何亞鵬，李小龍，劉鑫，張樹林，杜迎春，李博，魏凱，鄒強軍

（北京市水生野生動植物救護中心，北京 102100）

遲鈍愛德華菌（Edwardsiella tarda,Et）是屬于腸桿菌科，愛德華菌屬的一種革蘭陰性短桿菌，目前是水產(chǎn)養(yǎng)殖中有極大危害的一種病原菌[1]。多種淡、海水魚類如鯽（Carassius auratus）、鯉（Cyprinus carpio）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、鯪（Cirrhinus molitorella）、短須裂腹魚（Schizothorax wangchiachii）、鰻鱺（Anguilla japonica）、大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）、斑點叉尾（Ictalurus punctatus）、黑鱸（Micropterus salmoides）、鰈（Pleuronichthys cornutus）、牙鲆（Paralichthys olivac-eus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）等，兩棲類動物中華鱉（Trionyx Sinensis）、大鯢（Andrias davidianus）、蠑螈（Salamandrae）等均可被感染發(fā)病。在鲆鰈魚類的規(guī)模養(yǎng)殖中，該菌危害尤甚，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失，并且危害食品安全[2-4]。遲鈍愛德華菌還可感染人類，在一定條件下引發(fā)人的胃腸炎，嚴重可致敗血癥，從尿液、糞便、血液中能分離到該菌[5]。遲鈍愛德華菌基因組中存在多個毒力基因，相關研究表明，orfA、citC、fimA、gadB、katB、mukF和ssrB基因與致病性有關，只出現(xiàn)在有毒株中。fimA基因長度為534 bp，編碼的菌毛分子質量為19.3 ku，在細菌感染中起黏附和入侵宿主作用，還有紅細胞凝集的作用[6]。

目前檢測該細菌的方法主要有細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、ELISA、膠體金免疫層析法及PCR等方法。這些方法一般費時費力，對試驗平臺要求很高，需要一些專業(yè)的設備，并且有的方法難以區(qū)分其致病性。環(huán)介導的等溫擴增技術是近年來興起的一種恒溫條件下快速檢測病原核酸的分子生物學方法，反應迅速，操作相對簡單，不需很專業(yè)的儀器設備，恒溫即可完成擴增，一般在水浴鍋中就可滿足反應條件，同時具有較高的靈敏度和特異性，特別適用于大量樣品的快速診斷。本研究針對致病性遲鈍愛德華菌的毒力基因fimA，設計3對特異性引物，優(yōu)化反應條件，建立了遲鈍愛德華菌LAMP檢測方法，對快速診斷、防控遲鈍愛德華菌病及維護公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

Bst 2.0 DNA聚合酶及Buffer緩沖液購自NEB（北京）有限公司；核酸染料SYBR Green I購自Solarbio公司；遲鈍愛德華菌、殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌等菌株由北京市水生野生動植物救護中心實驗室分離保存[7-8]。

1.2 LAMP引物設計與合成

通過對比，選取致病性遲鈍愛德華菌的fimA基因作為目標基因，使用LAMP引物設計軟件Primer Explorer V5設計LAMP引物，比較篩選，最終的序列見表1，合成引物，稀釋為20 μmol/L。

表1 fimA基因LAMP引物序列

1.3 細菌DNA的提取

按照操作步驟分別提取遲鈍愛德華菌、殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌等菌株的基因組DNA，測定其濃度，置于-80℃超低溫冰箱備用。

1.4 LAMP檢測方法的建立及優(yōu)化

建立25 μL的LAMP擴增反應體系。體系包含6條引物：F3-fimA和B3-fimA各0.5 μL，F(xiàn)IP-fimA和BIP-fimA各2 μL，LF-fimA和LB-fimA各1 μL；dNTP（10 nmol/L）2.5 μL；10×ThermoPol反應緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Triton X-100）]2.5 μL；8 U Bst 2.0 DNA聚合酶；1 μL遲鈍愛德華菌的DNA樣品（21.6 mg/L），ddH2O補齊至25 μL，混勻。相同的體系5個樣品分別在61，63，65，67，69℃恒溫水浴鍋反應35 min，隨后都轉移至80℃水浴5 min進行滅活。結束反應后，在反應管中各加入1 μL稀釋100倍的核酸染料SYBR Green I，混勻，觀察反應液顏色變化，得出結果。另取反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳條帶，選取最佳反應溫度。

1.5 LAMP特異性試驗

分別取遲鈍愛德華菌、殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌基因組DNA各1 μL為模板，其他條件不變，構建LAMP反應體系進行檢測，同時以ddH2O為模板，相同體系和條件反應作為陰性對照，觀察檢測結果，判定該方法的特異性。

1.6 LAMP靈敏性試驗

取遲鈍愛德華菌的DNA（21.6 mg/L）10倍梯度稀釋，分別以稀釋成濃度為2.16，2.16×10-1，2.16×10－2，2.16×10－3，2.16×10-4，2.16×10-5，2.16×10-6mg/L的DNA各取1 μL，分別構建LAMP體系進行反應，檢測該方法的靈敏性。

1.7 重復性試驗

利用建立的LAMP檢測方法，在不同時間，對同一陽性遲鈍愛德華菌的DNA樣品進行檢測，以驗證本方法的穩(wěn)定性。

1.8 LAMP的臨床檢測

將建立的LAMP檢測方法進行臨床應用。采集疑似患病的鯉和虹鱒樣品10份，分別采集其肝和腸道混合，研磨取上清，提取DNA，利用本試驗建立的遲鈍愛德華菌的方法進行檢測；同時參考相關文獻，利用之前已經(jīng)建立的檢測遲鈍愛德華菌的PCR方法，對這些樣品進行檢測[9]，引物PF為5′-TCAACCTGGAGCAGTGTGAG-3′，PR為5′-GCGCCT－GCAGGTTAAATATC-3′，目的片段長240 bp，電泳。觀察結果，對比分析該方法在臨床檢測上的適用性。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應溫度的優(yōu)化

結果顯示，在61、63和65℃時，擴增產(chǎn)物加入核酸染料后變?yōu)闊晒饩G色[圖1（a）]，電泳出現(xiàn)陽性的階梯狀電泳條帶[圖1（b）]；當擴增溫度為67、69℃時，反應結果為陰性；直接顯色的結果與凝膠電泳結果相符，多次重復試驗結果均一致，表明在溫度為61，63，65℃時均可以進行反應。本方法選取63℃為最佳擴增溫度。

圖1 LAMP反應條件優(yōu)化結果

2.2 LAMP特異性試驗

遲鈍愛德華菌、殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌都是水生動物常見的病原菌，感染魚類后的一些臨床癥狀如皮膚潰瘍、腹水、腸炎等有相似性，本試驗利用4種細菌和ddH2O做對照，檢測該LAMP檢測的特異性。結果顯示，遲鈍愛德華菌樣品進行LAMP擴增后，直接顯色和電泳結果為陽性；其他4種細菌及ddH2O結果為陰性[圖2（a）（b）]，說明該檢測方法特異性較好。

圖2 LAMP特異性檢測結果

2.3 LAMP靈敏性試驗

測得提取的遲鈍愛德華菌的DNA濃度為21.6 mg/L，依次進行10倍梯度稀釋，分別以2.16，2.16×10-1，2.16×10-2，2.16×10-3，2.16×10-4，2.16×10-5，2.16×10-6mg/L的遲鈍愛德華菌的DNA為模板，構建反應體系，進行反應，觀察該檢測方法的靈敏性。結果顯示，當DNA濃度為2.16×10-5~2.16 mg/L時，LAMP反應后變色，電泳結果為陽性，當2.16×10-6mg/L，LAMP反應結果為陰性[圖3（a）（b）]，說明該檢測方法可以檢測濃度不低于2.16×10-5mg/L的遲鈍愛德華菌的DNA，具有較高的靈敏度。

圖3 LAMP靈敏性試驗檢測結果

2.4 重復性試驗

相同的試驗條件下進行3次重復性試驗，結果均一致，證明該檢測方法重復性和穩(wěn)定性良好。

2.5 LAMP臨床應用檢測結果

利用本試驗建立的遲鈍愛德華菌的LAMP方法和之前已建立的遲鈍愛德華菌的PCR檢測方法對比試驗結果表明，LAMP反應后，2號、8號樣品變色，電泳結果為陽性的階梯狀條帶，樣品中檢出遲鈍愛德華菌，其他樣品檢測結果為陰性[圖4（a）（b）]，未檢測出遲鈍愛德華菌。PCR和LAMP檢測方法的結果一致，2號、8號樣品出現(xiàn)240 bp的條帶[圖4（c）]。

圖4 臨床樣品檢測結果

3 討論

從1962年Hoshina首次報道鰻鱺感染遲鈍愛德華菌開始，該菌的感染范圍不斷擴大，魚類宿主已達20余種，一些兩棲類、鳥類、哺乳類動物亦可感染，地域范圍也不斷擴展，呈全球性分布。感染愛德華菌的病魚一般表現(xiàn)為食欲不振甚至絕食，行動遲緩，腹部腫脹，剖開一般可見腹水，部分病魚的體表各個部位有不同程度的出血現(xiàn)象[10]。由遲鈍愛德華菌所引起的各種魚類感染癥種類繁多，統(tǒng)稱為“魚類的愛德華菌病”。該病菌對人類健康也有重大威脅，從事打撈的漁民、養(yǎng)殖人員等容易感染此菌，一般引起胃腸炎，也能導致腸道以外的一些感染，如腦膜炎、心內膜炎、皮膚感染、骨髓炎等，病情嚴重時，可能引起敗血癥，產(chǎn)生致命威脅。因此，有效地檢測該菌及防控相應的感染，具有重要的意義。

環(huán)介導等溫擴增技術，利用特異性識別靶序列的3對引物及一種在恒溫條件下具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，可以在恒溫條件進行目的片段的指數(shù)級擴增。條件簡單，易于操作，結果也比較可靠，適合進行病原的核酸檢測，多種檢測水生動物病原的LAMP方法已經(jīng)被建立[11]。本試驗建立的致病性遲鈍愛德華菌的LAMP檢測方法，特異性好，對遲鈍愛德華菌的核酸檢測的靈敏性可達2.16×10-5mg/L，優(yōu)于已報道的PCR檢測方法的靈敏度達2個數(shù)量級[12]。該方法對試驗儀器要求低、操作簡便、耗時短、比較可靠，適合水生動物傳染病檢測的要求，但LAMP技術也有自身的局限性，首先是LAMP對于試驗設計要求較高，引物設計和條件的摸索需要嚴謹，這樣才能保證后續(xù)使用時的便捷高效。因此應特別關注反應的特異性，合理設計引物，規(guī)范操作，消除假陽性因素。