，加入適量含30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基，將仍貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d細胞呈短梭形，密度80%～90%。隨后去除培養(yǎng)液并使用PBS沖洗3次，胰酶消化，計數(shù)后備用，即為BMMs。后續(xù)BMMs培養(yǎng)均使用含30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基，進行破骨分化誘導(dǎo)時采用含50 ng/ml RANKL、30 ng/ml M-CSF的完全培養(yǎng)基。

1.3.2 BMMs增殖活性檢測 采用CCK-8法。將BMMs按0.4×104細胞/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，設(shè)置1 個 對照組和9個濃度（0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 μmol/L）蓽茇酰胺干預(yù)組，共10組，每組3個復(fù)孔。待細胞過夜貼壁后，將孔內(nèi)液體更換為含對應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)，隔天換液1次。分別培養(yǎng)48、72、96 h后，向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用酶標儀測定各孔450 nm波長處吸光度（OD450）值。

1.3.3 BMMs破骨分化誘導(dǎo) 將BMMs分別按10×104、40×104細胞/孔的密度接種于24、6孔板內(nèi)。過夜貼壁后，使用破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+50 ng/ml RANKL+30 ng/ml M-CSF）進行破骨分化誘導(dǎo)，隔天換液。第4天顯微鏡下見BMMs開始匯聚、融合，出現(xiàn)3個細胞核以上的細胞，第6天見邊界清晰、巨大、煎餅樣的成熟破骨細胞。

1.3.4 BMMs破骨分化能力檢測 采用TRAP染色。吸去成熟破骨細胞24孔板中各個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，PBS沖洗1遍后加入500 μl 4%多聚甲醛固定細胞10 min，隨后PBS沖洗2遍，按照試劑盒說明書進行TRAP染色。倒置顯微鏡下觀察并拍照，TRAP陽性且細胞核數(shù)目≥3個的細胞計為破骨細胞，并通過Image J軟件進行破骨細胞相對大小的計算，破骨細胞相對大小=各組破骨細胞大小/溶劑對照組中破骨細胞大小的平均值。

1.3.5 破骨細胞骨吸收能力檢測 采用24孔Osteo Assay Surface骨細胞表面培養(yǎng)板。將BMMs按10×104細胞/孔的密度接種于24孔板中，細胞過夜貼壁后將培養(yǎng)基更換為破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，進行破骨誘導(dǎo)，隔天換液。3 d后倒置顯微鏡下見BMMs開始融合成較小的、不成熟的破骨細胞，隨后去除培養(yǎng)液并使用PBS沖洗3次，胰酶消化并重新進行細胞計數(shù)。隨后，將消化后的未成熟破骨細胞按10×104細胞/孔的密度接種于Osteo Assay Surface骨細胞表面培養(yǎng)板中，共9孔，分為對照組和0.5、1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組，加入含對應(yīng)藥物的破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d。最后使用5%次氯酸鈉清洗孔板，去除黏附的細胞，并用雙蒸水清洗2次。倒置顯微鏡下觀察骨板的骨吸收情況并拍照，通過Image J軟件進行骨吸收相對面積的計算，相對骨吸收面積=結(jié)晶涂層吸收區(qū)域面積/同一視野下的總面積。

1.3.6 BMMs破骨分化過程中核心轉(zhuǎn)錄因子活化T-細胞核因子1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1）及相關(guān)特征基因耐酒石酸酸性磷酸酶（acid phosphatase 5，tartrate resistant，ACP5）、破骨細胞相關(guān)受體（osteoclast associated receptor，OSCAR）、組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）mRNA表達水平檢測 采用qRTPCR法。將BMMs按40×104細胞/孔的密度接種于6孔板中，過夜貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含對應(yīng)藥物的破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，進行破骨誘導(dǎo)，隔天換液。6 d后吸去各個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗1次后每孔加入500 μl總RNA提取試劑，置于冰上按說明書提取細胞總RNA。RNA樣品使用RNA/DNA紫外可見光度法定量測定濃度，然后使用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（1 μg RNA，使用20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)結(jié)束后使用雙蒸水稀釋至100 μl備用）。后續(xù)qPCR所用引物序列如下：NFATc1上游：5'-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3'，下游：5'-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3'；ACP5上游：5'-TGTGGCCATCTTTATGCT-3'，下游：5'-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3'；OSCAR 上游：5'-CTGCTGGTAACGGATCAGCTCCCCAGA-3'，下游：5'-CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3'；CTSK上游：5'-ACGGAGGCATTGACTCTGAAGATG-3'，下游：5'-GGAAGCACCAACGAGAGGAGAAAT-3'；MMP-9上游：5'-GTCCAGACCAAGGGTACAGC-3'，下游：5'-ATACAGCGGGTACATGAGCG-3'；18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，Rn18s）上游：5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3'，下游：5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3'。所使用的qPCR反應(yīng)體系為 20 μl（SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，前后鏈引物mix 0.5 μl，ddH2O 7.5 μl），反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min預(yù)變性，隨后95℃10 s變性，65℃30 s擴增共循環(huán)40次。分析結(jié)果時，以Rn18s為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算各個基因轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蓽茇酰胺對BMMs增殖的影響 在蓽茇酰胺處理BMMs 48 h后，10 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組OD450值由對照組的0.78±0.01降低至0.62±0.02（P＜0.01）；72 h后，5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組OD450值由對照組的1.30±0.02降低至 1.04±0.04（P＜0.01）；96 h后，5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組OD450值由對照組的1.84±0.04降低至 1.42±0.06（P＜0.01），見圖1。CCK-8實驗提示，2 μmol/L及以下濃度的蓽茇酰胺對BMMs增殖無明顯毒性反應(yīng)。

圖1 蓽茇酰胺對BMMs增殖的影響（A：不同濃度蓽茇酰胺處理48 h后對BMMs增殖的影響；B：不同濃度蓽茇酰胺處理72 h后對BMMs增殖的影響；C：不同濃度蓽茇酰胺處理96 h后對BMMs增殖的影響）

2.2 蓽茇酰胺對破骨細胞分化的影響 對照組、0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、2 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組經(jīng)過6 d培養(yǎng)后，各組孔內(nèi)細胞經(jīng)固定、TRAP染色，倒置顯微鏡下觀察可見對照組中出現(xiàn)大量多核、肥大、煎餅樣的成熟破骨細胞，而在0.5 μmol/L蓽茇酰胺處理下，成熟破骨細胞數(shù)目顯著下降。與此同時，1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、2 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中幾乎只有極少量破骨細胞生成，見圖2（插頁）。進一步統(tǒng)計分析顯示，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中TRAP陽性且細胞核數(shù)目≥3個的破骨細胞數(shù)目由對照組的（216.30±13.20）個降低至（79.00±8.72）個（P＜0.01），而1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組與2 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（30.67±3.79）個比（27.00±2.65）個，P＞0.05]。與此同時，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中破骨細胞相對大小由對照組的1.00±0.04降低至0.32±0.04（P＜0.01），見圖3。

圖2 蓽茇酰胺對BMMs破骨分化的影響

圖3 蓽茇酰胺對BMMs破骨分化過程中細胞數(shù)目及相對大小的影響（A：蓽茇酰胺對成熟破骨細胞數(shù)目的影響；B：蓽茇酰胺對破骨細胞相對大小的影響）

2.3 蓽茇酰胺對破骨細胞骨吸收能力的影響 對照組、0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組、1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組分別在Osteo Assay Surface骨細胞表面培養(yǎng)板上進行骨吸收實驗后，對照組中可見大量破骨細胞進行骨吸收后形成透亮的骨吸收陷窩，而在0.5 μmol/L蓽茇酰胺處理下骨吸收數(shù)目明顯減少，而在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中幾乎僅有少量的骨吸收陷窩生成，見圖4（插頁）。進一步統(tǒng)計分析顯示，與對照組的1.00±0.12比較，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中相對骨吸收面積降低至0.20±0.03（P＜0.01），而在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組中僅為0.04±0.01（P＜0.01），見圖5。2.4 蓽茇酰胺對BMMs破骨分化過程中核心轉(zhuǎn)錄因子及特征基因mRNA表達水平的影響 在蓽茇酰胺處理后，與對照組比較，0.5 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組和1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)組破骨分化核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1和特征基因 ACP5、OSCAR、CTSK、MMP-9 mRNA表達水平均下調(diào)（均P＜0.01），見圖6。

圖4 蓽茇酰胺對破骨細胞骨吸收能力的影響

圖5 蓽茇酰胺對破骨細胞骨相對骨吸收面積的影響

圖6 蓽茇酰胺對BMMs破骨分化過程中核心轉(zhuǎn)錄因子及特征基因mRNA表達水平的影響

3 討論

目前骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防主要為調(diào)整生活方式、補充鈣劑和維生素D，其治療主要集中在抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收和（或）促進成骨細胞介導(dǎo)的骨形成。雙膦酸鹽、降鈣素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑（雷洛昔芬）、雌激素治療、甲狀旁腺素類似物（特立帕肽）及RANKL單抗（狄諾塞麥）等抗骨質(zhì)疏松藥物均有不同的適應(yīng)證、用法、用量、不良反應(yīng)，且部分藥物價格較高而難以被廣泛應(yīng)用[6-7]。破骨細胞主要來自于血系單核/巨噬細胞系統(tǒng)，其作為體內(nèi)唯一具有骨吸收作用的終末分化細胞，在骨發(fā)育、骨塑性、骨折修復(fù)、骨穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。破骨前體細胞在M-CSF、RANKL刺激下，MAPKs（p38、Erk1/2、JNK）、NF-κB、Akt/Src、PLCγ/Ca2+等大量信號通路激活，共同促進下游轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的活化，這一過程在破骨細胞分化、成熟中發(fā)揮著重要作用[8]。破骨細胞的過度激活及伴隨骨吸收功能的過度活化是骨質(zhì)疏松、假體周圍骨溶解、腫瘤骨破壞、廢用性骨丟失等疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的核心致病機制[9]。臨床上目前廣泛應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物中，以狄諾塞麥為代表的RANKL單抗可直接靶向抑制RANKL與破骨前體細胞胞膜上NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）結(jié)合，雙膦酸鹽（如阿侖膦酸、唑來膦酸等）可通過骨表面的羥基磷灰石結(jié)合進而被破骨細胞吸收，發(fā)揮抑制其骨吸收活性并促進破骨細胞凋亡的作用[10]。除此以外，大量小分子化合物可直接作用于RANKL/RANK下游信號通路的活化，發(fā)揮抑制破骨細胞分化、減少其骨吸收功能，進而緩解骨量丟失[11]。

本研究所聚焦的藥物單體蓽茇酰胺具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和降血脂等藥理作用[4]。其中，蓽茇酰胺可通過上調(diào)過氧化物酶 4（peroxiredoxin 4，PRDX4）的表達促進胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積，引起膠質(zhì)瘤細胞凋亡[12]。蓽茇酰胺也可通過增加腫瘤細胞內(nèi)ROS水平，激活下游抑癌基因p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）依賴性途徑，抑制人胃癌MKN45細胞增殖并促進其細胞凋亡[13]。在蓽茇酰胺處理下，三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231遷移和侵襲能力降低，與上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的MMP-2和MMP-9表達降低，并且可抑制轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和SNAI2表達[14]。本研究顯示2 μmol/L及以下濃度的蓽茇酰胺對BMMs增殖無明顯抑制作用，并且TRAP染色提示在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)下幾乎無成熟破骨細胞分化，骨吸收能力檢測表明在1 μmol/L蓽茇酰胺干預(yù)下破骨細胞骨吸收能力顯著減弱。在機制探索層面上，本研究揭示了蓽茇酰胺可濃度依賴性地抑制RANKL刺激下BMMs破骨分化過程中核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1在mRNA水平的表達，從而降低下游破骨相關(guān)特征基因ACP5、OSCAR、CTSK、MMP-9的轉(zhuǎn)錄，達到抑制破骨分化的作用。BMMs作為破骨細胞的前體細胞，可在體外50 ng/ml RANKL、30 ng/ml MCSF等誘導(dǎo)因子的作用下分化成為成熟破骨細胞。其中RANKL作為破骨細胞功能維持的重要細胞因子，發(fā)揮著促進破骨細胞分化成熟、抑制其凋亡、增加其骨吸收活性等功能。目前研究已揭示在RANKL刺激下，BMMs細胞內(nèi)MAPKs、NF-κB、PI3K/Akt等信號通路出現(xiàn)明顯激活，可導(dǎo)致共同的下游核心轉(zhuǎn)錄因子NFATc1的擴增，并入核促進相關(guān)破骨細胞特征蛋白的轉(zhuǎn)錄表達，最終促進破骨細胞分化成熟[15]。近年研究表明，破骨細胞對骨基質(zhì)的吸收過程主要由無機成分的溶解和骨基質(zhì)有機成分的消化所組成。首先，黏附于骨表面的破骨細胞將氫離子泵入亞破骨細胞室從而創(chuàng)造一個酸性微環(huán)境，增加骨礦物質(zhì)的溶解度，導(dǎo)致骨礦物質(zhì)釋放并重新進入破骨細胞的細胞質(zhì)。在去除礦物質(zhì)后，膠原酶和明膠酶被分泌到亞破骨細胞隔室中，進一步消化和降解脫鈣骨基質(zhì)的膠原蛋白和其他有機成分，降解產(chǎn)物最終也被破骨細胞所吞噬[16]。

綜上所述，抑制破骨細胞的分化成熟及骨吸收功能對機體病理過程中骨量丟失的防治意義重大，本研究揭示了蓽茇酰胺對該過程的抑制作用。蓽茇酰胺的應(yīng)用，可起到防治破骨細胞分化過度或功能活躍所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松、假體周圍骨溶解、腫瘤骨破壞等骨量丟失疾病，但尚需更進一步的機制研究及動物體內(nèi)實驗結(jié)果論證。