阮音音，孫海，吳虎平，錢(qián)佳奇，梁浩，嚴(yán)光玉，張亞玉,3※

[1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；3.吉林省中藥材種植（養(yǎng)殖）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130112；4.瓦屋山藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川 眉山 620365]

雅連是毛茛科多年生植物三角葉黃連（Coptis deltoidea）的干燥根莖，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，一般用于濕熱痞滿、嘔吐吞酸及消渴等癥狀[1]，在治療糖尿病及消渴癥方面有突出優(yōu)勢(shì)。雅連是最早有記載的黃連商品藥材，可以追溯到西漢時(shí)期[2]，在明清時(shí)代甚至是川渝地區(qū)上貢的貢品[3]，是歷史上公認(rèn)的優(yōu)良黃連藥材，留有大量方劑傳世，是值得傳承的優(yōu)良中藥材。2012年，雅連成為地理標(biāo)志產(chǎn)品，目前僅有四川洪雅、峨眉等少數(shù)地區(qū)有林下種植。

土壤細(xì)菌作為土壤微生物的組成部分，是森林生態(tài)系統(tǒng)的一部分，其群落多樣性與伴生樹(shù)種聯(lián)系緊密。研究表明，植物的微生物群落具有能幫助植物抑制疾病、提供營(yíng)養(yǎng)和對(duì)生物或非生物脅迫響應(yīng)等功能[4-6]。David[7]提出，植被組成及植物凋落物類(lèi)型會(huì)對(duì)土壤生物多樣性產(chǎn)生影響。在生產(chǎn)過(guò)程中，選林也是種植前的重要步驟，如果選林不當(dāng)，很可能發(fā)生爛根、枯葉等現(xiàn)象，從而造成減產(chǎn)甚至絕收。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同樹(shù)種對(duì)于雅連的生長(zhǎng)具有極大的影響作用，有些樹(shù)種下雅連的保苗較好，長(zhǎng)勢(shì)較好，產(chǎn)量較高；而有些樹(shù)種下雅連的生長(zhǎng)受到抑制，病害重，產(chǎn)量低。但目前關(guān)于雅連林下種植及土壤微生物的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究在產(chǎn)地調(diào)研的基礎(chǔ)上，對(duì)主產(chǎn)區(qū)洪雅縣雅連根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)合土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的對(duì)比分析研究，篩選適宜雅連生長(zhǎng)的土壤微生物標(biāo)志物種，探究雅連根區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的相關(guān)性，為雅連的林下種植選林、選土技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

雅連樣品的采集地點(diǎn)位于四川省眉山市洪雅縣瓦屋山鎮(zhèn)黑山村（103°9” E,29°28” N），海拔1 900 m，年降雨量1 435.5 mm，年日照1 006.1 h，年無(wú)霜期307 d，年平均氣溫16.6℃，屬中亞熱帶濕潤(rùn)氣候。采集時(shí)間為2020年9月20日，樣品全部采自同一基地內(nèi)，分別采自珙桐（Davidiainvolucrata）、少花桂（Cinnamomum pauciflorum）、貓兒屎（Decaisneainsignis）、核桃樹(shù)（Juglans regia）、楓楊（Pterocarya stenoptera）以及漆樹(shù)（Toxicodendron vernicifluum）6種樹(shù)種下的雅連及其根區(qū)土壤。

表1 雅連及土壤樣品采集點(diǎn)信息Table1 Information on sample collection points of Coptis deltoidea and soil

每個(gè)樹(shù)種樣地分別選擇3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)采集雅連3~6株。將表層枯枝落葉去除，采集0~30 cm的根層土壤，采集的土壤采用四分法進(jìn)行混合。一部分裝入10 mL無(wú)菌離心管80℃進(jìn)行冷藏，用于土壤微生物測(cè)定；另一部分風(fēng)干后分別過(guò)0.85 mm及0.15 mm篩，并裝于自封袋中進(jìn)行保存，用于土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 方法

土壤有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量使用德國(guó)產(chǎn)元素分析儀Vario ELⅢ測(cè)定，其中土壤有機(jī)質(zhì)的含量為全碳含量的1.724倍；土壤全磷、速效磷含量采用鉬銻抗比色法；土壤全鉀、有效鉀使用火焰光度法測(cè)定；銨態(tài)氮及硝態(tài)氮使用氯化鉀浸提后，用AA-3流動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定（Brawn Luyy，德國(guó)）；土壤的中微量元素采用硝酸-高氯酸消化-ICP710ES法。

采用Mo Bio/QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit對(duì)土壤微生物基因組DNA進(jìn)行抽提，用16SrRNA基因V3-V4可變區(qū)引物（338F:5” -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3” ；806R:5” -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3” ）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Pyrobest DNA Polymerase,TaKaRa,DR500A）；然后進(jìn)行膠回收純化：針對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠回收，得到純化的樣本（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit,Axygen,AP-GX-500）；然后進(jìn)行各樣本定量：利用BioTek酶標(biāo)儀對(duì)各個(gè)樣品定量（BioTek Flx800酶標(biāo)儀；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit,Invitrogen,P7589）；最后采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq DNA文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide）構(gòu)建所需的上機(jī)文庫(kù)。經(jīng)過(guò)DNA雙末端修復(fù)后，在3” 端引入“A”堿基，完成接頭連接并純化連接產(chǎn)物后，富集DNA片段，驗(yàn)證、均一化并混合文庫(kù)，進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)涉及的土壤樣品DNA提取、擴(kuò)增和上機(jī)測(cè)序技術(shù)委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

使用QIIME2及R語(yǔ)言及派森諾基因云平臺(tái)對(duì)序列進(jìn)行去噪、聚類(lèi)、物種分類(lèi)學(xué)注釋、計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)、稀疏曲線、PCoA分析及NMDS分析等微生物群落多樣性組成譜分析，使用Excel2019、SPSS26和Origin2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析與可視化表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)

不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)值，見(jiàn)圖1。在有機(jī)質(zhì)含量方面，貓兒屎組的含量（196.37g/kg±53.37g/kg）顯著高于其他各樣本組。楓楊組（4.88 g/kg±0.46 g/kg）及漆樹(shù)組（4.83g/kg±0.71g/kg）的全氮含量顯著高于少花桂組（3.02 g/kg±0.47 g/kg）。少花桂組（9.12±2.28 g/kg）及楓楊組（9.12 g/kg±6.19 g/kg）的土壤全磷含量顯著高于其他各樣本組，且少花桂組（13.56g/kg±3.22g/kg）的土壤全鉀含量也顯著高于其他各樹(shù)種組。

圖1 不同樹(shù)種下雅連土壤大量元素含量Fig.1 Content of mass elements in soil under different tree species

不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤的中微量元素含量（表2）可知，土壤中金屬元素鈣、銅、鐵、錳、鎂、鈉、鋅、鋁等在各樣本組間均存在顯著差異性。綜合看來(lái)，漆樹(shù)組的土壤中微量元素含量屬于較低水平。

表2 不同樹(shù)種下雅連土壤中微量元素含量Table 2 Soil medium and trace elements content under different tree species mg/kg

2.2 不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤16S測(cè)序數(shù)據(jù)的基本分析

對(duì)土壤樣本16S測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行分析，平均每個(gè)樣品測(cè)得94 772對(duì)原始序列，去除部分低質(zhì)量序列、去噪及嵌合體后，平均獲得高質(zhì)量序列55 826條，片段長(zhǎng)度為162~441 bp，集中分布在405~432 bp區(qū)間內(nèi)。對(duì)所有樣品所得結(jié)果在97%的相似水平下進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，一共得到13 005條OTU，不同樣品間的OTU數(shù)量變化范圍為709~941。OTUs物種注釋結(jié)果顯示，6個(gè)樣本組中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中包含40門(mén)108綱268目481科1 024屬2 735種。使用QIIME軟件可以獲得每個(gè)樣品于不同的分類(lèi)水平上的物種組成以及其相對(duì)分度表，對(duì)于其中豐度大于1%的細(xì)菌進(jìn)行分析可以得到不同水平下的相對(duì)豐度柱狀圖。對(duì)不同樹(shù)種間根區(qū)土壤間細(xì)菌在門(mén)、屬水平下樣品的分類(lèi)學(xué)組成進(jìn)行分析（圖2 a和圖2 b）。

在6種樹(shù)種下，門(mén)水平的前10個(gè)優(yōu)勢(shì)菌種如圖2 a所示，其中Proteobacteria（變形桿菌門(mén)）、Acidobacteria（酸桿菌門(mén)）、Actinobacteria（放線菌門(mén)）、Chloroflexi（綠屈撓菌門(mén)）4個(gè)菌門(mén)占在各組所有菌門(mén)的80%左右，是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。對(duì)各組相對(duì)豐度前10的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明酸桿菌門(mén)在少花桂組及楓楊組中的相對(duì)豐度顯著高于珙桐組及漆樹(shù)組；珙桐組的綠屈撓菌門(mén)豐度顯著高于少花桂組、楓楊組、漆樹(shù)組；貓兒屎組的Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）豐度顯著高于楓楊組；Gemmatimonadetes（芽單胞菌門(mén)）在楓楊組的豐度顯著高于珙桐組及貓兒屎組；Verrucomicrobia（疣微菌門(mén)）在漆樹(shù)組中的相對(duì)豐度最高，顯著高于其他樹(shù)種。6個(gè)樣本組相對(duì)豐度為前15的優(yōu)勢(shì)菌屬如圖2 b所示，分別為不同樣本組的各菌屬占比有明顯不同，除了酸桿菌門(mén)下的Subgroup_2及變形桿菌門(mén)下Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）的在各組中相對(duì)豐度均處于較高水平外，各組物種組成差異很大。

圖2 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌群落Fig.2 Soil bacteria community of different interplanting models under different tree species

本研究選取的Alpha多樣性指數(shù)（表3）包括Good’s coverage指數(shù)、Pielou’s evenness指數(shù)、Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)，分別說(shuō)明物種覆蓋程度、均勻度、群落豐富度及多樣性。由表4可知，所有樣品的細(xì)菌Good’s coverage指數(shù)均大于0.95，說(shuō)明該樣本測(cè)序可以比較真實(shí)的反映樣本的情況；核桃樹(shù)及漆樹(shù)組的均勻度顯著高于貓兒屎組及楓楊組；各組間豐富度不存在顯著差異，但珙桐組屬于較高水平；珙桐及核桃樹(shù)下雅連土壤細(xì)菌多樣性顯著高于貓兒屎及楓楊樹(shù)下的雅連。

表3 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌菌門(mén)相對(duì)豐度方差分析（*P＜0.05）Table 3 ANOVA on the relative abundance of soil bacterial phyla under different tree species(*P＜0.05)

表4 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)（*P＜0.05）Table 4 Alpha diversity index of soil bacteria under different tree species(*P＜0.05)

NMDS分析不受樣本距離的數(shù)值影響，僅考慮彼此之間的大小關(guān)系?；贠TU注釋結(jié)果，對(duì)不同樹(shù)種下的的微生物菌落進(jìn)行NMDS分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，其應(yīng)力值（Stress）為0.038 9，遠(yuǎn)小于0.2，這表明該NMDS分析結(jié)果可以準(zhǔn)確反映出不同樹(shù)種下的組內(nèi)菌落組成結(jié)構(gòu)的差異程度。比較各樣本組，珙桐組相比其他各組在圖中位置較遠(yuǎn)，說(shuō)明其土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他樣品組差異較大；少花桂組、貓兒屎組與楓楊組位置相對(duì)集中，其差異程度相對(duì)較小。

圖3 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌NMDS分析Fig.3 NMDS analysis diagram of soil bacteria under different tree species

利用LEfSe分析對(duì)所有分類(lèi)水平同時(shí)進(jìn)行具有顯著性的豐度差異分析，尋找不同樹(shù)種間差異顯著的標(biāo)志物種，結(jié)果見(jiàn)圖4。珙桐組的特征物種為KD4-96綱、KD4-96目、KD4-96科、Hyphomicrobiaceae科（生絲微菌科）、KD4-96屬、Pedomicrobium屬（土微菌屬）物種；核桃樹(shù)組標(biāo)志物種為SC_I_84科、SC_I_84屬；楓楊組為Pseudolabrys屬；漆樹(shù)組標(biāo)志物種包括疣微菌門(mén)、Thermoleophilia綱、Verrucomicrobiae綱（疣微菌綱）、Chthoniobacterales目、Gaiellales目、Chthoniobacteraceae科、Candidatus_udaeobacter屬。

圖4 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌LEfSe分析Fig.4 LEfSe analysis diagram of soil bacteria community under different tree species

在本研究中，使用平均豐度前20位的菌屬豐度數(shù)據(jù)繪制熱圖以比較各樣本組的物種豐度分布趨勢(shì)。由圖5可知，各樣本組的細(xì)菌群落可以被聚類(lèi)為4大組，其中第一組為楓楊組，第二組有樣本組少花桂組及貓兒屎組，第三組為珙桐組，第四組包括核桃樹(shù)及漆樹(shù)在內(nèi)，其中一二組之間物種組成相似性較高，而第四組組內(nèi)的相似程度也很高，三四組的差異主要集中在AD3、慢生根瘤菌屬這兩個(gè)能被聚類(lèi)的菌屬以及Haliangium、Candidatus_udaeobacter、Rokubacteriales、Nitrospira這4個(gè)相似菌屬上。

圖5 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌屬水平物種組成熱圖Fig.5 Heat map of species composition at the genus level of soil bacteria under different tree species

2.3 不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤微生物群落及營(yíng)養(yǎng)元素相關(guān)性

RDA冗余分析一般用于反應(yīng)微生物菌群與土壤環(huán)境各因子之間的關(guān)系，見(jiàn)表5。結(jié)果表明，雅連根區(qū)土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)中僅鋁、銅與速效鉀對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著性影響，土壤各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)對(duì)土壤細(xì)菌門(mén)群落結(jié)果的前5影響順序?yàn)殇X＞銅＞速效鉀＞硝態(tài)氮＞全鉀。對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)與豐度前15的細(xì)菌菌屬進(jìn)行Spearman分析（圖6）可知，KD4-96屬與土壤全磷、全鉀、速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與錳、鋅含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與鈉、鋁含量呈極顯著正相關(guān)；Roseiarcus屬與土壤全磷、鐵、鎂含量呈顯著正相關(guān)，與全鉀、錳、鋅含量呈極顯著正相關(guān)，與鈉含量呈顯著負(fù)相關(guān)；Rokubacteriales屬與土壤全磷、錳含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與全鉀、鐵、鎂含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；Candidatus_udaeobacter屬與土壤全鉀、鈣、鐵、鎂含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與銅、錳、鋅含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表5 不同樹(shù)種下土壤細(xì)菌群落與營(yíng)養(yǎng)元素的RDA分析Fig.5 RDA analysis of soil bacteria l community and nutrient factors under different tree species

圖6 門(mén)水平下土壤細(xì)菌相對(duì)豐度與營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)相關(guān)性（*≤0.05,**≤0.01）Fig.6 Correlation between relative abundance of soil bacteria and nutrient factors at phylum level(*≤0.05,**≤0.01)

3 討論

微生物是土壤的重要組成成分，其功能包括參與土壤結(jié)構(gòu)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、有機(jī)質(zhì)循環(huán)和毒物降解等各類(lèi)理化及生物過(guò)程，和土壤的健康以及質(zhì)量息息相關(guān)[6,8]。不同樹(shù)種下的土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)表現(xiàn)出了顯著差異，其原因可能是樹(shù)種的凋落物不同，從而影響了林下雅連根區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的補(bǔ)給[9]。研究表明，不同的樹(shù)種凋落物所含有的不同碳源和氮源會(huì)導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向進(jìn)化，進(jìn)而對(duì)土壤肥力產(chǎn)生一定的影響[10]。此外，不同樹(shù)種的根系生長(zhǎng)代謝也會(huì)影響土壤（尤其是根區(qū)土壤）的理化性質(zhì)[11,12]。從土壤各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)來(lái)看，全磷、全鉀及各金屬元素更容易影響土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，尤其是錳及鋅這兩種微量元素，與相當(dāng)一部分的優(yōu)勢(shì)菌屬都具有顯著或極顯著相關(guān)性。

6種樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和放線菌門(mén)，這與王鈺等[13]在西南地區(qū)研究結(jié)果基本一致。土壤微生物種群對(duì)于土壤的質(zhì)量和功能以及土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性發(fā)展具有十分重要的意義；在一定程度上，土壤微生物群落組成及類(lèi)型可以反映出土壤質(zhì)量的變化[14,15]。不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)較高的是珙桐組，擁有較高水平豐富度及多樣性。

疣微菌門(mén)及其門(mén)下的Candidatus_udaeobacter屬是漆樹(shù)組標(biāo)志物種，有研究表明Candidatus-udaeobacter常為多年生作物的高年限時(shí)的優(yōu)勢(shì)種群[16]，其有可能是土壤微生態(tài)失調(diào)的產(chǎn)物，而土壤微生態(tài)失調(diào)往往導(dǎo)致土壤微生物群落的單一化群落結(jié)構(gòu)明顯。核桃樹(shù)及漆樹(shù)較其他樹(shù)種而言，棒狀桿菌門(mén)Rokubacteriales處于較高水平，且漆樹(shù)下土壤細(xì)菌群落中Rokubacteriales為豐度最高的菌屬。而在番華彩等[17]對(duì)香蕉枯萎病和健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病植株中棒狀桿菌門(mén)的豐度較健康植株高，香蕉枯萎病植株中Rokubacteriales豐度和健康植株的差異顯著。目前針對(duì)雅連的病害研究較少，而作物病害的發(fā)生與植株根際土壤微生物有密切關(guān)系，主要體現(xiàn)在微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)方面[18]。對(duì)于棒狀桿菌門(mén)Rokubacteriales對(duì)作物影響的機(jī)制尚不明確，可能與病害發(fā)生有聯(lián)系，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

珙桐組的特征物種中，綠屈撓菌門(mén)的KD4-96屬占重要地位，同時(shí)，其所在的KD4-96科、KD4-96目、KD4-96綱也為珙桐組的特征物種，這說(shuō)明在珙桐組中該屬起到關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，KD4-96屬與土壤中總磷含量呈正相關(guān)關(guān)系[19]，其對(duì)磷的溶解釋放具有促進(jìn)作用[20]，且為耐金屬細(xì)菌[21]，屬于有益微生物。珙桐組雅連生長(zhǎng)狀況較好，可能與KD4-96屬的這些功能有密切關(guān)系，其影響機(jī)制需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

土壤營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成受不同樹(shù)種的影響，盡管不同樹(shù)種下雅連根區(qū)土壤相對(duì)豐度占優(yōu)勢(shì)的微生物種群改變較小，但是標(biāo)志微生物的地位存在差異。本研究中6種不同樹(shù)種下的雅連土壤樣品經(jīng)16S測(cè)序，涵蓋了40門(mén)108綱268目481科1 024屬2 735種細(xì)菌。

6種樹(shù)種下土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為變形桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)，但不同樣本組中的各優(yōu)勢(shì)菌屬差異較大，Subgroup_2屬及慢生根瘤菌屬在各樣本組中均處于較高水平，其中鋁、鋅、全磷、鎂、鐵、錳、速效鉀和鈉對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

珙桐樹(shù)下的土壤細(xì)菌群落有相對(duì)較高的豐富度及多樣性，其關(guān)鍵微生物是有益細(xì)菌綠屈撓菌門(mén)的KD4-96，而漆樹(shù)下雅連生長(zhǎng)狀況較差可能是疣微菌門(mén)Candidatus_udaeobacter及棒狀桿菌門(mén)Rokubacteriales所致。