張亞南 席惠 方芳 賈政軍 龐佳倫 鄺海燕 張巍 彭瑩

1湖南省婦幼保健院（長沙 410008）；2廣州嘉檢醫(yī)學檢測有限公司（廣州 510300）

中國是出生缺陷高發(fā)的國家之一，其中先天性外生殖器畸形是一類病因復雜種類繁多的疾病，因其涉及生殖系統(tǒng)的結構和功能，對個人及家庭的影響較其他系統(tǒng)畸形可能更為嚴重［1］。因此，盡早在產(chǎn)前發(fā)現(xiàn)胎兒外生殖器發(fā)育畸形及其他相關疾病，明確病因，對準確評估其預后有著重要的臨床意義。隨著產(chǎn)前超聲診斷技術的不斷發(fā)展，胎兒泌尿系統(tǒng)畸形檢出率不斷提高，但由于胎兒外生殖器異常病因復雜，很少能在產(chǎn)前得到明確致病原因［2］，這也給產(chǎn)前診斷帶了新的挑戰(zhàn)。

外生殖器的發(fā)育因環(huán)境、遺傳、內分泌等因素使其在胚胎分化時期出現(xiàn)異常分化，表現(xiàn)出不同類型及不同程度的外生殖器畸形［3］。其中以先天性腎上腺皮質增生（congenital adrenal hyperplasia，CAH）、雄激素不敏感綜合征和性染色體異常引發(fā)的畸形最多見［4-5］。CAH 是一種常染色體隱性遺傳病，其中以位于6p21.33 的CYP21A2 基因缺陷引起的21-羥化酶缺乏癥（21-hydmxylase deficiency，21-OHD）是最常見的類型［6］，CYP21A2 基因編碼21 羥化酶，參與腎上腺激素代謝過程［7-8］。21-OHD會引起皮質醇、醛固酮合成不足，女性男性化、男性性早熟，甚至出現(xiàn)腎上腺危象［9-10］。目前21-OHD患者使用的糖皮質激素療法可能會導致非生理劑量，對健康產(chǎn)生負面后果，患有21-OHD 的女性其生育能力似乎受到了損害［11］，尤其是失鹽型女患者，發(fā)生妊娠糖尿病和剖宮產(chǎn)的風險更高［12］。長效糖皮質激素可能不太有利，尤其是地塞米松［12］。因此，早確診對預防出生缺陷具有重要意義。

本研究通過聯(lián)合運用多項產(chǎn)前診斷技術，快速準確尋找一個兩次妊娠外生殖器畸形胎兒家系的遺傳病因，為該家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了重要參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 孕婦，35 歲，G2P0。G1 于2017年因27 周超聲提示胎兒外生殖器異常引產(chǎn)，引產(chǎn)胎兒診斷為外生殖器畸形（未做遺傳學檢測）。本次自然受孕，早孕期無陰道流血，早孕期無感冒等疾病史，無不良因素接觸史，本人及家屬否認近親婚配。孕期產(chǎn)檢無特殊，未行NT 檢測，未行唐氏篩查，NIPT 檢測陰性。24 周超聲提示胎兒外生殖器異常聲像；27 周再次行超聲檢查，提示胎兒外生殖聲像失去正常形態(tài)，雙側類似于類陰囊聲像不典型。經(jīng)孕婦知情同意后于28 周行引產(chǎn)前臍血染色體核型分析，尸體解剖和病理檢查、基因檢測等檢查。

1.2 研究方法

1.2.1 臍血染色體核型分析 在超聲定位下抽取適量臍帶血肝素鈉抗凝，按照臍血染色體制備方法進行細胞培養(yǎng)、收獲及制片，G 顯帶，核型分析。常規(guī)計數(shù)20 個分裂象，分析5 個核型，異常核型時加大計數(shù)。根據(jù)人類遺傳學國際命名體制（ISCN 2020）標準對染色體核型進行命名。

1.2.2 超聲學檢查 應用GEVoluson E8 彩色多普勒超聲診斷儀對胎兒進行系統(tǒng)超聲檢查，并針對胎兒泌尿生殖器進行詳細檢查。

1.2.3 尸體解剖 對引產(chǎn)胎兒進行泌尿生殖器器官解剖。

1.2.4 CYP21A2基因檢測 采用DNA 提取試劑盒（QIAmp DNA Blood Mini kit，QIAGEN，德國）提取組織/外周血基因組DNA，進行CYP21A2 真基因長片段擴增，排除假基因CYP21A1P 同源序列（同源性高達98%）的干擾，然后將擴增產(chǎn)物進行捕獲測序，平均測序深度約為1 000 ×，參考基因組為CYP21A2（NM_000500，hg19）堿基序列，檢測點突變和小片段缺失重復。CYP21A2 基因若大片段缺失后會發(fā)生基因重組，此時會擴增出一個融合基因的RCCX 模塊（RCCX module，RP-C4-CYP21-TNX，包括CYP21A1P 的3 端、所有的C4B 和CYP21A2 的5 端，約30 kb，圖1），該模塊有3 個酶切位點，此時將CYP21A2 基因長片段擴增產(chǎn)物進行限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析，檢測胎兒組織及胎兒父母CYP21A2 基因30 kb 大片段缺失情況和驗證變異來源。若酶切后的電泳圖譜只出現(xiàn)3.7/2.5 kb 條帶，則沒有30 kb 大片段缺失；若檢測到主要條帶為3.2/2.5 kb，則存在大片段純合缺失；若酶切圖譜中有3.7/2.5 kb 條帶和3.2/2.4 kb 條帶，則存在大片段雜合缺失。樣本外送廣州嘉檢醫(yī)學檢測有限公司檢測。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準（編號：2020-S085）。該病例的樣品采集和遺傳學研究獲得患者知情同意。

圖1 典型的RCCX 模塊基因示意圖Fig.1 A schematic representation of the typical RCCX module genes

2 結果

2.1 臍血染色體核型分析結果 胎兒臍血染色體核型為46，XX，inv（9）（p11.2q13）（圖2），其父母拒絕行外周血染色體核型對照檢查。

圖2 染色體核型圖Fig.2 The karyotype of fetal cord blood cells

2.2 超聲學檢查 G1（2017年第一次妊娠）：27 周超聲提示：胎兒外生殖器失去正常聲像，未見正常的類陰囊聲像，中間可見1.46 cm 長的高回聲類陰莖聲影，前端朝下，外側見類大陰唇聲像（圖3A）。

G2（本研究中即第二次妊娠）：24 周超聲提示：外生殖聲像失去正常形態(tài)，雙側類似于類陰囊聲像，不典型，中間可見0.9 cm 長的高回聲類陰莖聲影，末端較扁，朝向肛門方向（圖3B）。27 周超聲提示：胎兒外生殖聲像失去正常形態(tài)，雙側類似于類陰囊，聲像不典型，末端較扁，朝向肛門方向（圖3C）。27 周四維超聲提示腎上腺增大（圖3D）。

圖3 兩次妊娠孕晚期胎兒外生殖器聲像圖Fig.3 Ultrasonography of the genitalia in the third trimester of two pregnancies

2.3 尸體解剖 外生殖器異常（圖4A），腎上腺增大（圖4B），胎兒其他器官未見其他明顯異常。腎上腺病理檢查提示胎兒腎上腺皮質微囊性增生（圖4C）。

圖4 胎兒尸體解剖和病檢結果Fig.4 Autopsy and medical examination of the fetus

2.4 CYP21A2 基因檢測 根據(jù)上述生理和病理檢測結果，臨床上考慮先天性腎上腺皮質增生，因此對胎兒及其父母進行CYP21A2 基因檢測。CYP21A2 基因擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析，結果提示引產(chǎn)胎兒存在30 kb 大片段純合缺失，其父母均為攜帶者（圖5）。CYP21A2 基因經(jīng)長片段PCR 擴增后進行二代測序，檢測到11個純合變異，分別為c.92C > T（p.P31L），c.293-13C > G，c.332_339del8（p.G111Vfs*21），c.518T >A（p.I173N），c.710T > A（p.I237N），c.713T > A（p.V238E），c.719T > A（p.M240K），c.844G > T（p.V282L），c.923dupT（p.L308Ffs*6）、c.955C > T（p.Q319*）和c.1069C > T（p.R357W），這些變異遺傳自胎兒的父親和母親，提示CYP21A2 基因30 kb純合缺失形成了CYP21A1P/CYP21A2 嵌合基因，從而導致CYP21A2 基因失活。CYP21A1P/CYP21A2融合基因具體9 種分型依據(jù)［13］，本例胎兒攜帶大片段純合缺失，存在p.P31L、c.293-13C > G、c.332_339del8、p.I173N、p.Q319*和p.R357W 變異，因此CYP21A1P/CYP21A2 融合基因類型是CH-8 型。

圖5 CYP21A2 基因長片段擴增產(chǎn)物進行限制性內切酶片段長度多態(tài)性檢測Fig.5 Restriction endonuclease fragment length polymorphism was detected by long fragment amplification products of CYP21A2 gene

3 討論

本研究中該家系兩次妊娠，均在孕中期超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒外生殖器異常，最終均選擇了引產(chǎn)。首先通過臍血染色體核型分析，確定胎兒染色體為46，XX，inv（9）（p11q13）；同時超聲檢查提示胎兒外生殖器畸形和腎上腺增大，尸檢結果與超聲檢查一致。鑒于以上結果顯示生殖器和腎上腺異常，臨床上考慮引產(chǎn)胎兒患有21-羥化酶缺乏癥，于是獲得家屬知情同意后進行基因測序，最終診斷胎兒為CAH 患者。21-羥化酶缺乏會導致皮質醇和醛固酮合成異常，促腎上腺皮質激素代償性分泌增加，引起腎上腺皮質增生及雄激素合成增多。21-OHD 主要因CYP21A2 基因大片段缺失和基因轉換引起［14］，目前已經(jīng)報道與21-OHD 有關的突變有1 300 多種，不同的基因突變導致不同程度21-羥化酶活性下降，引起21-OHD 不同臨床表型［15-17］，也是引起女性胎兒外生殖器男性化畸形最常見的原因。46，XX 胎兒在胚胎時期由于腎上腺源性雄激素過多，其外生殖器在胚胎6～8 周出現(xiàn)男性化改變，如陰蒂增大、陰唇融合、尿生殖竇形成［8，18］。

隨著遺傳學技術的快速發(fā)展，全外顯子測序因檢測深度大，范圍廣等優(yōu)勢已廣泛運用在臨床罕見病、疑難病中。但對于本研究所涉及的21-OHD 而言，由于其致病基因CYP21A2 存在一個與其基因序列高度同源的假基因（CYP21A1P），其外顯子和內含子的同源性分別高達98%和95%，且主要致病突變是真假基因間的高頻率的基因轉換和重排導致［7，19］，故全外顯子測序對于該病的檢測并不適用，目前常用的檢測方法是Sanger 測序聯(lián)合多重連接探針擴增（MLPA）［6，20］、設計序列特異性引物進行CYP21A2 基因擴增聯(lián)合下一代測序（NGS）進行測序［21］等方法將基因點突變、大片段缺失和重復同時檢出，避免漏診。

本文在對引產(chǎn)胎兒及其父母進行CYP21A2 基因突變檢測和分析中，采用限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)胎兒存在一個30 kb 大片段純合缺失變異，其父母均為非近親的攜帶者；同時設計引物將CYP21A2 真基因長片段擴增，檢測到胎兒存在11 個純合變異，分別為c.92C>T（p.P31L），c.293-13C > G，c.332_339del8（p.G111Vfs*21），c.518T>A（p.I173N），c.710T>A（p.I237N），c.713T >A（p.V238E），c.719T > A（p.M240K），c.844G > T（p.V282L），c.923dupT（p.L308Ffs*6）、c.955C > T（p.Q319*）和c.1069C>T（p.R357W），這些變異遺傳自胎兒的父親和母親。因此，發(fā)現(xiàn)該胎兒CYP21A2基因存在11 個純合變異是由30 kb 純合缺失相關的同源基因重組引起，且這些突變均能造成不同程度21-羥化酶活性下降，從而導致CYP21A2 基因失活。研究表明，CYP21A2 基因大片段缺失的突變類型占20%［22］，缺失范圍為從CYP21A1P 假基因3'端到CYP21A2 基因5'端，大部分突變遺傳自父母，可導致21-羥化酶活性完全喪失，是21-OHD最常見的致病基因突變之一。本研究引產(chǎn)胎兒還攜帶致病性最強的變異p.（V282L）［20］。CYP21A2不同的基因突變造成不同程度21-羥化酶活性下降，引起不同的臨床表型［23］，其中典型2l-OHD 女童的男性化程度與CYP21A2 基因變異導致的酶活性喪失程度呈正相關［24］。本研究胎兒在孕期就出現(xiàn)明顯的外生殖器異常，是因為CYP21A2 基因30 kb 大片段純合缺失造成真假基因融合，產(chǎn)生融合基因CH-8 型，嚴重損害蛋白質的結構和功能，造成21-羥化酶的酶活性極度缺乏或完全喪失［14］，導致胎兒皮質激素合成不足，增大促腎上腺素分泌，大量皮質醇前體產(chǎn)物堆積并向雄性激素轉化，最后表現(xiàn)出腎上腺增大和外生殖器異常，胎兒出生后還可能會出現(xiàn)腎上腺危象、休克和后遺癥。

本研究通過對一個兩次妊娠外生殖器畸形胎兒家系先后聯(lián)合運用臍血染色體核型分析、產(chǎn)前超聲檢查以及尸體解剖驗證，層層遞進，環(huán)環(huán)相扣，有針對性的選擇了CYP21A2 基因檢測方案。最終發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶的CYP21A2 基因突變是21-羥化酶缺乏癥的致病原因，從而明確該家系兩次妊娠外生殖器畸形胎兒的遺傳病因，為其遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供了重要依據(jù)，對降低出生缺陷、優(yōu)生優(yōu)育有重要指導意義。本研究也存在不足之處，由于基因檢測只針對CYP21A2 基因，胎兒期表型觀察有限，不排除本報道高齡產(chǎn)婦攜帶其他基因致病突變，建議夫妻生育前進行攜帶者篩查。