吳海芳，張海波，黃素靜，韓一栩 (海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科， 海南 ?？?570311)

宮頸癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位，病死率占惡性腫瘤第二位[1-2]。盡管人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)疫苗能有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，但多數(shù)女性并未接種或接種延遲，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病率居高不下[2-4]。目前，手術(shù)切除聯(lián)合化療是臨床治療及改善宮頸癌的主要方式，但對(duì)于已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其生存率及預(yù)后仍不理想[5]。因此，積極探究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

眾所周知，腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。趨化因子是一類具有招募-趨化作用的細(xì)胞因子，主要通過與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，定向趨化靶細(xì)胞至炎癥、感染或損傷部位。近年來，CXCL12/CXCR4軸因其在宮頸癌中的特殊作用引起學(xué)者的廣泛關(guān)注，一方面被認(rèn)為是HPV感染的輔助因子[6]，另一方面CXCL12/CXCR4軸在缺氧時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，這預(yù)示著其可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及患者生存期縮短具有相關(guān)性[6-9]。進(jìn)一步研究證實(shí)，CXCL12/CXCR4軸的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，靶向CXCL12/CXCR4軸能提高宮頸癌患者的治愈率[10]。白介素-24(interleukin-24,IL-24)是一種獨(dú)特的具有抑瘤作用的細(xì)胞因子。內(nèi)源性IL-24可在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失，體內(nèi)外研究證實(shí)IL-24具有廣譜的抗腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的作用[11-14]。有學(xué)者對(duì)肺癌與口腔鱗癌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，IL-24能夠通過靶向CXCL12/CXCR4軸抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，但其在宮頸癌中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道[15-16]。因此，我們通過體外篩選高表達(dá)CXCR4的Hela細(xì)胞進(jìn)行探究，以期為靶向CXCL12/CXCR4軸的宮頸癌治療提供新的思路及策略。

1 材料與方法

1.1 材料

正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic購自美國(guó)ATCC；宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha、Caski、C-33A購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；DMEM/HG培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗購自美國(guó)Hyclone公司；FBS購自美國(guó)Gibco公司；人重組CXCL12、AMD3100購自美國(guó)Sigma公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司；嘌呤霉素、含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或兔抗大鼠IgG購自武漢博士的生物科技公司；兔抗CXCR4單克隆抗體購自美國(guó)Santa CruZ公司；大鼠抗Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR單克隆抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；SYBR Green RT-PCR Master Mix購自北京康為世紀(jì)科技公司；RT-PCR引物由上海生工合成；攜帶綠色熒光的過表達(dá)IL-24慢病毒(LV-IL-24)和陰性對(duì)照慢病毒(LV-NC)由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司構(gòu)建；BCA蛋白定量試劑盒購自英國(guó)Proteintech生物公司；Transwell小室(8 μm) 購自美國(guó)Millpore公司；酶標(biāo)儀、PCR儀、RT-PCR儀購自美國(guó)Bio-Rad公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、感染及分組 正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic及宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha、Caski、C-33A均培養(yǎng)于含10%FBS與1%雙抗的DMEM/HG培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞，0.25%含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/孔，接種至12孔板中。培養(yǎng)12 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)融合至50%～60%時(shí)，更換為含0.8 μg/mL聚凝胺的不含F(xiàn)BS的新鮮培養(yǎng)基，加入稀釋后的LV-NC或LV-IL-24慢病毒液(病毒感染復(fù)數(shù)=15)，置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，去除原培養(yǎng)液，更換為含1 μg/mL嘌呤霉素、10%FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5 d，以篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞。取感染72 h后的Hela細(xì)胞，置于熒光顯微鏡下觀察感染效率。將Hela細(xì)胞分為6組，其中Control組細(xì)胞正常培養(yǎng)，無任何特殊處理；CXCL12組細(xì)胞用100 ng/mL CXCL12處理；CXCL12+LV-NC組細(xì)胞感染LV-NC后使用100 ng/mL CXCL12處理；CXCL12+LV-IL-24組細(xì)胞感染LV-IL-24后使用100 ng/mL CXCL12處理；CXCL12+AMD3100組細(xì)胞參考文獻(xiàn)[16]方法處理并聯(lián)合100 ng/mL CXCL12及1 μg/mL AMD3100處理；CXCL12+AMD3100+LV-IL-24組細(xì)胞經(jīng)LV-IL-24感染后聯(lián)合100 ng/mL CXCL12與1 μg/mL AMD3100處理。上述各組細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2的恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的待測(cè)細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)純度與質(zhì)量后，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后參考SYBR Green RT-PCR Master Mix說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。RT-PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)周期。RT-PCR的引物序列為：CXCR4-F，5’-CCACCATCTACTCCATCATCTTC-3’,CXCR4-R，5’-ACTTGTCCGTCATGCTTCTC-3’;IL-24-F，5’-GCCAA-GCTTATGAATTTTCAACAGAGG-3’,IL-24-R，5’-GCCG-TCGACCTAGAGCTTGTAGAATTT-3’；β-actin-F，5’-AA-ATCTGGCACCACACCTTC-3’，β-actin-R，5’-AGCACA-GCCTGGATAGCAAC-3’。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，常規(guī)消化后調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/孔并接種至背面劃有相距約5 mm的平行水平線的6孔板中，培養(yǎng)24 h后待單層細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，用10 μL的移液器槍頭尖端垂直于平行線在培養(yǎng)皿的底部劃2條平行線，輕輕擦去平行線內(nèi)部細(xì)胞，PBS沖洗2次后，按1.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行分組處理，并更換為相應(yīng)的不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞的遷移狀況。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的感染LV-NC、LV-IL-24或正常未感染的Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/孔并接種至基質(zhì)膠包被的Transwell小室，按1.2.1項(xiàng)下方法將下室更換為含10%FBS的不同條件的培養(yǎng)液，共800 μL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，濕棉簽擦拭小室上層未穿出細(xì)胞，無水乙醇固定后，0.1%的結(jié)晶紫進(jìn)行染色，PBS沖洗后，倒置顯微鏡下觀察穿出細(xì)胞數(shù)，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取待測(cè)細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒說明書檢測(cè)蛋白濃度后，取加熱變性的蛋白約40 μg在10%的SDS-PAGE凝膠上于80 V恒壓下電泳分離不同蛋白條帶，隨后在電流為130 mA、電壓為20 V的條件下將分離后的蛋白條帶采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉進(jìn)行抗體封閉后，加入一抗CXCR4(1∶800)、Akt(1∶800)、p-Akt(1∶500)、p-mTOR(1∶500)、mTOR(1∶800)、β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶5 000)并于室溫下孵育2 h，滴加發(fā)光液進(jìn)行曝光拍照。Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以待測(cè)蛋白與內(nèi)參β-actin的比值作為其相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CXCR4在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

RT-PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常子宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic相比，宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha、Caski、C-33A中CXCR4的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，其在Hela細(xì)胞中的表達(dá)最為顯著(P<0.01)，因此選用Hela細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

a：RT-PCR檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞系中CXCR4 mRNA表達(dá)；b：Western blot檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞系中CXCR4蛋白表達(dá) *：與HcerEpic相比，P<0.05；#：與HcerEpic相比，P<0.01圖1 CXCR4在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 慢病毒感染后Hela細(xì)胞中IL-24的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，與Control組相比，轉(zhuǎn)染LV-NC與LV-IL-24慢病毒的細(xì)胞中可見明顯綠色熒光；RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，轉(zhuǎn)染LV-IL-24的細(xì)胞中IL-24 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染LV-NC的細(xì)胞中IL-24 mRNA無明顯變化(P>0.05)，見圖2。

a：免疫熒光觀察宮頸癌細(xì)胞中慢病毒感染效率(×100)；b：RT-PCR檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中IL-24的mRNA表達(dá) #：與Control組相比，P<0.01圖2 宮頸癌細(xì)胞中慢病毒感染效率驗(yàn)證

2.3 過表達(dá)IL-24對(duì)CXCL12介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，CXCL12組與CXCL12+LV-NC組細(xì)胞的遷移率顯著增加(P<0.05)，而CXCL12+LV-IL-24組、CXCL12+AMD3100組及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞的遷移率均明顯降低(P<0.05)，其中以CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組最為顯著(P<0.01)；與CXCL12組相比，CXCL12+LV-IL-24組、CXCL12+AMD3100組及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞遷移率均明顯降低(P<0.01)，CXCL12+LV-NC組無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

*：與Control組相比，P<0.05；#：與Control組相比，P<0.01；△：與CXCL12組相比，P<0.01圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組宮頸癌細(xì)胞的遷移能力

2.4 過表達(dá)IL-24對(duì)CXCL12介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，CXCL12組與CXCL12+LV-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，而CXCL12+LV-IL-24組、CXCL12+AMD3100組及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，且以CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組最為明顯(P<0.01)；與CXCL12組相比，CXCL12+LV-IL-24組、CXCL12+AMD3100組及CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，CXCL12+LV-NC組無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

a:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力(×100);b：侵襲細(xì)胞數(shù)定量圖 *：與Control組相比，P<0.05；#：與Control組相比，P<0.01；△：與CXCL12組相比，P<0.05圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力

2.5 過表達(dá)IL-24對(duì)CXCL12介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞中Akt/mTOR途徑表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，CXCL12組、CXCL12+LV-NC組細(xì)胞中CXCR4、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，CXCL12+AMD3100組和CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞中CXCR4、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，CXCL12+LV-IL-24組中CXCR4蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)，但p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。與CXCL12組相比，CXCL12+LV-IL-24組、CXCL12+AMD3100組和CXCL12+LV-IL-24+AMD3100組細(xì)胞中CXCR4、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5。

a：Western blot檢測(cè)CXCR4及Akt/mTOR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)；b～d：各蛋白定量圖 *：與Control組相比，P<0.05；△：與CXCL12組相比，P<0.05；▲：與CXCL12組相比，P<0.01圖5 各組細(xì)胞中的CXCR4、p-Akt與p-mTOR蛋白表達(dá)

3 討論

CXCR4是位于細(xì)胞膜上的七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，而G蛋白偶聯(lián)受體是最為常用的藥物靶標(biāo)[17]。CXCR4信號(hào)通路在胚胎的發(fā)育、組織修復(fù)、骨髓造血和免疫監(jiān)控等正常生理過程中起關(guān)鍵作用[18]。而在腫瘤中，有研究報(bào)道CXCR4能夠直接促進(jìn)多種癌細(xì)胞的形成、增殖和轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程[19-20]。在小鼠體內(nèi)，中和CXCL12/CXCR4的相互作用可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞向局部淋巴結(jié)和肺的轉(zhuǎn)移[21]。同時(shí)，位于細(xì)胞膜表面的CXCR4在CXCL12作用下發(fā)生內(nèi)化，不僅促進(jìn)細(xì)胞表面CXCR4受體的表達(dá),還放大了上游信號(hào)，通過刺激胞內(nèi)鈣離子的釋放，進(jìn)而激活ERK、Akt/mTOR信號(hào)通路及腺苷環(huán)化酶和環(huán)磷酸腺苷，而上述信號(hào)途徑的活化能夠直接誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、存活及蛋白合成，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[22-23]。

AMD3100是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的CXCR4抑制劑，其能夠有效破壞CXCL12/CXCR4軸而發(fā)揮抗癌作用[24]。有研究證實(shí)，外源重組CXCL12可通過CXCR4誘導(dǎo)Hela等多種宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲行為[25]。故本研究首先篩選出高表達(dá)CXCR4的宮頸癌Hela細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行探究，結(jié)果表明，外源性CXCL12能夠顯著促宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲，還能通過促進(jìn)p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)，激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路；而應(yīng)用AMD3100能夠有效阻斷上述途徑，抑制CXCL12/CXCR4對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移的促進(jìn)作用。

IL-24又稱為黑色瘤分化相關(guān)基因-7(melanoma differentiation associated gene-7，MDA-7),屬于IL-10基因家族的一種分泌型細(xì)胞因子[11]。盡管IL-24早在十幾年前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但其在病理生理中的具體作用直到近年來才逐漸明確。研究證實(shí)，IL-24不僅參與正常的免疫過程，其同樣在人類其他多種疾病中發(fā)揮重要的作用。IL-24對(duì)于黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤具有抑制作用，此外，IL-24還能夠調(diào)控自身免疫系統(tǒng)疾病與炎癥感染[12,14,26]。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，IL-24不僅能夠抑制腫瘤干細(xì)胞增殖，降低干細(xì)胞的自我更新能力，還能誘導(dǎo)其凋亡。此外，IL-24還能直接作用于調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路，如在乳腺癌中，過表達(dá)IL-24能夠通過抑制Wnt/β-catenin和PI3K/Akt/mTOR等信號(hào)通路，抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)[27]。通過反向蛋白陣列分析野生型與突變型的IL-24肺癌細(xì)胞裂解物發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)的差異最為顯著，且IL-24的突變顯著降低了p-Akt和p-mTOR的表達(dá)[28]。在宮頸癌中，Shi等[29]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IL-24能夠通過下調(diào)MMP-2的表達(dá)，上調(diào)p38絲裂原活化蛋白激酶，從而在體外抑制宮頸癌細(xì)胞Caski的遷移與侵襲。還有研究顯示，聯(lián)合應(yīng)用IL-24可能通過降低血管生長(zhǎng)因子及其受體與血小板源性生長(zhǎng)因子-B的表達(dá)，從而降低裸鼠宮頸癌移植瘤的微血管密度，增強(qiáng)腫瘤對(duì)順鉑的化療敏感性[30]。這說明IL-24對(duì)抑制宮頸癌的進(jìn)展及改善其治療效果具有極大的應(yīng)用前景。有研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用AMD3100控制腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床療效欠佳，聯(lián)合應(yīng)用IL-24與AMD3100可能是更好地控制腫瘤進(jìn)展的有效策略[31]。在肺癌與口腔鱗狀細(xì)胞癌中的研究均證實(shí)，過表達(dá)IL-24能夠明顯抑制CXCL12/CXCR4軸對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲的促進(jìn)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IL-24可能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制CXCR4的表達(dá)[14-15]。本課題組發(fā)現(xiàn)過表達(dá)IL-24同樣能夠抑制CXCL12/CXCR4軸介導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲與轉(zhuǎn)移，且聯(lián)合AMD3100的作用最為顯著，其機(jī)制可能為下調(diào)p-Akt和p-mTOR的表達(dá)，從而抑制Akt/mTOR等信號(hào)通路的激活；此外，本研究還觀察到過表達(dá)IL-24能抑制CXCL12對(duì)Hela細(xì)胞中CXCR4表達(dá)的促進(jìn)作用。這說明聯(lián)合使用IL-24能更好促進(jìn)AMD3100對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用，而這可能是通過CXCL12/CXCR4軸發(fā)揮作用。

綜上，過表達(dá)IL-24能夠通過Akt/mTOR信號(hào)途徑抑制CXCL12/CXCR4軸誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞的侵襲與遷移行為，且聯(lián)合應(yīng)用CXCR4抑制劑AMD3100的效果更為顯著。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究IL-24結(jié)合CXCL12/CXCR4對(duì)宮頸癌靶向治療提供了新的思路及策略。