肖劍偉，蔡旭，郭粉蓮，黃新民，汪榮盛

（1.深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專(zhuān)科醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東 深圳 518000；2.上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200052）

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis,OP）被定義為一種全身性骨骼疾病，其特征是骨量、強(qiáng)度和微結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性損害，從而增加了脆性骨折的發(fā)生率[1]。調(diào)查顯示，我國(guó)絕經(jīng)后的女性，OP的患病率為48%[2]。骨質(zhì)疏松癥的治療方式包括生活方式措施和藥物治療。生活方式包括改變飲食結(jié)構(gòu)、補(bǔ)充礦物質(zhì)和鍛煉等。而藥物治療最常用的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物包括雙膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、唑來(lái)膦酸、地諾舒單抗和甲狀旁腺激素（PTH）衍生的藥物以及激素替代藥物等。然而，由于部分藥物存在較多不良反應(yīng)限制了藥物的長(zhǎng)期使用。

鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種非凋亡的與脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)的細(xì)胞死亡的形式[3]，大量研究顯示其參與了神經(jīng)系統(tǒng)、癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[4,5]。對(duì)鐵死亡通路相關(guān)靶點(diǎn)的調(diào)控有望成為治療疾病的一種新策略。

中藥中含有豐富的天然化合物，其在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性方面也表現(xiàn)出豐富的多樣性，并且毒性更小。因此，使用中藥治療骨質(zhì)疏松成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。在大量治療骨質(zhì)疏松的中藥中，牛膝味苦，性平，歸肝腎經(jīng)，具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎等功效，十分適合治療以“腎虛”“脾虛”為病機(jī)的骨質(zhì)疏松。研究顯示，用牛膝提取物對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠治療后，治療組的骨密度（Bone mineral density,BMD）較對(duì)照組均有所提升，提示牛膝的活性成分能提升去勢(shì)大鼠的BMD[6]。而王艷等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，用牛膝治療去卵巢大鼠能夠抑制其骨量丟失，從而達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松的目的。以上結(jié)果顯示，牛膝具有的抗OP的療效，然而其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。

本研究以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，篩選出與OP發(fā)病及鐵死亡相關(guān)的關(guān)鍵基因并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)結(jié)合分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)探討牛膝通過(guò)影響鐵死亡治療OP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)檢索及數(shù)據(jù)差異基因分析

以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo） 中檢索，檢索到GSE56116、GSE2208和GSE7158共3個(gè)數(shù)據(jù)集，見(jiàn)表1。使用R軟件（V 4.04）的limma包對(duì)編碼蛋白的mRNA進(jìn)行差異分析，取adjust P＜0.05及|LogFC|值大于0.5。

表1 GEO數(shù)據(jù)集Table 1 Details of the data set

1.2 預(yù)測(cè)牛膝作用靶點(diǎn)

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）[8]檢索牛膝化學(xué)成分，將口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥40%及類(lèi)藥性（drug likeness,DL）≥0.18作為活性小分子化合物的篩選條件，將具有較高活性的化合物進(jìn)行篩選提取并將小分子化合物作用靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因名并使用Cytoscape 3.7.1軟件繪制“藥物化合物靶基因”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 鐵死亡相關(guān)基因及靶點(diǎn)獲取

通過(guò)FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)（www.zhounan.org/ferrdb）[9]，檢索鐵死亡相關(guān)基因。將上述結(jié)果與1.1、1.2步驟得到的靶點(diǎn)取交集，獲得牛膝影響OP鐵死亡途徑的潛在治療靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.4 試驗(yàn)驗(yàn)證

1.4.1 材料試驗(yàn)采用小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。ALOX12一抗（Abcam，ab168384）和二抗、GPX4一抗和二抗（Abcam，ab125066）；內(nèi)參-actin（CST，#4970）。瓊脂糖凝膠（Solarbio，P1200）。BioTraceTMNT硝酸纖維素膜（Millipore，IPVH00010）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（GIBCO，12430054、10100147、12605036）；黃芩素（Sigma-Aldrich，491-67-8）、MTT試劑（Sigma-Aldrich，CT02）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，C6164）、核因子-B受體活化因子配基（receptor activator of NF-B ligand,RANKL）（Sigma-Aldrich，207621-35-0）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophagecolonystimulating factor,M-CSF）（Sigma-Aldrich，SRP3221）和青鏈霉素（sigma-Aldrich,P4333）。

1.4.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot,WB）檢測(cè)潛在治療靶點(diǎn)根據(jù)上述步驟得到的差異基因ALOX12，通過(guò)WB驗(yàn)證其在OP患者中的表達(dá)情況。選取福田區(qū)風(fēng)濕病專(zhuān)科醫(yī)院風(fēng)濕免疫科符合《中國(guó)老年骨質(zhì)疏松癥診療指南(2018)》OP診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并有惡性腫瘤、近6個(gè)月內(nèi)服用過(guò)激素類(lèi)藥物以及嚴(yán)重肝腎功能障礙的患者，共納入2020年4~6月確診的OP患者4例，其中男性2例、女性2例，年齡52~65歲，平均（58.8±5.4）歲。按照OP患者性別、年齡比例選擇4名深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專(zhuān)科區(qū)院體檢健康者作為對(duì)照組，其中男性2名、女性2名，年齡50~63歲，平均（57.3±5.9）歲。2組之間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.757，P=0.624）。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（倫理審查編號(hào)FS202001012），研究對(duì)象均自愿參與，簽署知情協(xié)議書(shū)。ALOX12一抗和二抗（Abcam，ab168384）；內(nèi)參-actin（CST，#4970）。瓊脂糖凝膠（Solarbio，P1200）。BioTraceTMNT硝酸纖維素膜為美國(guó)（Millipore，IPVH00010）產(chǎn)品。

抽取靜脈血5 mL，樣本加入5 mL已經(jīng)混有苯甲基磺酰氟（PMSF）的蛋白裂解液（每1 mL裂解液加入10L PMSF）進(jìn)行蛋白定量。取適量的蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），室溫?fù)u動(dòng)封閉1 h。將膜按一抗蛋白和-actin蛋白的印跡位置剪開(kāi)，置于含對(duì)應(yīng)一抗的Blotto溶液中，4℃搖動(dòng)作用過(guò)夜。TBST溶液中搖動(dòng)漂洗后加入二抗室溫作用，搖動(dòng)漂洗后將膜置于Western LightningTMChemiluminescence Reagent顯色劑中1 min。常規(guī)曝光后進(jìn)行顯影、定影處理。以-actin為內(nèi)參，使用Image J（V 1.8.0）軟件分析各條帶灰度值與內(nèi)參的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 WB檢測(cè)黃芩素對(duì)RAW264.7細(xì)胞GPX4、ALOX12表達(dá)的影響RAW264.7細(xì)胞在含有100U/mL青霉素和100g/mL鏈霉素、10%FBS、10%M-CSF、10%RANKL的DMEM中培養(yǎng)，并置于溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中。黃芩素用微量的DMSO溶液溶解，然后用DMEM培養(yǎng)基將黃芩素溶液稀釋至試驗(yàn)所需濃度，使DMSO的最終濃度不超0.1%。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，常規(guī)消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至1 104個(gè)/孔，接種到96孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合度時(shí)，根據(jù)既往文獻(xiàn)黃芩素體外使用配制濃度報(bào)告[10]，將試驗(yàn)空白對(duì)照組及不同濃度的黃芩素組（5mol/L、10mol/L和20mol/L）處理48 h。

收集上述各組細(xì)胞用裂解液提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行蛋白定量。取適量的蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），室溫?fù)u動(dòng)封閉1 h。將膜按一抗蛋白和-actin蛋白的印跡位置剪開(kāi)，置于含對(duì)應(yīng)一抗的Blotto溶液中，4℃搖動(dòng)作用過(guò)夜。TBST溶液中搖動(dòng)漂洗后加入二抗室溫作用，搖動(dòng)漂洗后將膜置于WesternLightningTMChemiluminescence Reagent顯色劑中1 min。常規(guī)曝光后進(jìn)行顯影、定影處理。以-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件分析計(jì)算GPX4及ALOX12蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.5 分子對(duì)接

明確ALOX12在OP患者中的表達(dá)情況后，通過(guò)RCSB網(wǎng)站檢索得到靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取中藥活性小分子結(jié)構(gòu)，使用AutoDock Vina對(duì)蛋白及小分子進(jìn)行半柔性對(duì)接，選取結(jié)合能最小的結(jié)果作為最佳配體。

1.6 分子動(dòng)力學(xué)

使用Gromacs進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬[11]。通過(guò)ATB網(wǎng)站（atb.uq.edu.au/）[12]生成配體小分子位置限制文件。通過(guò)Gromacs內(nèi)置命令將小分子及靶蛋白轉(zhuǎn)換為拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)文件。使用Gromos54a7_atb力場(chǎng)及SPC水分子模型，創(chuàng)建大小為1.2的十二面體水盒子并加入6個(gè)鈉離子來(lái)中和系統(tǒng)電荷。采用最速下降法使系統(tǒng)能量最小化。使用V-rescale進(jìn)行步長(zhǎng)為2 fs，總時(shí)間長(zhǎng)為100 ps的NVT系綜平衡，然后使用Berendsen算法在1 atm壓力下進(jìn)行100 ps的NPT系綜平衡。對(duì)蛋白質(zhì)中的重原子（非氫原子）施加位置限制后進(jìn)行總時(shí)長(zhǎng)為20 ns的動(dòng)力學(xué)模擬，步長(zhǎng)設(shè)定為2 fs。根據(jù)模擬得到的結(jié)果在去除體系的周期性邊界后提取20 ns時(shí)的結(jié)構(gòu)作為最終復(fù)合物構(gòu)象。使用Gromacs內(nèi)置命令計(jì)算復(fù)合物的均方根偏差（rootmeansquaredeviation,RMSD）、溶劑可及表面（solvent accessible surface area,SASA）、蛋白回旋半徑（Gyrate,GR）和氫鍵。使用g_mmpbsa軟件處理GROMACS生成的結(jié)構(gòu)（.tpr）和軌跡（.xtc）文件，并計(jì)算小分子與蛋白的結(jié)合自由能[13]。使用VMD[14]、PyMOL[15]、LigPlot+軟件[16]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用R軟件（V 4.04）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床樣本的蛋白表達(dá)水平使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異分析結(jié)果

結(jié)果顯示與正常組對(duì)比，GSE56116有760個(gè)mRNA存在表達(dá)差異，其中上調(diào)295個(gè)，下調(diào)465個(gè)；GSE2208有114個(gè)mRNA存在表達(dá)差異，其中上調(diào)78個(gè)，下調(diào)36個(gè)；GSE7158有276個(gè)mRNA存在表達(dá)差異，其中上調(diào)152個(gè)，下調(diào)124個(gè)。

2.2 牛膝作用靶點(diǎn)

經(jīng)過(guò)篩選后得到牛膝有效成分9個(gè)。9個(gè)有效成分的作用靶點(diǎn)共106個(gè)，將其轉(zhuǎn)化為官方基因名（Gene Symbol）。使用Cytoscape 3.7.1將藥物、化合物和靶基因繪制“藥物化合物靶基因”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。該互作網(wǎng)絡(luò)包含了116個(gè)節(jié)點(diǎn)和222條邊。

圖1 “藥物 化合物 靶基因”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1” Drug compound target gene” interaction network

2.3 牛膝治療OP靶點(diǎn)

根據(jù)1.3步驟獲得鐵死亡相關(guān)基因97個(gè)，與2.1、2.2步驟所得結(jié)果取交集（圖2），得到潛在通過(guò)影響鐵死亡治療OP的的靶基因1個(gè)（ALOX12）。

圖2 GSE56116、GSE22085、GSE7158、鐵死亡相關(guān)基因及牛膝作用靶基因交集的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection genes among the GSE56116,GSE22085,GSE7158,ferroptosis-associated genes and target genes of Achyranthes bidentata

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果以-actin為內(nèi)參，在OP患者全血中，與對(duì)照組相比，ALOX12蛋白表達(dá)明顯上升（正常組：0.63±0.17，OP組：0.99±0.34，t=19.38，P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 WB結(jié)果顯示OP組患者的ALOX12蛋白表達(dá)水平升高Fig.3 WB results showed the levels of ALOX12 protein expression increased in the OP group

2.4.2 黃芩素干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞GPX4、ALOX12表達(dá)結(jié)果與對(duì)照組比較，不同濃度的黃芩素組RAW264.7細(xì)胞中ALOX12的蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。而GPX4蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，表明黃芩素能抑制RAW264.7細(xì)胞中ALOX12的表達(dá)，而對(duì)GPX4蛋白表達(dá)無(wú)影響。

圖4 不同濃度黃芩素處理后對(duì)RAW264.7細(xì)胞GPX4、ALOX12表達(dá)的影響（**<0.001）Fig.4 Effects of different concentrations of baicalein on the expression of GPX4 and ALOX12 in RAW264.7 cells（**<0.001）

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

根據(jù)2.2及2.3步驟篩選得到小分子化合物黃芩素（baicalein）作用的靶點(diǎn)及鐵死亡相關(guān)基因ALOX12。分子對(duì)接結(jié)果顯示，黃芩素與ALOX12的Arg189、His365形成氫鍵，與Leu366、Thr396、Glu369、Asn400、Thr662、Leu193和Val190形成疏水鍵，提示黃芩素與ALOX12有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可能通過(guò)與其結(jié)合后抑制ALOX12活性，見(jiàn)圖5 A。

圖5 分子對(duì)接結(jié)果Fig.5 Molecular docking results

2.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

黃芩素與ALOX12的復(fù)合體在整個(gè)動(dòng)力學(xué)運(yùn)行過(guò)程中逐漸穩(wěn)定，RMSD波動(dòng)值小于0.1 nm（圖6 A）。復(fù)合物的溶劑可及表面呈逐漸縮小趨勢(shì)（圖6 B），復(fù)合物體系的蛋白回旋半徑（Rg）在模擬的過(guò)程中也逐漸縮?。▓D6 C），提示蛋白與小分子結(jié)合后蛋白逐漸收斂并使得結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。復(fù)合物體系氫鍵數(shù)量隨著模擬時(shí)間變化仍保持2個(gè)以上的連接（圖6 D），同時(shí)，與模擬前結(jié)構(gòu)，活性小分子對(duì)比位置無(wú)明顯變化，提示兩者結(jié)合穩(wěn)定（圖5 B）。

圖6 蛋白小分子復(fù)合物體系的RMSD、SASA、RG和氫鍵數(shù)量Fig.6 RMSD,SASA,RG and number of hydrogen bonds of protein-small molecule complex systems

結(jié)合能計(jì)算結(jié)果顯示，黃芩素與ALOX12的總結(jié)合自由能為（107.893kJ/mol±16.671kJ/mol）。結(jié)果顯示，黃芩素與ALOX12主要通過(guò)范德華力（154.481kJ/mol±10.798 kJ/mol）和靜電勢(shì)能（68.847 kJ/mol±11.810 kJ/mol），而極性溶劑化作用則對(duì)結(jié)合起抑制作用（101.368 kJ/mol±19.941 kJ/mol）。

3 討論

在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的各種原因中，骨穩(wěn)態(tài)的破壞是其發(fā)病的關(guān)鍵即由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成減少和由破骨細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的骨破壞增加，而鐵死亡在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。鐵死亡的特征包括細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載和活性氧類(lèi)（Reactive oxygen species,ROS）的大量堆積。而既往研究發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)載和氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要因素之一，高度提示鐵死亡參與了骨質(zhì)疏松的發(fā)病過(guò)程。骨質(zhì)疏松癥患者存在明顯的鐵過(guò)載[17]，其通過(guò)氧化應(yīng)激損傷促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展[18]。研究顯示，鐵過(guò)載可影響成骨細(xì)胞的分化和活性[19]，并且可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自噬和凋亡[20,21]，而使用降低鐵過(guò)載的藥物可以改善骨質(zhì)疏松情況[22]。在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，過(guò)載的ROS作為誘導(dǎo)鐵死亡模式啟動(dòng)的重要因素。ROS在大多數(shù)情況可以被機(jī)體內(nèi)抗氧化酶清除。鐵超載可通過(guò)Fenton反應(yīng)導(dǎo)致ROS形成增多[23]。ROS參與了成骨細(xì)胞的分化，過(guò)多ROS生成使正常的骨重建過(guò)程發(fā)生異常，使得骨形成減少而骨吸收增加，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[24,25]，降低ROS水平能夠抑制破骨細(xì)胞分化[26]。另一個(gè)報(bào)道顯示[27]，在去卵巢小鼠中，降低ROS水平可以抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生從而阻止雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松。試驗(yàn)顯示在卵巢切除術(shù)后小鼠中，Loureirin B可通過(guò)抑制ROS活性來(lái)抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生從而防止小鼠的骨丟失，進(jìn)一步證實(shí)了ROS在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用[28]。YANG等[29]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，其通過(guò)抑制鐵蛋白吞噬作用依賴(lài)的鐵死亡，外泌體逆轉(zhuǎn)了糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞對(duì)成骨的抑制作用。以上多個(gè)研究結(jié)果表明，鐵離子和氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松過(guò)程中具有重要的作用。而由鐵介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的鐵死亡是近來(lái)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式，由鐵離子介導(dǎo)的鐵死亡可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生及病情進(jìn)展。調(diào)控鐵死亡相關(guān)的靶點(diǎn)有望成為治療骨質(zhì)疏松潛在手段。

鐵死亡作為一種由鐵過(guò)載和脂質(zhì)過(guò)氧化驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞死亡方式，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物出現(xiàn)代謝障礙，在鐵離子催化作用下發(fā)生代謝異常，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。鐵死亡有明顯區(qū)別于細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，如線(xiàn)粒體膜破裂增加。脂質(zhì)過(guò)氧化作為一種自由基驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，主要影響細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸。脂質(zhì)合成代謝失調(diào)會(huì)導(dǎo)致大量多不飽和脂肪酸積累，同時(shí)會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH），導(dǎo)致更多的過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)生，從而提高了細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性。其中，多不飽和脂肪酸（PUFA）的氧化是由脂氧合酶（ALOXs）途徑介導(dǎo)的。LOXs是一種非血紅蛋白含鐵酶，主要功能是過(guò)氧化不飽和脂肪酸[30]。人類(lèi)LOX家族共有6個(gè)成員（ALXOE3、ALOX5、ALOX12B、ALXO12、ALOX15B和ALOX15）。在鐵死亡途徑中，鐵可以增加LOXs的活性，隨后LOXs通過(guò)介導(dǎo)PUFA過(guò)氧化產(chǎn)生花生四烯酸等，促進(jìn)鐵死亡。其中，ALOX12可以直接過(guò)氧化細(xì)胞膜上的磷脂形成磷脂過(guò)氧化物，然后在亞鐵離子的催化下，脂質(zhì)過(guò)氧化物與其他脂質(zhì)發(fā)生鏈?zhǔn)窖趸磻?yīng)，導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[31]。多個(gè)研究顯示，ALOX12的多態(tài)性與骨質(zhì)疏松發(fā)病呈正相關(guān)[32,33]，提示ALOX12與骨質(zhì)疏松存在密切關(guān)系。一項(xiàng)研究顯示，黃芩素能夠與鐵結(jié)合，抑制血小板中ALOX12的表達(dá)[34]。Dai等[35]發(fā)現(xiàn)，黃芩素能夠抑制ALOX12，減少鐵死亡，從而改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。Bo Chu等[36]通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)來(lái)生成敲除ALOX12的U2OS細(xì)胞的亞克隆，敲除了ALOX12基因的U2OS細(xì)胞鐵死亡受到抑制。由此可推斷，ALOX12是黃芩素的作用靶點(diǎn)之一，通過(guò)靶向ALOX12抑制其活性，可以影響鐵死亡過(guò)程，見(jiàn)圖7。

圖7 牛膝治療OP的機(jī)制圖Fig.7 Mechanism diagram of Achyranthes bidentata for the treatment of OP

祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)根據(jù)OP的表現(xiàn)將其歸屬于“骨痹”、“骨痿”和“骨枯”等病范疇。腎藏精，精血養(yǎng)骨髓，髓枯則筋痿，腎虛能夠誘發(fā)骨質(zhì)疏松。從西醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，骨髓干細(xì)胞能夠分化為成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞。鐵死亡會(huì)導(dǎo)致炎癥水平升高，產(chǎn)生的各種炎癥因子如腫瘤壞死因子-等，能夠抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的生物效應(yīng)，使骨形成減少導(dǎo)致骨量丟失，這與中醫(yī)腎虛導(dǎo)致的“骨枯”具有異曲同工之處。姚新苗認(rèn)為OP多屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛責(zé)于脾腎而標(biāo)實(shí)責(zé)于瘀血，在運(yùn)用補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣治療的同時(shí)應(yīng)當(dāng)輔以活血化瘀之藥，常選用赤芍、川芎、丹參和牛膝等[37]。陳雯等歸納中藥治療骨質(zhì)疏松用藥頻次，活血化瘀藥作為重要治法，在活血兼有養(yǎng)血功能的中藥處方中，當(dāng)歸使用頻次為44次，骨碎補(bǔ)使用頻次為28次，牛膝使用頻次為26次，排在活血化瘀藥物的前三位[38]，提示牛膝在治療OP中有著廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)代研究證實(shí)，牛膝及含有牛膝的復(fù)方藥物治療骨質(zhì)疏松療效明確，如含有牛膝的左歸丸、無(wú)敵丹膠囊具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓的作用，在臨床已被證實(shí)能夠改善OP患者癥狀[39,40]。牛膝含有大量的活性小分子成分，其中作為有效成分的黃芩素具有抗炎抗氧化作用[41]。研究顯示黃芩素可以抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成以及抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能[10]，提示黃芩素是治療骨質(zhì)疏松的潛在藥物分子。

本研究顯示，在OP患者中，ALOX12蛋白表達(dá)較健康組明顯升高，提示其可能參與了OP的發(fā)病。作為牛膝有效成分之一的黃芩素，通過(guò)分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，其能通過(guò)多個(gè)氫鍵及疏水鍵與ALOX12緊密對(duì)接并形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中，整個(gè)復(fù)合物體系能夠快速收斂并達(dá)到穩(wěn)態(tài)，說(shuō)明黃芩素能夠通過(guò)影響ALOX12蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性從而發(fā)揮抑制其活性的作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的黃芩素可以抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞ALOX12蛋白的表達(dá)，而不影響GPX4蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果提示ALOX12可能作為牛膝治療OP的潛在靶點(diǎn)，抑制ALOX12的活性，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。

綜上所述，本研究以生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)結(jié)合試驗(yàn)研究驗(yàn)證牛膝有效活性成分黃芩素可能通過(guò)靶向ALOX12影響OP鐵死亡途徑從而達(dá)到治療OP的作用，初步闡明了牛膝有效活性成分治療OP的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討牛膝通過(guò)鐵死亡途徑治療OP提供了理論依據(jù)。然而，本研究的結(jié)果未通過(guò)動(dòng)物模型研究證實(shí)，需要進(jìn)一步通過(guò)使用體內(nèi)外試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。