賈 筠,杜望磊,肖廣智,趙春紅,楊西超 (空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床免疫科,陜西 西安 710032)
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,致殘率較高[1]。其病理改變以關(guān)節(jié)滑膜炎癥性增生、軟骨及骨質(zhì)不可逆性破壞為特征。早期診斷和治療是緩解RA病情進(jìn)展、改善預(yù)后的關(guān)鍵。目前臨床上診斷RA主要依靠臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查,缺乏靈敏度及特異度高的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[2]。外泌體按照大小可以分為三類:外泌體(直徑20~150 nm)、微囊泡(直徑100~1 000 nm)及凋亡小體(直徑>500 nm),含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、微小RNA(microRNA,miR)、環(huán)狀RNA等多種物質(zhì),可參與多種生物學(xué)過程[3]。其中miR是一類長(zhǎng)度為20~24個(gè)核苷酸的RNA,可靶向調(diào)控下游基因,影響各種病理生理過程,進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。miR在外泌體中穩(wěn)定存在,可以隨著體循環(huán)被遠(yuǎn)處或鄰近細(xì)胞所攝取,在多種疾病的診斷及病情評(píng)估中有重要價(jià)值,例如癌癥[5]、糖尿病[6]和神經(jīng)退行性疾病[7]等。研究發(fā)現(xiàn),外周血外泌體源性miR(exomiR)對(duì)RA的早期診斷有一定價(jià)值[8]。miR-24-3p、 miR-125a-5p和miR-144-3p既往已經(jīng)被報(bào)道在RA關(guān)節(jié)液、滑膜組織及滑膜成纖維細(xì)胞中異常表達(dá)[9-11]。外周血外泌體中miR-24-3p、 miR-125a-5p和miR-144-3p的檢測(cè)及其意義既往未見報(bào)道。本研究檢測(cè)RA患者血清e(cuò)xomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表達(dá),旨在尋找RA的早期診斷標(biāo)志物,為臨床提供參考。
選取2020年12月至2022年1月本院收治的RA患者124例(RA組),其中男52例,女72例;年齡38~72歲,平均(54.19±3.25)歲;BMI為(21.56±2.19)kg/m2。另選取同期本院健康體檢中心收取的健康體檢者100例(對(duì)照組),其中男41例,女59例;年齡35~65歲,平均(53.11±4.01)歲;BMI為(22.03±2.31)kg/m2。2組患者性別、年齡和BMI比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RA組患者納入標(biāo)準(zhǔn):①RA的診斷符合《2018中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》[12];②年齡≥18歲;③資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①腫瘤;②急慢性感染;③免疫缺陷;④代謝性疾病。
1.2.1 血清外泌體的分離和鑒定 采集受試者肘靜脈血,離心后分離血清。用EXOQ5TM-1血清外泌體試劑盒(北京博邁斯科技發(fā)展有限公司)提取外泌體,用磷鎢酸(北京中鏡科儀技術(shù)有限公司)對(duì)外泌體進(jìn)行染色。用JEM-2100F透射電子顯微鏡(上海研酷檢測(cè)中心)觀察顆粒形態(tài)。
1.2.2 蛋白印跡法檢測(cè)外泌體表面標(biāo)志物TSG101及CD63[13]表達(dá) 用外泌體總蛋白提取試劑盒(上海貝博生物科技公司)提取總蛋白,用BCA試劑盒(上海一研生物科技有限公司)檢測(cè)蛋白濃度,10% SDS-PAGE電泳分離蛋白,用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。隨后用5%脫脂奶粉封閉2 h,加入TSG101一抗(1∶10 000)、CD63一抗(1∶1 000),4 ℃過夜孵育,次日去除一抗,用TBST洗滌3次后加入二抗(1∶1 000),封閉1 h,抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigam公司。采用ECL發(fā)光儀進(jìn)行蛋白成像。
1.2.3 外泌體濃度檢測(cè) 用英國(guó)Nanosight NS300納米粒度儀檢測(cè)外泌體顆粒濃度,將樣品稀釋10 000倍,閾值為5。
1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)2組exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表達(dá)水平 用TRIzol法提取總RNA。通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,隨后用熒光定量試劑盒(上海宇玫博生物科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè),操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,用2-△△Ct法計(jì)算miR相對(duì)表達(dá)量。引物序列:miR-24-3p上游為5’-GGCGATCATACTGGGAGATG-3’,下游為5’-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3’;miR-125a-5p上游為5’-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3’,下游為5’-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3’;miR-144-3p上游為5’-ACACGTCTTGCCCTCATTATCT-3’ ,下游為5’-ATAACCTTGGGCTTGTCTTTCA-3’。
1.2.5 RA組紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)檢測(cè) 用免疫酶化學(xué)發(fā)光儀(法國(guó)梅里埃公司)檢測(cè)ESR和CRP,ESR的檢測(cè)用魏氏法[14],CRP的檢測(cè)用免疫比濁法。
1.2.6 病情活動(dòng)度評(píng)分 28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score in 28 joints,DAS28)[15]:2.6分以下為疾病緩解,2.6~3.2分為低活動(dòng)度;>3.2~5.1分為中度活動(dòng)度;5.1分以上為高活動(dòng)度。比較不同活動(dòng)度RA患者血清e(cuò)xomiR表達(dá)水平。
透射顯微鏡下觀察外泌體直徑為30~513 nm;Nanosight檢測(cè)顯示,外泌體平均粒徑為159.5 nm,總濃度為2.61×1011個(gè)顆粒/mL;蛋白印跡法檢測(cè)到外泌體標(biāo)志物TSG101及CD63(圖1),說(shuō)明樣品中含有大量外泌體顆粒,且具有外泌體特性。
a:透射電子顯微鏡觀察外泌體(箭頭所指為外泌體);b:Nanosight檢測(cè)外泌體濃度及粒徑分布;c:蛋白印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物TSG101及CD63圖1 血清外泌體鑒定
與對(duì)照組比較,RA組患者血清e(cuò)xomiR-24-3p和exomiR-144-3p表達(dá)水平較高,而exomiR-125a-5p表達(dá)水平較低(P<0.05),見表1。
表1 2組患者血清e(cuò)xomiR表達(dá)水平比較
ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清e(cuò)xomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p診斷RA的AUC分別為0.703、0.824、0.736,靈敏度分別為94.89%、96.23%、93.01%,特異度分別為75.01%、85.88%、82.14%。三者聯(lián)合檢測(cè)診斷RA的AUC為 0.889,靈敏度為97.23%,特異度為90.12%,見圖2。
圖2 血清e(cuò)xomiR診斷RA的ROC曲線
血清e(cuò)xomiR-24-3p、exomiR-144-3p與DAS28、ESR、CRP均呈正相關(guān)(P<0.05);exomiR-125a-5p與DAS28、ESR、CRP均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),見表2。單因素分析結(jié)果顯示,不同疾病活動(dòng)度RA患者的exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p、exomiR-144-3p表達(dá)水平比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),疾病活動(dòng)度越高,exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表達(dá)水平越高,而 exomiR-125a-5p表達(dá)水平越低,見表3。
表2 血清e(cuò)xomiR與DAS28評(píng)分、ESR、CRP的相關(guān)性分析(r值)
表3 血清e(cuò)xomiR與疾病活動(dòng)度的關(guān)系
RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,隨著病情進(jìn)展,可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙,因此早期診斷顯得尤為重要[1]。當(dāng)前臨床上仍缺乏高靈敏度和特異度的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo),主要依靠臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查,然而部分患者就診時(shí)已出現(xiàn)不可逆的關(guān)節(jié)損傷[16]。外泌體在RA發(fā)生發(fā)展中的作用近年來(lái)備受關(guān)注。外泌體是一種囊泡體,可以由所有細(xì)胞分泌,存在于血液、尿液和腦脊液等多種體液組織中[17]。外泌體中含有非常多的生物活性物質(zhì),例如蛋白質(zhì)和非編碼RNA等重要的遺傳物質(zhì),這些物質(zhì)可以通過循環(huán)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞而發(fā)揮作用[18]。有研究顯示,外泌體可以參與發(fā)育、免疫炎癥損傷、組織修復(fù)等病理生理過程,外泌體來(lái)源的淀粉樣蛋白、瓜氨酸蛋白、非編碼RNA對(duì)RA的診斷和治療有較高的應(yīng)用價(jià)值[19]。
miR是單鏈非編碼RNA,可作用于靶基因,抑制其翻譯或者促使其降解,起到轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用。miR分子較為穩(wěn)定,并且特異度較高,成為研究RA生物學(xué)標(biāo)志物的熱點(diǎn)。miR占所有外泌體的50%以上,exomiR為RA的早期診斷提供了較好的思路[20]。有研究發(fā)現(xiàn),RA患者血漿exomiR-146a-5p、 exomiR-155-5p均高于健康人群,并且RA活動(dòng)期患者高于穩(wěn)定期患者[21]。本研究檢測(cè)了RA患者血清中exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p表達(dá)水平。miR-24-3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA,在骨關(guān)節(jié)炎[22]和癌癥[23]等疾病中異常表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn),miR-24-3p與免疫炎癥損傷有關(guān),在RA患者血漿中表達(dá)水平升高,對(duì)RA的診斷有一定價(jià)值[24-25]。miR-125a-5p與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān),參與免疫炎癥信號(hào)通路的應(yīng)答,調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化[26]。有研究顯示,RA患者血漿中miR-125a-5p的表達(dá)水平降低[25]。miR-144-3p可通過BMP2/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)RA患者軟骨損傷[11]。本研究也發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,RA組患者血清e(cuò)xomiR-24-3p和exomiR-144-3p表達(dá)水平較高,而exomiR-125a-5p表達(dá)水平較低。提示miR-24-3p、 miR-125a-5p和miR-144-3p可通過調(diào)節(jié)免疫炎癥而影響RA進(jìn)展。
本研究首次分析了血清e(cuò)xomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p診斷RA的價(jià)值,結(jié)果顯示,血清e(cuò)xomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p診斷RA的AUC分別為0.703、0.824、0.736,靈敏度分別為94.89%、96.23%、93.01%,特異度分別為75.01%、85.88%、82.14%;三者聯(lián)合檢測(cè)可將AUC提高至0.889,靈敏度提高至97.23%,特異度提高至90.12%。提示血清e(cuò)xomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p三者聯(lián)合診斷RA的價(jià)值較高。在RA疾病活動(dòng)度方面,血清e(cuò)xomiR-24-3p、exomiR-144-3p均與DAS28、ESR、CRP呈正相關(guān);exomiR-125a-5p與DAS28、ESR、CRP均呈負(fù)相關(guān);且RA疾病活動(dòng)度越高,exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表達(dá)水平越高,而 exomiR-125a-5p表達(dá)水平越低。提示exomiR-24-3p、 exomiR-125a-5p和exomiR-144-3p對(duì)RA的診斷和病情評(píng)估有較高價(jià)值。
綜上所述,RA患者血清中exomiR-24-3p和exomiR-144-3p表達(dá)水平較健康人群高,而exomiR-125a-5p表達(dá)水平較低;三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)RA的診斷有較高價(jià)值,并且可以評(píng)估疾病活動(dòng)度。然而本研究也存在一些局限性,未檢測(cè)RA患者治療前后exomiR表達(dá)水平的變化,也未探討exomiR在RA中的作用機(jī)制。未來(lái)需要開展體內(nèi)外研究,分析exomiR影響RA的生物學(xué)機(jī)制。