谷昕雨，王欣媛，潘美紅，任堂君，于蕾

（哈爾濱商業(yè)大學英才學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

古方固發(fā)噴霧是由哈爾濱商業(yè)大學古方固發(fā)項目團隊自主研發(fā)的適用于白發(fā)脫發(fā)老年群體的護理保健品。隨著年齡的增長，頭發(fā)逐漸灰白、脫落。當今時代，老年人群對于頭發(fā)的保養(yǎng)護理逐漸重視，脫發(fā)白發(fā)問題急需解決。在以往對于白發(fā)的相關(guān)研究中得出氧化應激是頭發(fā)變白的起始和進展的關(guān)鍵機制，檢測到中藥何首烏提取物具有保護黑色素細胞活性免受氧化應激的能力[1]。在脫發(fā)方向的醫(yī)學研究領(lǐng)域中，何首烏的抗脫發(fā)作用已被廣泛認可。有研究數(shù)據(jù)表明，何首烏中的有效成分二苯乙烯苷具有良好的促毛發(fā)再生的作用，其機制可能與抑制p53、Fas和Bax誘導的細胞凋亡有關(guān)[2]。基于何首烏在烏發(fā)固發(fā)方面研究的有效成果，本項目確定將噴霧古方選用中國傳統(tǒng)藥材何首烏、生地黃、側(cè)柏葉和黑芝麻梗，每味藥材的配比嚴格按照古方《中醫(yī)臨床備要·基本篇》[3]。其中君藥何首烏具有補益精血、烏發(fā)固發(fā)、強健筋骨和補肝腎等功效[4]?；谏鐣夏耆后w白發(fā)脫發(fā)的困擾，本項目組展開古方固發(fā)噴霧的產(chǎn)品研發(fā)。以二苯乙烯苷含量為評價指標，旨在根據(jù)古方的特性和功效優(yōu)化噴霧的提取工藝，以期將古方固發(fā)噴霧加工成安全、規(guī)范、合理、有效的現(xiàn)代防脫固發(fā)、烏發(fā)類產(chǎn)品。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（Waters公司2695）；色譜柱（Agela Technologies公司Venusil XBP C18，250 mm 4.6 mm，5m）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（愛朗儀器有限公司N-1100）；水浴鍋（愛朗儀器有限公司GSH-2100）；電子天平（艾德姆衡器有限公司NBL 214）。

1.2 實驗材料

何首烏Polygonum multiflorum Thunb.（北京同仁堂）；生地黃Rehmannia glutinosa Libosch.（北京同仁堂）；側(cè)柏葉PLatycladus orientalis（L.）Franco.（人民同泰醫(yī)藥）；黑芝麻梗，為脂麻Sesamum indicum L.的干燥梗。二苯乙烯苷（含99.8%2,3,5,4” -四羥基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷）標準品（大連美侖科技有限公司）；乙醇（分析純），蒸餾水，甲醇（色譜純）（A456-5）（天津格里斯醫(yī)藥化學技術(shù)有限公司），乙腈（色譜純）（A955-4）（天津益仁達化工有限公司）。

2 實驗方法與結(jié)果[5-9]

2.1 溶液的配制

2.1.1 標準品溶液配制稱取二苯乙烯苷對照品0.1 mg，用色譜甲醇進行溶解并定容到1 mL棕色容量瓶中，密封儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液配制稱取何首烏3 g、生地黃3 g、側(cè)柏葉5 g、黑芝麻桿5 g，置于250 mL圓底燒瓶中，以料液比（重量體積比）1:10加入65%稀乙醇溶液，加熱回流1 h。后將所得的初步樣品液旋蒸至黏稠狀態(tài)并揮至無醇味。水浴加熱將樣品液制成浸膏狀態(tài)，稱量浸膏的重量并記錄數(shù)值，取0.05 g浸膏定容至5 mL容量瓶中，密封儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 陰性樣品溶液配制取除何首烏外的其余藥材參照“2.1.2”的方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

2.3 專屬性考察

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the test sample

圖3 陰性樣品色譜圖Fig.3 Negative sample chromatogram

2.4 線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗

2.6 重復性考察

取“2.1.1”制備的對照品溶液共6份，按照“2.2”的色譜條件連續(xù)進樣，測定二苯乙烯苷峰面積。RSD=1.35%＜2%，該數(shù)據(jù)可表明實驗方法的重復性良好。

2.7 加樣回收率考察

按照“2.1.2”中方法平行配制6份已知含量的供試品溶液，分別加入二苯乙烯苷對照品適量，按照“2.2”的色譜條件各進樣5L，測定二苯乙烯苷峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果見表1，最終所得數(shù)據(jù)表明實驗方法的準確性良好。

表1 二苯乙烯苷加樣回收率考察Table 1 Investigation of the spiked recovery of the stilbene glucoside

2.8 單因素試驗設(shè)計

2.8.1 乙醇濃度的影響將處方的藥材按照比例縮小10倍，稱取何首烏3 g、生地黃3 g、側(cè)柏葉5 g、黑芝麻梗5 g，置于圓底燒瓶中。分別配制45%、55%、65%、75%、85%的乙醇，連接回流裝置，以料液比（重量體積比）1:10加入乙醇，回流1 h后，靜置，稍冷，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱濃縮，得浸膏。稱取0.01 g浸膏，加甲醇定容至5 mL，用高效液相色譜系統(tǒng)測定二苯乙烯苷含量。以二苯乙烯苷含量為縱坐標，乙醇濃度為橫坐標，繪制曲線，見圖4。

圖4 乙醇濃度對二苯乙烯苷含量的變化趨勢Fig.4 Trends of ethanol concentration on the content of stilbene glycosides

以上結(jié)果表明，在乙醇濃度為55%的條件下，提取物中二苯乙烯苷含量較高。

2.8.2 提取時間的影響 將處方的藥材按照比例縮小10倍，準確稱取何首烏3 g、生地黃3 g、側(cè)柏葉5 g、黑芝麻梗5 g，置于圓底燒瓶中。連接回流裝置，以料液比（重量體積比）1:10加入65%的乙醇，分別回流1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h。靜置，稍冷，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱濃縮，得浸膏。稱取0.01 g浸膏，加甲醇定容至5 mL，用高效液相色譜系統(tǒng)測定二苯乙烯苷含量。以二苯乙烯苷含量為縱坐標，提取時間為橫坐標，繪制曲線見圖5。

圖5 提取時間對二苯乙烯苷含量的變化趨勢Fig.5 Trends of extraction time on the content of stilbene glycosides

以上結(jié)果表明，在加熱回流3 h的條件下，提取物中二苯乙烯苷含量較高。

2.8.3 料液比（重量體積比）的影響將處方的藥材按照比例縮小10倍，準確稱取何首烏3g、生地黃3g、側(cè)柏葉5 g、黑芝麻梗5 g，置于圓底燒瓶中。連接回流裝置，分別以1:5、1:10、1:15、1:20、1:25的料液比（重量體積比）加入65%的乙醇，回流1 h后，靜置，稍冷，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱濃縮，做成浸膏。精密稱取0.01 g浸膏，加甲醇定容至5 mL，用高效液相色譜系統(tǒng)測定二苯乙烯苷含量。以二苯乙烯苷含量為縱坐標，乙醇用量為橫坐標，繪制曲線見圖6。

圖6 料液比（重量體積比）對二苯乙烯苷含量的變化趨勢Fig.6 Trends of material-liquid ratio(weight to volume ratio)on the content of stilbene glycosides

以上結(jié)果表明，在料液比（重量體積比）1:10的條件下，提取物中二苯乙烯苷含量最高。

2.9 正交試驗

為進一步分析各因素對提取結(jié)果的影響，優(yōu)化提取工藝，則需要進行正交實驗[10,11]。在單因素的基礎(chǔ)上，采用L9(33)正交實驗，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）和料液比（重量體積比）（C）作為考察因素，每個因素選擇3個水平進行實驗，各因素水平表見表2，D列設(shè)置為空白對照，以二苯乙烯苷含量為評價指標，對實驗結(jié)果進行直觀分析和誤差分析，實驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4分析可得，因素A、B、C對結(jié)果均有顯著影響，且各單因素對二苯乙烯苷含量的影響程度由大到小依次為A＞C＞B，即乙醇濃度對其影響最大，料液比（重量體積比）和提取時間次之。綜合分析結(jié)果，從降低成本可得最佳提取條件為A2B3C1，即5倍量濃度為55%的乙醇，回流提取2.5 h。

2.10 驗證實驗

稱取何首烏3 g、生地黃3 g、側(cè)柏葉5 g、黑芝麻梗5 g，按照正交實驗所得最佳提取條件平行實驗3次，所得二苯乙烯苷含量平均值為14.2 mg/g。結(jié)果表明，與正交實驗結(jié)果相近，所優(yōu)化的提取工藝基本穩(wěn)定，具有可操作性，可作為古方固發(fā)噴霧的最佳提取工藝。

3 討論

古方固發(fā)噴霧研發(fā)利用現(xiàn)代的提取工藝使古方重獲新的生命，增強烏發(fā)、固發(fā)效果。何首烏作為古方中的君藥，據(jù)《本草綱目》記載，其性質(zhì)溫和，味道稍有苦澀，能夠滋補肝臟和腎臟，收斂精氣，故而可補精補血、烏發(fā)固發(fā)?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證實，二苯乙烯苷為何首烏的主要藥效成分[12,13]，故選擇二苯乙烯苷含量作為提取工藝考量指標，優(yōu)化提取工藝。

本研究經(jīng)嚴謹?shù)姆椒▽W考察建立準確合理的高效液相色譜系統(tǒng)分析方法。流動相條件選擇乙腈水（20:80）將二苯乙烯苷的分析時間控制在20 min以內(nèi)，合理提高實驗效率。回歸方程R2=0.999 1，顯示在設(shè)計范圍內(nèi)二苯乙烯苷含量測定結(jié)果與供試品中被測成分濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。該方法考察項均在規(guī)定標準范圍內(nèi)，平均加樣回收率高達98.8%，標準偏差僅0.66%。為進一步提高提取效率，研究中分析提取時間、乙醇濃度、乙醇用量3個單因素對提取效率的影響，減小極差，繪制二苯乙烯苷含量折線圖。根據(jù)圖表變化趨勢，選取合理的正交試驗范圍，進而設(shè)計因素水平表以及3因素3水平正交表考量各因素的綜合作用對于二苯乙烯苷提取效率的影響程度[14]。分析顯示，乙醇濃度對提取效率影響程度最大，料液比（重量體積比）和提取時間次之。從降低成本、節(jié)約時間的角度考慮，最終確定在乙醇濃度為55%、料液比（重量體積比）為1:5、提取時間為2.5 h的條件下獲得最高提取效率。此時二苯乙烯苷濃度達到14.2 mg/g，濃度保持在較高水平，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、有效[15]。

噴霧制劑提取工藝將會直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量與療效。本研究中，古方固發(fā)噴霧提取工藝科學、合理、效率高及重復性好，按照原始古方的配伍方法，合理改良方劑，保證其藥效發(fā)揮，有效延緩頭發(fā)變白，減少脫發(fā)癥狀。未來利用新型透皮吸收促進劑作緩釋控釋研究，結(jié)合現(xiàn)代的藥理學研究成果，進一步提高作用效果和給藥效率，并逐步揭示古方固發(fā)噴霧的作用機理，這將會給中藥固發(fā)噴霧的應用和開發(fā)帶來質(zhì)的飛躍。