聞 丹

（靖江市生祠畜牧獸醫(yī)站，江蘇 靖江 214500）

1 玉米赤霉烯酮研究進(jìn)展

玉米赤霉烯酮由鐮刀菌屬所產(chǎn)生，是一種具有雌激素樣的代謝產(chǎn)物，它是一種非甾體雌激素類霉菌毒素，是重要農(nóng)作物的常見污染物之一。大部分地區(qū)都受到不同程度的ZEA污染，ZEA的分布遍布全球，涉及玉米、小麥、大麥、燕麥、高粱、大米等多種農(nóng)作物。它的耐熱性比較強(qiáng)，在110℃的高溫下處理1h才會(huì)被完全破壞，其結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的激素β-雌二醇相似，能和雌激素受體結(jié)合，引起動(dòng)物高雌激素癥狀。玉米赤霉烯酮的危害在臨床上最為常見的是會(huì)影響動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致動(dòng)物繁殖障礙，給畜牧業(yè)發(fā)展帶來了損失。

2 睪丸支持細(xì)胞的研究進(jìn)展

睪丸支持細(xì)胞又稱Sertoli細(xì)胞，它位于睪丸的曲細(xì)精管內(nèi)皮，支持細(xì)胞包圍著精原細(xì)胞和其他生精細(xì)胞，是與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞，其緊密連接會(huì)形成血睪屏障，保護(hù)精原細(xì)胞不遭受外界的侵?jǐn)_。Sertoli細(xì)胞也可以吞噬凋亡的生精細(xì)胞，影響精子的成熟。

3 玉米赤霉烯酮與線粒體損傷

線粒體是細(xì)胞活力、生存和死亡的調(diào)解中心，其結(jié)構(gòu)與功能異常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂。眾多研究表明ZEA具有雌激素樣活性，通過與雌激素受體結(jié)合之后，會(huì)引發(fā)各類雌激素樣作用，使得動(dòng)物生殖障礙[1]。

4 研究目的及意義

玉米赤霉烯酮會(huì)對動(dòng)物繁殖產(chǎn)生一定的影響，已經(jīng)有多位學(xué)者證實(shí)了其對雌性動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)生殖細(xì)胞凋亡、周期紊亂、早熟等現(xiàn)象。本試驗(yàn)為了探究ZEA對睪丸支持細(xì)胞線粒體損傷的影響，使用不同濃度的ZEA處理大鼠原代睪丸支持細(xì)胞24h后，分別用CCK-8法測定細(xì)胞活率，透射電鏡觀察染毒后超微結(jié)構(gòu)的損傷情況，免疫熒光法及流式細(xì)胞術(shù)檢測ZEA對線粒體的影響程度和凋亡率。這對揭示ZEA致睪丸支持細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)制具有重要意義，為進(jìn)一步研究玉米赤霉烯酮致睪丸支持細(xì)胞生殖毒性的機(jī)理提供理論依據(jù)。

5 材料與方法

5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠（16～18日齡），購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

5.2 主要試劑與儀器

DMEM/F-12 Gibco，美國

胎牛血清 Hyclone，美國

細(xì)胞凋亡雙染試劑盒 BD，德國

胰蛋白酶 Amresco，德國

Ⅱ型膠原酶、ZEA標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma，美國

FACS Aria型流式細(xì)胞儀 BD，美國

二氧化碳培養(yǎng)箱 Thermo，美國

CM-100透射電子顯微鏡 PHILIPS，荷蘭

5.3 試劑配制

（1）PBS的配制：分別稱取KH2PO4 0.5g，KCl 0.5g，Na2HPO4·12H2O 7.25g，NaCl 20g，然后用去離子水（DDW）混勻定容至500ml，配制成濃度為5%的母液并進(jìn)行過濾除菌，終濃度為1%。

（2）0.5%膠原酶溶液的配制：稱取I型膠原酶0.02g、BSA 0.04g，加入PBS混勻定容至20ml。0.22μm過濾除菌。

（3）0.25%胰蛋白酶溶液的配制：稱取胰蛋白酶 0.05g，加入PBS混勻定容至20ml，0.22μm過濾除菌。

（4）ZEA母液的配制：規(guī)格為25mg/瓶的ZEA添加785μLDMSO，溶解得到母液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.4 大鼠原代睪丸支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

處理Wistar大鼠，脫頸致死，全身浸泡消毒后腹部朝上固定于解剖板上。實(shí)驗(yàn)過程中所用器械均已高壓滅菌完成，在無菌條件下，用眼科剪剖開大鼠腹腔，于腹股溝處提拉精索取出睪丸，將睪丸在預(yù)冷無菌的PBS溶液中清洗三遍后放入培養(yǎng)皿。拉散曲細(xì)精管后置于濃度為0.25%胰蛋白酶溶液（37℃）中，水浴搖床預(yù)熱37℃將曲精細(xì)管放入其中，150r/min消化15-20min后睪丸組織碎塊成粘稠線索狀，隨后加入一體積含血清的DMFM/F-12培養(yǎng)基，800g，4 ℃離心10 min。棄去上清液，加入0.5%膠原酶溶液（37℃），密封后放于水域搖床中，37℃，150r/min消化15-20min后溶液為粘稠狀，加入等體積含血清的DMFM/F-12培養(yǎng)基終止消化，用滅菌過的100目網(wǎng)篩過濾后800g/min 4℃離心10min。離心后無血清培養(yǎng)基重懸離心三遍，接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)采取低滲法純化睪丸支持細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，滅菌預(yù)熱的PBS洗滌三次將未貼壁的睪丸間質(zhì)細(xì)胞清除，之后加入20μM Tris-Hcl（pH=7.4）處理3min，將不耐低滲的生精細(xì)胞脹破從而保留支持細(xì)胞。棄處理液，滅菌預(yù)熱PBS清洗三次，最后加入含血清的DMFM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

5.5 細(xì)胞染毒方法

將睪丸支持細(xì)胞在37℃、5 % CO2的條件下培養(yǎng)24h，用0、5、10、20μmol/L（二甲基亞砜配制）的玉米赤霉烯酮濃度染毒24h。

5.6 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

將睪丸支持細(xì)胞以1.0×106cells/ml的方式，均勻接種10ml于細(xì)胞培養(yǎng)皿（直徑10cm）中，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24h，染毒后繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集所有懸浮和貼壁細(xì)胞。800g離心10min，棄上清液后貼管壁慢慢加入預(yù)冷的2.5%戊二醛1ml，在4℃靜置過夜進(jìn)行固定。固定結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS進(jìn)行3次漂洗。用系列梯度的乙醇進(jìn)行脫水后再用丙酮除去乙醇。以1%俄酸室溫處理2h，用環(huán)氧樹脂包埋，干燥，磨片，并采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對支持細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后于透射電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

5.7 熒光探針法觀察ZEA對線粒體損傷的影響

接種細(xì)胞濃度以3.0×105個(gè)/ml于鋪有無菌蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h。不同濃度ZEA處理24h后，棄去培養(yǎng)基，加入37℃溫育的Mito-Tracker Green染液（線粒體綠色熒光探針），孵育15～45min；接著棄去染色液，加入培養(yǎng)液在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

5.8 細(xì)胞凋亡的檢測

根據(jù)AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒操作方法，檢測睪丸支持細(xì)胞凋亡的情況。將原代睪丸支持細(xì)胞以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，添加不同濃度ZEA處理細(xì)胞24h。取上清液胰酶消化，加入1ml PBS，輕吹打細(xì)胞；1500r/min離心10min。洗滌2次后收集細(xì)胞，設(shè)置成三組進(jìn)行對比，分別為空白組（未加染料）、FITC單染組、PI單染組以及雙染處理組（FITC和PI）。加入染料組之后，在室溫避光的環(huán)境下孵育30min后以1×l0Loading buffer 500μL重懸細(xì)胞，200目尼龍網(wǎng)過濾，每組處理三次重復(fù)。1h之內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測分析，每組檢測104個(gè)細(xì)胞。

6 結(jié)果

6.1 ZEA染毒濃度的確定

使用不同濃度ZEA（0、5、10、20、40 μM）作用于睪丸支持細(xì)胞24h，采用CCK-8法測得，各組細(xì)胞活率會(huì)隨著ZEA染毒濃度升高而降低。當(dāng)ZEA濃度為40μM時(shí)細(xì)胞活率低于半數(shù)致死量。

6.2 ZEA對睪丸支持細(xì)胞線粒體損傷的觀察

不同濃度ZEA作用于睪丸支持細(xì)胞24h，通過投射電鏡觀察線粒體的變化。如圖1所示，對照組的線粒體完整，脊排列整齊規(guī)律；5μmol /LZEA線粒體出現(xiàn)腫脹；10μmol /LZEA線粒體腫脹現(xiàn)象加??；20μmol /LZEA組線粒體出現(xiàn)脊脫落甚至消失，線粒體腫脹增多，空泡化增多。

圖1 不同濃度ZEA對睪丸支持細(xì)胞核的影響

6.3 ZEA對睪丸支持細(xì)胞線粒體的損傷

采用Mito-Tracker Green法檢測線粒體ZEA對線粒體的影響。結(jié)果顯示與對照組相比，染毒組（5、10、20μmol/L）熒光表達(dá)呈極顯著升高。

6.4 ZEA對睪丸支持細(xì)胞凋亡的影響

運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測睪丸支持細(xì)胞的凋亡率。如圖2顯示，染毒濃度的增加使得睪丸支持細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡數(shù)量呈上升趨勢，在20μM濃度ZEA作用下凋亡率呈最高值。

圖2 ZEA對睪丸支持細(xì)胞凋亡水平

7 討論

近年來，有大量研究和實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ZEA能夠?qū)е滦坌陨臣?xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞死亡[2]，影響精子的正常發(fā)生。ZEA能夠影響雄性小鼠的精子參數(shù)，降低繁殖能力，改變內(nèi)分泌腺的重量和抑制間質(zhì)細(xì)胞中睪酮的合成[3]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度ZEA作用于睪丸支持細(xì)胞24h，通過CCK-8法測得40μM時(shí)細(xì)胞存活率低于半數(shù)致死量，證明ZEA在高濃度下明顯抑制睪丸支持細(xì)胞的生長，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。采用投射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著ZEA暴露濃度升高，大鼠原代睪丸支持細(xì)胞出現(xiàn)線粒體脊腫脹、脫落甚至空泡化等超微結(jié)構(gòu)的變化，說明ZEA可導(dǎo)致睪丸支持細(xì)胞線粒體損傷。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)ZEA染毒組的細(xì)胞凋亡率呈極顯著升高，說明了ZEA可致睪丸支持細(xì)胞線粒體發(fā)生凋亡，具體的凋亡途徑及機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。