姚 婷，萬 明

(成都醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 核工業(yè)四一六醫(yī)院，四川 成都 610051)

自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)包括產后甲狀腺炎、慢性淋巴性甲狀腺炎等，是一種自身免疫性疾病，潛伏期較長，具有器官特異性，其發(fā)病率約為1%～2%，多發(fā)于中年、女性人群中，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。AIT是一種由T淋巴細胞介導的常見自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為甲狀腺功能減退，可能導致妊娠患者早產甚至流產，隨著病情的發(fā)展，還可能增加甲狀腺癌的發(fā)生風險，嚴重影響患者的生命健康。AIT的病因復雜，目前關于AIT的發(fā)病機制尚未完全闡明，學界普遍認為遺傳因素、環(huán)境因素、免疫功能紊亂均是導致AIT發(fā)生的重要原因[3]。目前治療AIT的方法主要包括免疫療法、激素替代療法、手術治療等，均存在一定的弊端，且療效不理想，多存在不良反應明顯、復發(fā)率較高等問題，即使能夠改善甲減病情，但無明顯的免疫調節(jié)作用[4]。因此，尋找不良反應少、安全性高、臨床療效顯著的AIT治療方法是目前臨床上亟待解決的問題。中醫(yī)療法在AIT的治療中取得了滿意的療效[5]。研究表明，補中益氣顆粒能夠明顯改善AIT模型大鼠的甲狀腺功能，療效顯著[6]。但關于補中益氣顆粒治療AIT的作用機制尚未完全闡明，蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)/雷帕霉素靶向基因(Mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路參與細胞的自噬和凋亡過程，是細胞內重要的信號轉導途徑之一，Akt/mTOR信號通路的活化影響ULK1/2、Atg13等蛋白的表達，從而發(fā)揮對細胞自噬的抑制作用。研究表明，AIT的發(fā)生發(fā)展與Akt/mTOR通路的活化抑制甲狀腺組織中細胞自噬水平密切相關。本研究旨在通過Akt/mTOR通路揭示其對實驗性自身免疫性甲狀腺炎(Experimental autoimmune thyroiditis,EAT)大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：SPF級SD雌性大鼠共40只，8周齡，體重120～140 g，由北京維通利華公司提供，動物合格證號：SYXK(京)2018-0042，于符合GB14925-2010標準的環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1周，自由攝食飲水。

1.1.2 藥品與主要試劑：補中益氣顆粒(國藥準字Z20040120)，成分包括炙黃芪、炙甘草、黨參、陳皮、當歸、柴胡、升麻、大棗、炒白術、生姜；豬甲狀腺球蛋白(pTg，武漢純度生物科技有限公司)；完全弗氏佐劑(CFA，德國默克公司)；游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、血清游離甲狀腺素(FT4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物)檢測；γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體(圣克魯斯生物技術有限公司)；總蛋白提取試劑盒(上海恒遠生物)；Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗體(美國abcam公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及EAT模型建立：將40只大鼠隨機分為空白組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組10只。采用pTg和CFA混合免疫注射聯(lián)合高碘喂養(yǎng)法制備EAT大鼠模型[7]，除空白組外，其余各組大鼠從第2周開始給予初次免疫：PBS緩沖液將pTg溶解呈1 mg/ml溶液，與CFA充分混合乳化(CFA抗原乳劑)，取0.2 ml注射于大鼠足墊部皮下；第4周開始注射CFA抗原乳劑0.2 ml加強免疫，1次/周，至第10周結束，空白組大鼠注射等體積的PBS緩沖液；實驗結束后，ELISA法測定大鼠血清中TPOAb、TGAb和TSH水平對模型進行評價，TPOAb、TGAb和TSH水平較空白組明顯升高為模型建立成功。

1.2.2 給藥：第10周后，低劑量組和高劑量組大鼠每天給予1.5 ml補中益氣湯灌胃，劑量分別為0.80、0.94 g/kg，空白組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，治療時間為2個月。

1.3 指標檢測

1.3.1 大鼠甲狀腺功能及抗體水平的測定：各組大鼠治療結束當天禁飲食12 h，經10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采血5 ml，離心獲得血清，采用ELISA法測定FT3、FT4、T3、T4、TPOAb、TGAb和TSH水平。

1.3.2 大鼠甲狀腺組織病理HE染色觀察：取各組甲狀腺組織，固定、切片、二甲苯脫蠟、透明、水化、蘇木精染色、分化、返藍、伊紅染色、順濃度梯度乙醇脫水、干燥、封片，光學顯微鏡下(×200)觀察甲狀腺組織的實質和間質。

1.3.3 甲狀腺濾泡上皮細胞自噬小體超微結構的觀察：每組隨機選取1只大鼠，取單側1 mm×1 mm×1 mm大小的甲狀腺組織，戊二醛溶液固定，PBS洗滌、固定、脫水、包埋、切片、甲苯胺藍染色，光鏡下定位，切成100 nm超薄片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡下觀察自噬小體的超微結構。

1.3.4 免疫組化分析大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、IL-4、Caspase-3表達水平：切片、水化、抗原修復、封閉，加一抗4 ℃過夜孵育，37 ℃加二抗孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。蘇木精復染，脫水，封片，光學顯微鏡下觀察。采用Image Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)圖像處理軟件檢測吸光度，分析IFN-γ、IL-4和Caspase-3的積分光密度(IOD)平均值。

1.3.5 Western blot檢測大鼠甲狀腺組織Akt/mTOR通路蛋白表達：取各組大鼠的甲狀腺組織，用無菌剪刀剪碎后加入裂解液，待組織裂解后采用離心法分離，離心條件為4 ℃，3000 r/min，10 min，用BCA試劑盒對上清液定量，SDS-PAGE分離總蛋白。然后轉膜，并用5%的脫脂牛奶密封。加一抗4 ℃過夜孵育，再與HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(1∶5000)在37 ℃孵育60 min，使用Quantity One軟件進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠甲狀腺抗體指標比較 見表1。EAT大鼠模型制備完成后，模型組大鼠血清TPOAb、TGAb、TSH水平明顯高于空白組(P<0.05)，說明造模成功。治療后，模型組大鼠上述血清甲狀腺抗體水平較空白組明顯升高(P<0.05)，低劑量組和高劑量組大鼠血清TPOAb、TGAb、TSH水平較模型組明顯降低，且高劑量組降低程度更明顯(P<0.05)。

表1 各組大鼠甲狀腺抗體指標比較(IU/ml)

2.2 各組大鼠甲狀腺功能比較 見表2。與空白組相比，模型組大鼠血清甲狀腺功能指標明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠血清甲狀腺功能指標均明顯下降(P<0.05)。

表2 各組大鼠甲狀腺功能比較

2.3 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺組織病理形態(tài)的影響 空白組大鼠甲狀腺組織未見炎性細胞浸潤，甲狀腺濾泡呈圓形或橢圓形，腔內充滿淡紅色膠質，且分布均勻，血管豐富，無纖維化病灶。模型組組織中存在大量浸潤的淋巴細胞，濾泡排列不均勻且大小各異，部分萎縮，濾泡腔內可見部分脫落上皮細胞，組織發(fā)生間質纖維化。低劑量組和高劑量組組織中散在淋巴細胞分布，纖維組織增生，濾泡腔內充滿分布均勻的淡紅色膠質，濾泡呈圓形或橢圓形(圖1)。

2.4 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞自噬小體的影響 見圖2。模型組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞中自噬小體數(shù)量(6.37±1.87)個，較空白組(18.26±2.95)個明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組(14.25±2.73)個和高劑量組(12.47±2.24)個自噬小體數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組

2.5 各組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4值比較 見表3。甲狀腺組織中免疫陽性物呈棕色，IFN-γ主要表達于甲狀腺上皮細胞的細胞核中，IL-4主要表達于甲狀腺濾泡腔內。四組大鼠甲狀腺組織中IL-4的表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組相比，模型組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ表達水平、IFN-γ/IL-4值明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ表達水平、IFN-γ/IL-4值明顯下降(P<0.05)。

表3 各組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4值比較

2.6 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺組織中Caspase-3表達的影響 見圖3。 與空白組(0.003±0.001)相比，模型組大鼠甲狀腺組織中Caspase-3蛋白的IOD值(0.007±0.001)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組(0.005±0.002)和高劑量組(0.004±0.001)大鼠Caspase-3蛋白的IOD值明顯下降(P<0.05)。

A：空白組；B：模型組；C：低劑量組；D：高劑量組

2.7 補中益氣顆粒對大鼠甲狀腺組織Akt/mTOR通路蛋白表達的影響 四組大鼠甲狀腺組織中Akt、mTOR蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與空白組相比，模型組大鼠甲狀腺組織中p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠甲狀腺組織中p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4(表4)。

圖4 Western blot分析各組甲狀腺組織中

表4 各組大鼠甲狀腺組織中Akt/mTOR通路蛋白相對表達水平的比較

3 討 論

AIT是一種由T淋巴細胞介導的常見自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為甲狀腺功能減退，可能導致妊娠患者早產甚至流產，隨著病情的發(fā)展，還可能增加甲狀腺癌的發(fā)生風險，嚴重影響患者的生命健康[8-10]。目前治療AIT的方法主要包括免疫療法、激素替代療法、手術治療等，均存在一定的弊端，且療效并不理想[11]。脾是重要的免疫器官，而免疫功能的調節(jié)是治療AIT的重要措施[12]。研究表明，AIT引起血清TPOAb、TGAb水平升高，甲狀腺組織病理結構改變、抑制甲狀腺功能等，這些指標的變化都反映了甲狀腺組織的損傷程度[13]。補中益氣顆粒常用于治療脾虛下陷等證。本研究中，經補中益氣顆粒治療后EAT大鼠毛發(fā)漸顯光澤，活動量增多，攝食量逐漸改善，體重逐漸恢復，精神狀態(tài)良好。在觀察期間，補中益氣顆粒治療后大鼠甲狀腺抗體指標TPOAb、TGAb、TSH、甲狀腺功能指標FT3、FT4、T3、T4明顯下降，甲狀腺組織病理形態(tài)明顯改善，表明補中益氣顆粒對EAT大鼠有較好的治療作用。有研究結果顯示，補中益氣顆粒能夠明顯改善AIT模型大鼠的甲狀腺功能，但具體作用機制尚未完全闡明[6]。因此，本研究探討補中益氣顆粒對EAT大鼠的保護作用機制。

Akt/mTOR信號通路參與細胞的自噬和凋亡過程，是細胞內重要的信號轉導途徑之一，Akt/mTOR信號通路的活化影響ULK1/2、Atg13等蛋白的表達，從而發(fā)揮對細胞自噬的抑制作用[14-15]。研究表明，AIT的發(fā)生發(fā)展與Akt/mTOR通路的活化抑制甲狀腺組織中細胞自噬水平密切相關[16]。阻斷Akt/mTOR通路已成為治療AIT的新思路。細胞凋亡水平的異常也參與了甲狀腺濾泡的損傷。Caspase-3在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，其蛋白表達變化反映甲狀腺組織中細胞的凋亡水平[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組較空白組的甲狀腺組織中Caspase-3、p-Akt、p-mTOR蛋白表達量明顯增加，自噬小體數(shù)量明顯減少，表明AIT的發(fā)生與細胞自噬、凋亡和Akt/mTOR信號通路的活化有關。補中益氣顆粒治療后，Caspase-3、p-Akt、p-mTOR蛋白表達明顯下降，自噬小體數(shù)量明顯增加，表明補中益氣顆粒能夠作用于Akt/mTOR通路，調節(jié)甲狀腺組織細胞自噬和凋亡水平，從而起到治療的作用。

研究表明，Akt/mTOR通路的激活與炎性細胞的浸潤和炎癥反應相關[18]。Th1和Th2細胞平衡的失調是導致AIT發(fā)病的主要原因，T淋巴細胞和特異性細胞因子在AIT的發(fā)生發(fā)展中起到了關鍵的作用[19]。當受到遺傳或環(huán)境因素的影響使甲狀腺組織出現(xiàn)T淋巴細胞浸潤，造成甲狀腺組織的破壞，誘導炎癥反應的發(fā)生，從而導致Th1和Th2細胞平衡的失調，放大了甲狀腺的自身免疫反應[20]。IFN-γ是Th1型細胞因子，IL-4是Th2型細胞因子，均是反映Th1/Th2細胞免疫應答強度的指標。張秋娥等[16]研究結果顯示，鄰苯二甲酸二異壬酯處理可通過激活Akt/mTOR信號通路，使AIT模型大鼠甲狀腺組織中IFN-γ、p-Akt、p-mTOR表達水平升高，IFN-γ/IL-4值明顯增加，加重AIT大鼠的癥狀。本研究中，模型組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ的表達水平較空白組明顯升高，IFN-γ/IL-4值明顯增加，表明Th1/Th2細胞平衡的失調參與了AIT的發(fā)生，Th1型淋巴細胞占主導地位。補中益氣顆粒治療后，低劑量組和高劑量組大鼠甲狀腺組織中IFN-γ表達水平明顯下降，IFN-γ/IL-4值明顯減小，Th1/Th2細胞平衡逐漸恢復，表明補中益氣顆?？赡芡ㄟ^降低Th1型細胞因子表達水平，恢復Th1/Th2平衡，發(fā)揮EAT大鼠的保護作用。

綜上所述，補中益氣顆粒對EAT大鼠具有保護作用，可有效改善大鼠的自身抗體水平和甲狀腺功能，恢復甲狀腺組織病理形態(tài)，降低甲狀腺組織中IFN-γ/IL-4值和Caspase-3表達水平，調節(jié)細胞凋亡和自噬，其機制可能與抑制Akt/mTOR通路的活化有關。