崔樂源，盛夏薇，郭佳琳，陳婧鈿，孫憲芝

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室,山東 泰安， 271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

隨著人們生活水平的不斷提高，茶用菊花得到越來越多的關(guān)注與使用，針對(duì)茶用的菊花品種也不斷涌現(xiàn)，其中‘金絲皇菊’以朵大、花型美麗、富含黃酮、氨基酸和微量元素等優(yōu)點(diǎn)而成為生產(chǎn)上的最重要品種之一[1]。有清熱解火和消暑的功效，是一種兼具觀賞和藥用價(jià)值的作物[2]，具有較高的市場(chǎng)價(jià)值。

菊花是異質(zhì)六倍體，因其遺傳背景復(fù)雜，自交不親和且雜交性狀分離嚴(yán)重，在自然狀態(tài)下結(jié)實(shí)率極低，不太可能通過自交獲得自交系[3-4]。因此，目前菊花的繁殖主要是扦插和分株等無性繁殖方式[5]。傳統(tǒng)的方式需要較多的母株材料、繁殖周期長(zhǎng)、易受季節(jié)和外界環(huán)境的影響，隨著市場(chǎng)需求量的日益增加，傳統(tǒng)方式已無法滿足市場(chǎng)發(fā)展的需要[6]。組培快繁技術(shù)可以通過根、莖、葉等器官大量誘導(dǎo)組培苗，具有培養(yǎng)周期短、繁殖速度快、保持母本優(yōu)良性狀、不受季節(jié)及地區(qū)等因素的影響、可周年連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)[7-8]。一方面，組培可以對(duì)菊花進(jìn)行脫毒復(fù)壯，保持有優(yōu)良性狀，短時(shí)間大量繁殖，滿足市場(chǎng)需求；另一方面，組培可為新品種的選育和轉(zhuǎn)基因操作奠定基礎(chǔ)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)菊花組培快繁的研究報(bào)道很多，如切花菊‘白扇’[9]和‘太行菊’[10]。但‘金絲皇菊’的組培快繁技術(shù)還未見報(bào)道。本研究開展了‘金絲皇菊’的外植體消毒、誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及煉苗移栽，獲得了‘金絲皇菊’組培苗最適培養(yǎng)基配比，對(duì)加快‘金絲皇菊’的繁殖速度，滿足市場(chǎng)需求，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘金絲皇菊’當(dāng)年生莖段。材料取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院研究基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 選取生長(zhǎng)良好、無病蟲害的‘金絲皇菊’帶芽嫩枝作為外植體，流水沖洗2 h，剪去葉片，放于超凈工作臺(tái)上。用75%乙醇浸泡30 s，快速取出，無菌水沖洗3次，放入不同濃度（5%、15%、25%）的次氯酸鈉溶液中分別消毒20 min，消毒過程中不斷振蕩燒杯。無菌水沖洗5次后用濾紙吸干水分，將外植體切成帶有1~2個(gè)腋芽的莖段，接種在不加激素的空白培養(yǎng)基中，每組消毒處理3個(gè)重復(fù)。30 d后對(duì)褐化率、染菌率和外植體的生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出一個(gè)適宜的消毒方式。生長(zhǎng)情況包括誘導(dǎo)芽的長(zhǎng)勢(shì)、葉片顏色與大小等。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂5.2 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，其中附加一定濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）、NAA（0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L-1）。以不加激素的MS培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將消毒滅菌后的外植體剪成小段，每段帶有1~2個(gè)腋芽，接種到含不同濃度激素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)組培瓶1~2段。誘導(dǎo)培養(yǎng)基分16個(gè)處理組，每組4次重復(fù)。光照培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度為35%~40%，光照時(shí)數(shù)為12 h·d-1。培養(yǎng)28 d后，記錄不同激素配比下產(chǎn)生的芽誘導(dǎo)率、平均出芽個(gè)數(shù)、不定芽形態(tài)結(jié)構(gòu)是否良好數(shù)據(jù)。觀察并分析誘導(dǎo)培養(yǎng)期‘金絲皇菊’組培苗的長(zhǎng)勢(shì)。

1.2.3 生根壯苗培養(yǎng) 將健壯的無根小苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，其中附加一定濃度的6-BA（0.5、1 mg·L-1）、NAA（0.1、0.2 mg·L-1）和活性炭（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）。以不加激素和活性炭的1/2MS培養(yǎng)基作為對(duì)照組。光照培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度為35%~40%，光照時(shí)數(shù)為12 h·d-1。培養(yǎng)28 d后，記錄生根條數(shù)、根的長(zhǎng)度、生根率等數(shù)據(jù)，評(píng)估生根情況，觀察并篩選出最適的生根培養(yǎng)基。

1.2.4 煉苗移栽及苗圃管理 組培苗高和根長(zhǎng)均在7 cm左右即可開始煉苗，先打開組培瓶口套上自封袋，移到自然光下2~3 d，讓試管苗接受正常光照射，使其長(zhǎng)得更加壯實(shí)。2 d后將自封袋扎孔，適應(yīng)3~4 d后撤掉自封袋，繼續(xù)煉苗2~3 d。

煉苗后將小苗從組培瓶中小心取出，輕柔地洗凈根部附著的瓊脂，盡量保留須根，將根部浸入多菌靈稀釋液中消毒15 min，移栽到經(jīng)75%酒精消毒過的營(yíng)養(yǎng)土與園土(1∶1)混合的基質(zhì)中。最初階段注意遮陰、保溫，空氣相對(duì)濕度與培養(yǎng)基保持相似。14 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率，對(duì)移栽狀況進(jìn)行評(píng)估。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 具體公式如下：

外植體消毒、誘導(dǎo)培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等所獲得的數(shù)據(jù)，采用Excel 2013和SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑濃度對(duì)初代培養(yǎng)效果的影響

由表1可知，接種30 d后，5%次氯酸鈉消毒的染菌率最高；25%次氯酸鈉處理的褐化率較高；而15%次氯酸鈉處理的染菌率最低，組培苗長(zhǎng)勢(shì)最好，葉片濃綠無枯萎，且差異顯著。因此，‘金絲皇菊’初代培養(yǎng)的最佳表面消毒條件為15%次氯酸鈉消毒20min。

表1 不同消毒劑濃度對(duì)‘金絲皇菊’初代培養(yǎng)的影響

2.2 激素配比對(duì)組培苗誘導(dǎo)的影響

由表2可知，接種28 d后，所有試驗(yàn)組的外植體基部均出現(xiàn)了愈傷組織，但各組的愈傷組織分化情況有所不同。當(dāng)NAA濃度為0.2、0.3 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量較多，說明NAA濃度較高不利于不定芽的誘導(dǎo)，容易產(chǎn)生畸形芽，長(zhǎng)勢(shì)不佳。當(dāng)6-BA濃度在0.5~2.0 mg·L-1時(shí)，均誘導(dǎo)出不定芽。當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg·L-1、NAA濃度為0.3 mg·L-1時(shí)芽誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均出芽個(gè)數(shù)為6.75個(gè)·株-1，顯著高于CK處理，組培苗更健壯、葉色濃綠，基部的愈傷組織呈黃綠色。因此，‘金絲皇菊’初代培養(yǎng)中培養(yǎng)基的最佳激素配比為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA。

2.3 激素配比對(duì)組培苗生根的影響

由表3可知，對(duì)13組和15組進(jìn)行比較，結(jié)果得出13組培養(yǎng)基中側(cè)根更多、根部更粗。對(duì)9組和12組進(jìn)行比較、13組和16組進(jìn)行比較，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比值相同，濃度越高，根萌發(fā)條數(shù)越少，形態(tài)越細(xì)長(zhǎng)。對(duì)1組、5組、9組、13組進(jìn)行比較，得出隨著活性炭含量的增加，分化出的根數(shù)也逐步增加（圖1）。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)‘金絲皇菊’組培苗生根的影響

圖1 生根情況

當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1、活性炭含量為0.4%時(shí)生根率達(dá)到100%，平均生根條數(shù)達(dá)到17.67條·株-1，顯著高于CK處理，產(chǎn)生的組培苗根部更長(zhǎng)，更粗壯，側(cè)根極多。因此，‘金絲皇菊’生根培養(yǎng)中培養(yǎng)基的最佳配比為1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+0.4%活性炭。

2.4 煉苗與移栽及田間管理

筆者經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，撤掉自封袋后繼續(xù)煉苗時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響組培苗的成活率。由圖2可知，撤掉自封袋后，培養(yǎng)基水分迅速蒸發(fā)，若不能及時(shí)移栽，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基過度干燥。煉苗后的‘金絲皇菊’組培苗僅在1周左右即長(zhǎng)出新根，植株高度也快速增加,莖呈嫩綠色、粗壯，此時(shí)可進(jìn)行移栽。

圖2 繼續(xù)煉苗3 d（A）與繼續(xù)煉苗1.5 d（B）

移栽前，在清洗苗根部的培養(yǎng)基時(shí)，11組和12組的根太細(xì)，容易斷開，對(duì)根部損傷較大；10組和13組的根相對(duì)較粗，較易與培養(yǎng)基分離，不易斷根。由表4、圖3可知，根部損傷較小的試驗(yàn)組移栽后更易存活、植株長(zhǎng)勢(shì)更健壯。

圖3 11組（A）與13組（B）移栽14d后長(zhǎng)勢(shì)

表4 煉苗移栽后植株長(zhǎng)勢(shì)

3 討論與結(jié)論

3.1‘金絲皇菊’的外植體消毒

外植體消毒是建立快繁技術(shù)體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?！鸾z皇菊’莖段對(duì)5%和25%的次氯酸鈉處理比較敏感，消毒濃度為25%時(shí)，組培苗的褐化率最高，染菌率最低。要想減少褐化現(xiàn)象的發(fā)生，消毒劑的濃度要在適宜的范圍內(nèi)。若消毒劑濃度過高，會(huì)直接殺死切口處的組織，導(dǎo)致整個(gè)外植體褐化。由于‘金絲皇菊’的莖段比較幼嫩，切口處易受到滅菌劑的傷害，褐化現(xiàn)象比較嚴(yán)重。所以外植體材料的消毒處理方式必須符合要求。

外植體滅菌前，先用流動(dòng)的自來水沖洗，一般沖洗1~2 h?！鸾z皇菊’莖段及葉片表面長(zhǎng)有小絨毛并不光滑，可加稀釋后的洗潔精洗滌。雖然試驗(yàn)中選用莖段作為外植體，但是不宜將葉片連帶葉柄全部摘下，否則一段時(shí)間后不僅外植體會(huì)萎蔫，經(jīng)次氯酸鈉處理傷口處的組織也會(huì)變白，喪失細(xì)胞活性（圖4），所以需要預(yù)留一部分葉柄來保護(hù)莖段組織被消毒劑殺死（圖5）。

圖4 傷口處的組織在消毒后變白

圖5 葉柄全部摘下（A）與葉柄部分保留（B）

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15%次氯酸鈉消毒染菌率較低，組培苗長(zhǎng)勢(shì)最好，‘金絲皇菊’初代培養(yǎng)的最佳表面消毒條件為15%次氯酸鈉消毒20 min。

顧昌華等[11]研究表明，用2%次氯酸納+0.1%升汞消毒各5 min，對(duì)墨菊的外植體頂芽有良好的消毒效果。劉丹等[12]報(bào)道，盆栽小菊‘子午線’外植體最佳消毒處理方式是乙醇處理30 s，次氯酸鈉溶液處理7 min。本研究結(jié)果與上述試驗(yàn)結(jié)果均有所不同。由此可見，菊花不同品種對(duì)消毒條件要求有所差異。

3.2 ‘金絲皇菊’的誘導(dǎo)培養(yǎng)

外植體的萌動(dòng)受到啟動(dòng)培養(yǎng)基成分的影響。李露華[13]報(bào)道稱，貢菊叢生芽最適合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5~2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1時(shí)有利于腋芽形成，45 d的增殖倍數(shù)為5.3~5.8。滕如萍等[14]指出，切花菊‘神馬’頂芽初代再生的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1。筆者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于‘金絲皇菊’的莖段而言，隨著6-BA濃度的增加，分化出的不定芽數(shù)量也逐步增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳激素配比為MS＋2.0 mg·L-16-BA＋0.3 mg·L-1NAA。本研究結(jié)果與以上結(jié)論有所不同，原因可能是品種和器官不同所致。

3.3 ‘金絲皇菊’的生根培養(yǎng)

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著活性炭含量的增加，根的條數(shù)在增加，外觀也更加粗長(zhǎng)，這是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基中添加活性炭可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，吸附對(duì)生長(zhǎng)有抑制作用的物質(zhì)，并在生根培養(yǎng)階段提供暗環(huán)境，更利于根的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的升高，根萌發(fā)的條數(shù)在減少，由此證明了高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑會(huì)抑制根的分化，低濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)根系的發(fā)生。本研究關(guān)于‘金絲皇菊’的生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS＋0.5 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA＋0.4%活性炭。接種28 d后平均生根數(shù)可達(dá)17條，生根率100%，優(yōu)于湯春梅[15]的研究結(jié)果。

3.4 煉苗與移栽

煉苗時(shí)培養(yǎng)基水分蒸發(fā)較快，應(yīng)及時(shí)觀察以保證組培苗煉苗期間的成活率。本研究發(fā)現(xiàn)，煉苗時(shí)間為1.5 d左右較為合適，組培苗長(zhǎng)勢(shì)較好。移栽后根部損傷較輕的組培苗成活率和長(zhǎng)勢(shì)較高。

綜上，本研究建立了‘金絲皇菊’組培快繁技術(shù)體系，為‘金絲皇菊’的規(guī)?；敝程峁├碚摶A(chǔ)與技術(shù)支持。研究結(jié)果表明，‘金絲皇菊’的最佳消毒方案為15%次氯酸鈉消毒20 min；誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配比為MS＋2.0 mg·L-16-BA＋0.3 mg·L-1NAA；生根培養(yǎng)基的最佳配比為1/2MS＋0.5 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA＋0.4%活性炭。