劉錕榮,盧 潔,秦百君,安曉霞,,李 慧,唐曦平,陳國忠

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；3.廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023；4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是一種較為多見的消化系統(tǒng)危重疾病，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率逐年升高[1]。約20%的AP患者為中度重癥及重癥，常并發(fā)有器官衰竭或胰腺和胰周組織壞死，病死率高，已成為嚴(yán)重危及國民生命和健康的重大疾病之一[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜屏障功能和完整性在AP的發(fā)病和進(jìn)展過程中有著重要的作用，腸黏膜屏障損傷后導(dǎo)致腸黏膜通透性增加可進(jìn)一步引發(fā)腸道細(xì)菌的移位，并進(jìn)一步誘發(fā)胰腺感染壞死以及多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，迫使AP向重癥進(jìn)展，而在AP中過度釋放的炎癥因子又是引起腸黏膜屏障損傷的重要因素[3-4]。因此，控制炎癥因子的過度釋放以及保護(hù)腸黏膜屏障在AP的治療中顯得尤為重要。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在AP的治療中可發(fā)揮良好的作用，且國內(nèi)指南也把中藥對AP的治療方法作為強(qiáng)推薦[1]，中醫(yī)藥在AP中的療效作用越來越受到重視。對于AP發(fā)病初期，廣西名中醫(yī)陳國忠教授結(jié)合廣西所處嶺南地帶的氣候特點(diǎn)，對臨床AP患者的發(fā)病規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，認(rèn)為該病發(fā)病以“濕”“熱”“毒”“瘀”為主要病機(jī)，邪氣阻滯導(dǎo)致腑氣不通，因此陳教授在此基礎(chǔ)上創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方清解化攻湯，在臨床上對治療AP有明確的療效[5-7]，然而其干預(yù)作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究予以驗(yàn)證。本研究擬在AP動(dòng)物模型上就清解化攻湯對模型動(dòng)物腸黏膜屏障及血清炎癥因子的干預(yù)作用予以進(jìn)一步驗(yàn)證，擬為中醫(yī)藥治療AP提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24只清潔級(jí)雄性SD大鼠，鼠齡8周，體重為(200±20)g，購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0014]，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[許可證號(hào)SYXK(桂)2019-0001]，飼養(yǎng)溫度為(22±2)℃，光照與黑暗每12 h交替進(jìn)行，動(dòng)物自由飲水和攝食并分籠喂養(yǎng)，經(jīng)過1周適應(yīng)喂養(yǎng)后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品及主要試劑 清解化攻湯(由柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、厚樸等藥物組成，專利號(hào)：ZL201811021893.2，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制作)，用藥前先將藥液濃縮成3.6 g/ml。注射用烏司他丁(國藥準(zhǔn)字H19990134)，雨蛙素(17650-98-5，上海源葉生物科技有限公司)，脂多糖(L2880，美國Sigma)，血清淀粉酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10) 及D-乳酸、內(nèi)毒素酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒為貝茵萊生物科技公司生產(chǎn)。Occludin抗體為博奧森生物生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物造模、分組及干預(yù) 采用腹腔注射雨蛙素及脂多糖進(jìn)行大鼠AP 造模，雨蛙素每次按50 μg/kg劑量注射， 1次/h，連續(xù)腹腔注射6次，最后1次注射后按10 mg/kg的劑量立即腹腔注射脂多糖。24只SD大鼠隨機(jī)分成假造模組、模型組、西藥組和中藥組，每組各6只。模型組、西藥組及中藥組按上述方法造AP模型，而假造模組則每次同時(shí)予腹腔注射與雨蛙素等量的0.9%氯化鈉溶液，1次/h，連續(xù)6次，最后1次注射后亦立即腹腔注射與脂多糖等量的0.9%氯化鈉溶液。干預(yù)上，中藥組予清解化攻湯灌胃，每次給藥劑量為9 g/kg，分別于造模完成后立即給藥以及每隔6 h給藥1次，共給藥3次；西藥組予烏司他丁尾靜脈注射，每次給藥劑量為7.5×103U/kg，分別于造模完成后立即給藥以及每隔6 h給藥1次，共給藥3次；模型組及假造模組用等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃時(shí)間和頻次同中藥組。

1.4 標(biāo)本采集 造模完成后13 h(即最后1次給藥1 h后)，以3 ml/kg劑量腹腔注射10%的水合氯醛，待成功麻醉后，開腹并經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h后以4 ℃的溫度按3000 r/min的速度離心10 min后取上清，放在-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。取回腸靠近回盲部末段10 cm處的回腸組織，一部分回腸組織立即予4%多聚甲醛固定，余回腸組織經(jīng)0.9%氯化鈉溶液沖洗后迅速放于無菌凍存管中，凍存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.5 回腸組織病理學(xué)觀察 固定胰腺和回腸組織后，予石蠟包埋，經(jīng)過切片和蘇木素伊紅(HE)染色后，通過電子光鏡查看組織切片的病理改變。

1.6 血清淀粉酶水平檢測及ELISA法檢測血清相關(guān)指標(biāo) 血清淀粉酶的檢測嚴(yán)格按照淀粉酶檢測試劑盒所述操作要求逐步進(jìn)行檢測。另外，血清TNF-α、IL-1β、IL-10、D-乳酸及內(nèi)毒素水平的檢測嚴(yán)格按照所對應(yīng)的ELISA試劑盒中說明書所述的操作方法和步驟進(jìn)行檢測。

1.7 回腸Occludin蛋白表達(dá)量檢測 采用Western blot法對回腸組織中Occludin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，從-80 ℃超低溫冰箱將回腸組織取出，剪碎、勻漿并離心后取上清液得到總蛋白，采用SDS-PAGE電泳使不同的蛋白分離，轉(zhuǎn)膜后封閉，孵育Occludin抗體予4 ℃過夜，漂洗3次后予二抗室溫孵育1 h，漂洗3次后加入ECL試劑發(fā)光，在成像儀中曝光并拍照，Image J軟件分析記錄灰度值并予以進(jìn)一步分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布并且方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；當(dāng)數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般狀態(tài)觀察 造模完成后13 h，假造模組大鼠無明顯異常表現(xiàn)，與假造模組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)明顯變差，部分大鼠出現(xiàn)緊張、煩躁和易激惹，呼吸偏快、弓背屈腹；西藥組和中藥組大鼠精神狀態(tài)稍差，部分略見緊張，偶見煩躁和易激惹，部分呼吸稍增快，偶見弓背屈腹。

2.2 大鼠回腸黏膜病理改變 見圖1。鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)，假造模組回腸黏膜絨毛完整，上皮下間隙未見明顯增寬，輕度與固有層分離，炎性細(xì)胞浸潤不明顯，偶可見固有層輕度充血。模型組回腸黏膜絨毛略不規(guī)整或破損，腸上皮下間隙稍見增寬，與固有層分離增大，局部炎性細(xì)胞浸潤增多，內(nèi)皮下及固有層充血及出血明顯增多。西藥組和中藥組黏膜破損程度相對模型組輕，腸上皮下間隙增寬不明顯，與固有層稍有分離，較模型組減輕，局部炎性細(xì)胞浸潤比模型組減輕，兩組可見內(nèi)皮下及固有層散在充血與模型組相似，但未見明顯出血，西藥組和中藥組比模型組病理改變明顯減輕。

A:假造模組；B:模型組；C:西藥組；D:中藥組

2.3 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較 見表1。與假造模組比較，模型組大鼠血淀粉酶水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均下降明顯(P<0.01)；與西藥組比較，中藥組略有下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假造模組比較，模型組血清TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；且對比西藥組，中藥組降幅更大(P<0.05)。與假造模組比較，模型組大鼠的血清IL-1β水平明顯上升(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；與西藥組比較，中藥組略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假造模組比較，模型組血清IL-10水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均有所升高(P<0.01)；與西藥組比較，中藥組增高更明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β及IL-10水平比較

2.4 各組大鼠血清D-乳酸及內(nèi)毒素水平比較 見表2。與假造模組比較，模型組大鼠血清D-乳酸水平顯著提升(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；中藥組較西藥組降幅更明顯(P<0.05)。與假造模組比較，模型組大鼠血清內(nèi)毒素水平顯著提升(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯下降(P<0.01)；中藥組較西藥組降幅更大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清D-乳酸及內(nèi)毒素水平比較(ng/ml)

2.5 各組大鼠回腸Occludin蛋白相對表達(dá)量比較 見表3(圖2)。與假造模組比較，模型組大鼠回腸黏膜組織Occludin的相對表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，西藥組及中藥組均明顯增高(P<0.01)；中藥組較西藥組增幅更大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠回腸Occludin蛋白相對表達(dá)量比較

圖2 各組大鼠回腸Occludin蛋白條帶圖

3 討 論

至今為止AP的病死率仍偏高，且國內(nèi)發(fā)病率逐年增加，然而其發(fā)病機(jī)制目前仍未完全清楚。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，AP的死亡與持續(xù)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)密切相關(guān)，而MODS、胰腺或胰周繼發(fā)性感染是引起該病死亡的關(guān)鍵因素[8-9]。腸黏膜屏障損傷是AP的主要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位并進(jìn)一步誘發(fā)胰腺組織感染、壞死和MODS以及因此使AP向重癥發(fā)展甚至導(dǎo)致死亡的重要因素[10]。而腸黏膜屏障損傷與炎癥因子的大量釋放關(guān)系密切[3-4]，且后者可引發(fā)“瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)”亦是引起SIRS和MODS發(fā)生以及使AP病情進(jìn)展的重要原因[11-12]。由此可知，對腸黏膜屏障的保護(hù)以及對炎癥因子過度釋放的調(diào)控，在預(yù)防AP往重癥發(fā)展并降低其病死率中起著非常重要的作用。烏司他丁屬于胰蛋白酶抑制劑，為治療AP的常用藥物，臨床應(yīng)用可改善患者的臨床結(jié)局[13-15]，可抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)并可改善患者腸黏膜屏障功能，減少腸內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素移位的發(fā)生[16-17]。

AP主要?dú)w屬于中醫(yī)的“腹痛”“脾心痛”“胃心痛”“胰癉”范疇，廣西名中醫(yī)陳國忠教授結(jié)合AP的發(fā)病規(guī)律以及廣西所處嶺南地帶多濕多熱的氣候環(huán)境特點(diǎn)，將AP發(fā)病主要?dú)w結(jié)于“濕”“熱”“毒”“瘀”四大關(guān)鍵病機(jī)，由于濕熱毒瘀郁滯中焦，導(dǎo)致氣機(jī)阻滯、腑氣不通，而且氣機(jī)阻滯、腑氣不通為貫穿AP早期的基本病機(jī)。因此陳教授認(rèn)為，對AP發(fā)病早期予清解化攻湯治療，以清熱解毒化濕、活血化瘀攻下為主要功效，準(zhǔn)確靶向上述關(guān)鍵病機(jī)和腑氣不通的基本病機(jī)。該方組方包括柴胡、黃芩、大黃、枳實(shí)、厚樸等藥物，在臨床治療上可有效緩解AP癥狀、保護(hù)腸黏膜屏障以及降低血清TNF-α等炎癥因子水平[5-7]。因此，本研究擬通過在AP大鼠上的實(shí)驗(yàn)研究對該方的干預(yù)作用加以驗(yàn)證。

在健康人的腸道中，在腸黏膜屏障和各種結(jié)構(gòu)的作用下，腸腔內(nèi)的細(xì)菌及其產(chǎn)物難以進(jìn)入血液循環(huán)[18]，腸黏膜屏障是抵御腸道內(nèi)細(xì)菌入侵的重要屏障。AP發(fā)生發(fā)展中多種因素作用導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，此時(shí)Occludin等腸黏膜上的緊密連接蛋白表達(dá)減少，腸道通透性增加，大量細(xì)菌及內(nèi)毒素、D-乳酸等毒素產(chǎn)物可通過腸屏障進(jìn)入血液循環(huán)[19-21]，進(jìn)而加重SIRS、引發(fā)感染及促使MODS的發(fā)生[22]，是促使AP往重癥發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[23]。而維持人體正常的腸道黏膜結(jié)構(gòu)及功能的完整性，可有效避免腸道細(xì)菌移位，從而減少繼發(fā)感染的發(fā)生[24]。本研究結(jié)果表明，清解化攻湯可減輕AP大鼠回腸黏膜的病理損傷，降低大鼠血清內(nèi)毒素及D-乳酸水平，并可增加其回腸黏膜上緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)，提示清解化攻湯對AP大鼠腸黏膜屏障損傷有較好的保護(hù)作用。

在炎癥因子方面，AP發(fā)病早期的無菌性化學(xué)性炎癥可激活多種炎癥通路，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子、趨化因子、血小板激活因子和黏附分子的表達(dá)，TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子的大量釋放，可進(jìn)一步促使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞激活并向胰腺及局部浸潤，加劇了腺體損傷和局部炎癥反應(yīng)。TNF-α及IL-1β作為促炎細(xì)胞因子，是AP發(fā)展中最密切相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，可啟動(dòng)對胰腺腺泡細(xì)胞損傷的炎癥反應(yīng)，也是介導(dǎo)更多炎性細(xì)胞因子從胰腺組織或其他組織釋放的初始因子，可進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，使局部炎癥向全身炎癥反應(yīng)發(fā)展。因此，TNF-α及IL-1β等炎癥因子與重癥AP及其并發(fā)的SIRS和MODS關(guān)系密切[25]。而抗炎細(xì)胞因子IL-10是一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可由巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌并反過來抑制這些細(xì)胞的活化，該細(xì)胞因子水平的上調(diào)，抑制TNF-α、IL-6、IL-1和IL-12等巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子的表達(dá)，還可通過抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上共刺激物和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ的表達(dá)來抑制T細(xì)胞活化[26-27]。在AP發(fā)病早期，快速產(chǎn)生大量的炎癥因子，其中以TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的大量釋放為主，引起與IL-10等抑炎細(xì)胞因子的不平衡，最終導(dǎo)致炎癥因子的瀑布級(jí)聯(lián)樣釋放、炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加重以及由局部擴(kuò)大向全身，誘發(fā)及加重SIRS甚至MODS的發(fā)生。因此，減輕炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵還在于對炎癥因子的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)清解化攻湯可降低AP大鼠血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的水平，提高血清抑炎細(xì)胞因子IL-10的水平，提示清解化攻湯對AP大鼠血清炎癥因子有明顯的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究表明清解化攻湯對AP大鼠的腸黏膜屏障有一定的保護(hù)作用，而且該方可降低血清促炎細(xì)胞因子水平，提高抑炎細(xì)胞因子水平，對AP大鼠血清炎癥因子有明顯的調(diào)控作用，可為后續(xù)進(jìn)一步對中醫(yī)藥治療AP的研究提供依據(jù)。