王金香，張阿良，秦 敏，曹江梅，陳 文，郭瑞瑞

（山西大同大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西 大同 037009）

由于人類對(duì)鎘（Cd）的開發(fā)、冶煉、加工和利用，大量的Cd不可避免被排放到空氣、水和土壤當(dāng)中，造成嚴(yán)重環(huán)境污染。2014年全國(guó)土壤調(diào)查結(jié)果顯示，Cd污染超標(biāo)率達(dá)到7%。鎘離子（Cd2+）易溶于水、毒性強(qiáng)且不易被降解，會(huì)通過(guò)根系被植物不斷吸收并通過(guò)食物鏈傳遞積累到不同生物體中，更加劇了對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類的威脅。

作為一種植物非必需重金屬元素，Cd2+會(huì)抑制發(fā)芽水稻種子中淀粉酶活性，減少種子萌發(fā)所需的物質(zhì)和能量，降低種子發(fā)芽率并影響幼苗的后續(xù)生長(zhǎng)[1-2]。大蒜根系受到Cd2+脅迫后出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞壁明顯增厚，細(xì)胞器嚴(yán)重受損，細(xì)胞液泡化程度提高，核質(zhì)高度凝集[3]。高濃度Cd2+能造成水稻根毛細(xì)胞膜的去極化，影響質(zhì)膜上K+通道開放，導(dǎo)致根系內(nèi)K+外滲，造成K元素缺失和離子失衡，影響根對(duì)水分和礦物質(zhì)的吸收和運(yùn)輸[4]。Cd2+的存在同樣影響葉片的發(fā)育，導(dǎo)致氣孔數(shù)量減少、氣孔閉合率發(fā)生變化，葉綠素的合成受阻、葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，引發(fā)葉片枯黃失綠，植株的生長(zhǎng)被抑制[5-6]。高濃度Cd2+抑制小麥旗葉的生長(zhǎng)，直接或間接影響到開花相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)植物的開花和成花過(guò)程產(chǎn)生毒性效應(yīng)，造成小麥籽粒產(chǎn)量下降和Cd2+含量超標(biāo)，最終影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[2,7]。

玉米是中國(guó)北方地區(qū)主要的糧食作物，種植范圍廣、生物量大，具有較強(qiáng)的Cd2+吸附能力。但玉米幼苗生長(zhǎng)期對(duì)Cd2+十分敏感，是最先受土壤Cd2+污染危害的階段。宇克莉等[8]報(bào)道，高濃度Cd2+處理后玉米幼苗生長(zhǎng)受到明顯抑制，細(xì)胞膜系統(tǒng)破壞明顯，細(xì)胞器損傷嚴(yán)重。劉建新等[9]研究證實(shí)，Cd2+脅迫不僅抑制幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育和干物質(zhì)積累，而且會(huì)影響抗氧化酶活性，打破機(jī)體的氧化代謝平衡，引起生物毒性。本研究將進(jìn)一步探討玉米苗期Cd2+的積累，葉綠素、凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和葉間CO2濃度（Ci）與Cd2+變化的相關(guān)模式，探索不同Cd2+濃度對(duì)幼苗葉片抗氧化酶系統(tǒng)及抗氧化物質(zhì)、活性氧生成、膜脂過(guò)氧化的影響，以揭示Cd2+脅迫對(duì)玉米光合特性和活性氧代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料與設(shè)計(jì)

挑選顆粒飽滿、大小一致的玉米種子（ZeamaysL.，‘農(nóng)大108’）經(jīng)次氯酸鈉浸種、清水漂洗后放到培養(yǎng)盤中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱遮光萌發(fā)24 h，選取發(fā)芽一致種子放于盛有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的圓形塑料盆中水培生長(zhǎng)，光照強(qiáng)度200μmol·m-2·s-1和溫度28℃/22℃（14 h/10 h）（晝/夜）。每盆放置20粒種子，每2 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)?shù)?片葉片完全伸展時(shí)，幼苗分別用0、100、200、400μmol·L-1CdCl2溶液中處理72 h，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2 測(cè)定方法

將幼苗根部用水沖洗干凈后，取根、莖、葉，剪碎后微波消解儀進(jìn)行消化，用火焰原子分光光度計(jì)測(cè)定組織中Cd2+含量，生長(zhǎng)量測(cè)定用烘干稱質(zhì)量法。葉綠素含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]。葉片光合特性采用Yaxin-1102便攜式光合蒸騰儀測(cè)定，在室外對(duì)玉米第三片葉Pn、Tr、Gs和Ci測(cè)定，每天11:00—14:00進(jìn)行測(cè)定，天氣條件：晴天，室外溫度為21～23℃，每個(gè)處理選3株幼苗測(cè)定。

SOD活性、CAT活性和H2O2含量測(cè)定采用Jiang等方法[11]。H2O2組織化學(xué)染色法采用3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色法檢測(cè)[12]；GSH含量測(cè)定采用二硫代雙二硝基苯甲酸（DTNB）方法[13]，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素ANOVALSD和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果為3次獨(dú)立試驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示P＜0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘在幼苗組織中的積累

如表1所示，與對(duì)照相比，處理組根、莖和葉中Cd2+的含量極顯著增加。根中，100μmol·L-1處理組Cd2+積累量最大，但處理組間無(wú)差異。莖中，3個(gè)處理組Cd2+均低于同處理組根的積累，且隨Cd2+濃度增加，積累量增加，但組間無(wú)顯著差異。葉中，Cd2+的積累量均低于同處理組根和莖的量，400μmol·L-1處理組Cd2+的積累量最多，200μmol·L-1處理組最少。

表1 玉米幼苗根、莖、葉中Cd2+的積累（72 h）

2.2 鎘對(duì)幼苗形態(tài)和葉綠素含量的影響

如圖1-A所示，對(duì)照組幼苗生長(zhǎng)旺盛，植株挺立，葉片伸展，葉色鮮綠；100μmol·L-1Cd2+處理后葉片缺水，半數(shù)葉片下垂、皺縮，少數(shù)葉色發(fā)黃；200μmol·L-1Cd2+引起多數(shù)葉片下垂、皺縮，葉片失水嚴(yán)重，少數(shù)葉色失綠變黃；當(dāng)Cd2+濃度達(dá)到400 μmol·L-1，全部葉片都出現(xiàn)下垂、萎蔫，大多數(shù)葉色發(fā)黃，整個(gè)植株枯萎。從圖1-B可以看出，Cd2+處理顯著降低葉片中葉綠素含量，其中Cd2+濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，葉片中葉綠素含量越低；在72 h，3個(gè)處理組葉綠素含量顯著下降，分別是對(duì)照組的68%、40%、29%。由圖1-C可知，Cd2+處理后植株干物質(zhì)積累顯著下降，且濃度越高干物質(zhì)積累越少，但處理組間無(wú)差異。

圖1 Cd2+處理對(duì)玉米幼苗形態(tài)、葉綠素含量和單株干質(zhì)量的影響

2.3 鎘對(duì)幼苗葉片光合特性的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，Cd2+處理后幼苗葉片的Pn、Tr和Gs均顯著降低，同時(shí)Pn、Tr和Gs與Cd2+濃度和處理時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性，400μmol·L-1Cd2+處理72 h后Pn、Tr和Gs僅為對(duì)照的2.7%、5.8%、5.1%。葉片Ci變化趨勢(shì)與Pn、Tr和Gs的變化相反，Cd2+處理后Ci顯著增加，但無(wú)濃度和時(shí)間效應(yīng)，在400μmol·L-1Cd2+處理72 h后Ci為對(duì)照的368%。Cd2+處理引起玉米葉片氣孔降低，抑制光合作用和蒸騰作用，葉間CO2濃度升高。

表2 Cd2+處理對(duì)幼苗葉片光合特性的影響

2.4 鎘對(duì)幼苗葉片中抗氧化酶和GSH含量的影響

如圖2-A所示，與對(duì)照相比，Cd2+處理幼苗24 h后3個(gè)處理組SOD活性顯著升高，分別是對(duì)照組的167%、160%、179%；處理48 h，除低濃度組（100 μmol·L-1）持續(xù)保持高活性外，中高濃度組（200、400 μmol·L-1）SOD活性逐漸下降；當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至72 h，SOD活性全部低于對(duì)照組。由圖2-B可知，Cd2+引起葉中CAT活性先升高后降低，低濃度和中濃度處理組CAT活性在48 h達(dá)到最大值，為對(duì)照的293%、242%，72 h后活性顯著下降，中濃度組低于對(duì)照；高濃度組CAT活性在24 h到達(dá)最高，是對(duì)照的208%，之后活性顯著下降，在72 h低于對(duì)照組。由圖2-C可知，與對(duì)照相比，Cd2+處理組GSH含量均出現(xiàn)顯著降低，且Cd2+濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，GSH含量越低；在72 h，3個(gè)Cd2+處理組GSH含量分別是對(duì)照的27%、21%、19%。GSH含量與Cd2+濃度和處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性。

圖2 Cd2+處理對(duì)葉片SOD活性（A）、CAT活性（B）和GSH含量（C）的影響

2.5 鎘對(duì)葉片H2O2和MDA含量的影響

DAB與H2O2反應(yīng)形成棕色復(fù)合物，棕色復(fù)合物量與H2O2含量成正比。如圖3-A所示，對(duì)照組，只在葉的基部有少量棕色沉積物，但Cd2+處理后葉片中棕色復(fù)合物沿葉脈大量出現(xiàn)、顏色顯著加深，說(shuō)明正常生長(zhǎng)的幼苗，葉片中H2O2含量少，但Cd2+處理后，H2O2大量積累。由圖3-B可知，Cd2+處理后葉片中H2O2含量迅速增加，且Cd2+濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)，H2O2含量越多；在72 h，處理組葉片中H2O2含量分別比對(duì)照增加163%、169%、185%。從圖3-C可以看出，對(duì)照組MDA含量在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中都處于一個(gè)較低的水平，而受到Cd2+處理后葉片MDA含量明顯升高，并且具有濃度和時(shí)間效應(yīng)。

圖3 Cd2+處理對(duì)葉片中H2O2積累和MDA含量的影響

3 討論與結(jié)論

根是土壤Cd2+進(jìn)入植物的第一道屏障，它可沿著細(xì)胞壁的空隙運(yùn)輸進(jìn)入木質(zhì)部，或與膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)載體、Ca2+通道以及Zn2+/Fe2+調(diào)控蛋白ZIP家族中的ZIP8和ZIP14等）結(jié)合進(jìn)入根毛表皮細(xì)胞、或與根部分泌的小分子化合物如麥根酸等螯合通過(guò)YSL(yellow stripe like)蛋白進(jìn)入根細(xì)胞，之后借助于細(xì)胞間的胞間連絲，經(jīng)皮層、內(nèi)皮層及周鞘進(jìn)入根內(nèi)導(dǎo)管細(xì)胞[15]。高溶解性的Cd2+借助于水的流動(dòng)由地下向地上部分移動(dòng)并進(jìn)入到植物的莖和葉中。在本試驗(yàn)中急性Cd2+脅迫后大量Cd2+進(jìn)入幼苗中，積累量是對(duì)照的37～42倍，其中67%以上積累在根部，莖次之，葉中積累最少。這種Cd2+在組織中的分布特點(diǎn)與大豆植株一致，既根系吸收和固定Cd2+能力最強(qiáng)、秸稈次之、葉和果實(shí)的吸收最低[16]。水稻幼苗中Cd2+的積累同樣主要聚集在根部質(zhì)外體空間，枝條中Cd2+的量遠(yuǎn)低于根中的量。Cd2+在組織中的積累特點(diǎn)與根的結(jié)構(gòu)有極大關(guān)系，內(nèi)皮層細(xì)胞壁上凱氏帶作用導(dǎo)致質(zhì)外體大部分Cd2+與細(xì)胞壁結(jié)合滯留在根部，其次根部植物螯合素、GSH、金屬硫蛋白等含巰基物質(zhì)在根中快速積累，共質(zhì)體中大部分Cd2+與巰基結(jié)合，被限制在根部[17]。根系通過(guò)沉淀、絡(luò)合和隔離作用富集大量Cd2+，進(jìn)而減少Cd2+向地上部分的運(yùn)輸。隨著Cd2+脅迫濃度和時(shí)間的持續(xù)增加，根的負(fù)荷超載，細(xì)胞內(nèi)結(jié)合態(tài)的Cd2+含量占比開始降低，胞內(nèi)可溶性組分中Cd2+含量占比升高，Cd2+遂由根經(jīng)莖向葉中運(yùn)輸和積累[18]。

葉片是植物光合、蒸騰作用等重要生命活動(dòng)發(fā)生的主要器官，雖然葉片中Cd2+的積累較少，但葉片對(duì)Cd2+的敏感度更高。葉綠體是進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，葉綠素對(duì)光能的捕獲和傳遞是光合作用的關(guān)鍵起始，其含量是植物光合作用能力和光合器官生理狀況的重要指標(biāo)。氣孔是植物葉片與大氣進(jìn)行氣體交換和水分蒸發(fā)的主要通道，其閉合程度直接影響光合作用、蒸騰作用及植物對(duì)水分和無(wú)機(jī)鹽的吸收。葉綠素、Pn、Tr和Gs及Ci是幼苗長(zhǎng)勢(shì)和進(jìn)行產(chǎn)量影響評(píng)估的基礎(chǔ)。孫亞莉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+脅迫條件下，水稻葉片葉綠素含量、Pn、Gs、Tr和Ci均出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在本試驗(yàn)中Cd2+脅迫幼苗后，整個(gè)植株葉片低垂皺縮、葉色變黃，葉綠素含量明顯減少且干物質(zhì)積累減少；光合相關(guān)的指標(biāo)Pn、Tr和Gs都顯著下降，不及對(duì)照的10%，但與水稻幼苗不同的是Ci反向升高。與玉米表現(xiàn)一致的還有小麥，在受到Cd2+脅迫后其幼苗葉片光合色素含量、葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)指標(biāo)都出現(xiàn)下降[20]。惠俊愛(ài)等[21]報(bào)道，Cd2+影響葉綠素前體的合成，促進(jìn)更多的ROS在細(xì)胞中增加，參與葉綠素的降解，降低葉綠素含量，造成植物失綠變黃。而且Cd2+的存在影響了保衛(wèi)細(xì)胞中的K+、Ca2+等離子濃度和脫落酸，從而影響了氣孔的開關(guān)，使Gs下降、Tr降低[21]。高濃度Cd2+脅迫下葉綠素含量下降、葉綠體膜結(jié)構(gòu)破壞和類囊體的垛疊程度降低均使電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁琍SⅡ光化學(xué)效率降低[20,22]；同時(shí)葉片更通過(guò)關(guān)閉氣孔和減少CO2吸收（碳同化）從而降低了Pn來(lái)減緩植物的生長(zhǎng)速度，干物質(zhì)積累減少。由于Cd2+對(duì)Pn的高抑制率（95%以上），導(dǎo)致細(xì)胞間CO2利用效率降低，脅迫過(guò)程中呼吸速率的加快，造成細(xì)胞間CO2的累積，使胞間CO2濃度上升。

H2O2積累是重金屬毒性的主要原因之一，H2O2積累及隨后造成的氧化脅迫和細(xì)胞的損傷是Cd2+誘導(dǎo)的生物毒性之一。蠶豆和姜幼苗在受到Cd2+處理時(shí)O2·—自由基生成速率和H2O2含量顯著升高，膜脂過(guò)氧化水平加劇[8,9,23]。SOD催化O2·—自由基歧化生成O2和H2O2，CAT可將H2O2水解，2種酶前后依次作用將ROS清除。螯合肽(PCs)的合成是植物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，重金屬與PCs螯合并轉(zhuǎn)移至液泡中貯存，從而達(dá)到解毒效果。GSH是合成PCs的前體，一方面GSH本身攜帶有巰基，巰基可以和重金屬結(jié)合降低細(xì)胞毒性，或合成PCs起到解毒的功效；同時(shí)，GSH中巰基又具有抗氧化作用，可還原自由基，降低對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。高Cd2+環(huán)境中，SOD和CAT的活性表現(xiàn)及GSH含量的變化直接與細(xì)胞中H2O2積累及是否產(chǎn)生氧化脅迫相關(guān)，并最終影響個(gè)體存活。在本試驗(yàn)中對(duì)照組SOD、CAT活性和GSH含量都相對(duì)穩(wěn)定，機(jī)體處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，ROS水平低，氧化還原狀態(tài)處于動(dòng)態(tài)平衡。在Cd2+脅迫條件下SOD和CAT活性都出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，而且2種酶活性最大峰值出現(xiàn)時(shí)間與Cd2+濃度有緊密關(guān)系，低濃度組較高濃度組抗氧化酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間晚，并且峰值之后活性下降速度慢，表現(xiàn)為100μmol·L-1Cd2+脅迫組，SOD活性在48 h時(shí)達(dá)到最大，而200、400μmol·L-1Cd2+脅迫組，活性在24 h即達(dá)到峰值；CAT活性峰值出現(xiàn)的時(shí)間也隨Cd2+濃度升高由48 h（100/200μmol·L-1組）前移至24 h（400μmol·L-1組）；并且CAT活性比SOD持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，即機(jī)體在受到脅迫后SOD活性在24 h快速升高（活性提高59%～80%），48 h除低濃度組活性（提高70%）保持略有上升外，其余兩個(gè)濃度組均快速下降（-42%，-22%），而CAT活性在24 h升高（活性提高30%～100%），48 h活性進(jìn)一步上升了192%、142%、16%。機(jī)體最先啟動(dòng)SOD反應(yīng)，將O2·—自由基分解產(chǎn)生H2O2和O2；當(dāng)SOD活性最高時(shí)，機(jī)體中因SOD作用而產(chǎn)生大量H2O2，此時(shí)必須調(diào)控機(jī)體CAT活性不斷升高，才能將大量H2O2分解，實(shí)現(xiàn)降低ROS功能?？寡趸镔|(zhì)GSH含量在Cd2+脅迫后出現(xiàn)下降，并且Cd2+處理時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高GSH含量越低。這可能是Cd2+脅迫促進(jìn)還原型谷胱甘肽（GSH）轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）,激活A(yù)SA-GSH循環(huán)，在植物對(duì)Cd2+的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、累積與解毒中發(fā)揮重要作用[24]。

在正常生理情況下，植物體內(nèi)活性氧可維持于有利無(wú)害的極低水平。短時(shí)間低濃度的Cd2+脅迫過(guò)程中植物抗氧化酶活性多出現(xiàn)適應(yīng)性上升，同時(shí)抗氧化物質(zhì)對(duì)離子的螯合和協(xié)同抗氧作用可以清除因脅迫而產(chǎn)生的多余ROS，維持機(jī)體氧化平衡，保持幼苗的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。而Cd2+濃度或脅迫時(shí)間一旦超過(guò)一定閾值，抗氧化酶活性被抑制，GSH系統(tǒng)抗氧能力下降，則ROS的產(chǎn)生速率大于其清除速率，機(jī)體中ROS含量升高，造成生物大分子（如脂類物質(zhì)等）氧化損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞功能紊亂。姜對(duì)Cd2+較短期（40 d）脅迫或較低濃度Cd2+脅迫具有適應(yīng)性，但脅迫120 d或過(guò)高濃度的Cd2+脅迫嚴(yán)重?fù)p傷了姜葉片抗氧化系統(tǒng)，使活性氧代謝失調(diào)，葉片膜系統(tǒng)遭到嚴(yán)重傷害[9]。本研究顯示，正常生長(zhǎng)的玉米幼苗，葉中H2O2含量都維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平；隨著Cd2+脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，葉中H2O2含量迅速增加，且MDA含量增加也說(shuō)明ROS的積累已引發(fā)膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，造成膜結(jié)構(gòu)破壞，植物光合作用和蒸騰作用停止。因此，幼苗葉片中MDA大量生成與Cd2+積累量的升高和H2O2積累相伴出現(xiàn)，加劇了幼苗生存的危機(jī)。

玉米幼苗在受到Cd2+脅迫后，根、莖和葉中Cd2+快速積累，積累量根＞莖＞葉；Cd2+引起葉綠素含量、Pn、Tr和Gs急劇降低，Ci顯著升高，葉片萎蔫，且Cd2+濃度越高對(duì)植株的破壞力越強(qiáng)；機(jī)體抗氧化酶（SOD和CAT）及抗氧化物質(zhì)（GSH）在脅迫早期抗氧化能力增強(qiáng)，；但當(dāng)Cd2+濃度增加和脅迫持續(xù)進(jìn)行時(shí)，葉片抗氧化力下降，葉中H2O2代謝失衡，脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，葉片結(jié)構(gòu)破壞，功能喪失。