陳楚翹，劉振民，喻東威，徐斐，袁敏

(1.上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心 上海理工大學 健康科學與工程學院，上海 200093；2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；3.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500)

生物胺(BA)是在動植物和微生物代謝過程中形成的低分子含氮化合物[1]。低濃度的生物胺與多種人體生理功能相關(guān)，例如胃酸分泌和調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)，但過量攝入會引發(fā)不良的生理反應(yīng)，嚴重時還會危及生命[2]。生物胺廣泛存在于天然食物中，但由于不同種類食品中的微生物分布迥異，導致生物胺種類和數(shù)量的差異，同時食品發(fā)酵及儲存過程會造成不同程度的生物胺累積。因此監(jiān)測食品生產(chǎn)過程中生物胺含量的變化可以作為評價食品品質(zhì)和新鮮度的重要指標[3]。由于食品中基質(zhì)成分復雜，容易對生物胺的含量分析造成干擾。根據(jù)生物胺分析方法的技術(shù)需求，必須在檢測前對生物胺樣品進行前處理，利用合適的前處理方法進行樣品凈化或富集[4-5]，以獲得良好的生物胺提取效率。本文對食品中主要存在的生物胺種類以及生物胺樣品前處理技術(shù)的最新進展進行了概述。

1 食品中的生物胺種類

生物胺廣泛存在于富含蛋白質(zhì)的食品中。肉制品中豐富的蛋白質(zhì)經(jīng)降解后產(chǎn)生的大量游離氨基酸，在氨基酸脫羧酶作用下導致生物胺大量生成。肉制品中主要存在的生物胺種類有精胺、亞精胺、酪胺等[6-7]。同樣的，由于水產(chǎn)制品極適合微生物繁殖且含有大量易降解的蛋白質(zhì)，故而極易造成生物胺含量超標，水產(chǎn)制品中主要存在的生物胺為組胺、腐胺、尸胺等[8-9]。酒類中的生物胺主要存在的生物胺為腐胺、組胺、酪胺等[10-11]，其總含量雖一般低于水產(chǎn)制品，但其中含有的乙醇會增加生物胺的毒性，故而也是食品安全領(lǐng)域關(guān)注的重點。深受人們青睞的奶酪，因其中富含大量酪氨酸，在發(fā)酵加工和成熟貯存過程極易產(chǎn)生大量酪胺[12-14]，同樣也是食品檢測的重點對象。

2 食品中生物胺的前處理技術(shù)

由于生物胺具有潛在毒性，準確快速測定生物胺含量成為了食品安全環(huán)節(jié)不可忽視的內(nèi)容。然而食品中生物胺的檢測較為困難，主要原因在于；①食品基質(zhì)復雜：人們所喜愛的發(fā)酵食品、肉類、水產(chǎn)類食品給生物胺形成提供了理想環(huán)境，同時這類食品富含蛋白質(zhì)和脂肪為生物胺檢測增加了難度。檢測基質(zhì)復雜的樣品，需要經(jīng)過提取、凈化等步驟，從而得到準確測定生物胺的含量；②常用的檢測方法所結(jié)合的前處理步驟繁瑣：生物胺既無熒光特性，也無紫外吸收基團，故而無法通過紫外或熒光儀進行檢測，因此生物胺檢測方法主要是色譜法，例如高效液相色譜(HPLC)[15]、氣相色譜-質(zhì)譜分析(GC-MS)[16]等，但提取得到的樣品還需經(jīng)過衍生化前處理后才能分析。其他方法諸如毛細管電泳及生物傳感器法[17]等可以省略衍生化步驟而直接分析生物胺含量。但毛細管電泳法對樣品的純度要求高，只適用于酒類等基質(zhì)簡單樣品中生物胺含量的測定。經(jīng)典前處理方法例如液液萃取通常使用有機溶劑提取生物胺，有機溶劑會導致酶失活，故而也無法聯(lián)用以酶等作為生物探針來對生物胺分析的生物傳感器檢測法。因此發(fā)展新型的前處理方法對于提高生物胺的檢測能力極為重要。近年來隨著綠色分析技術(shù)的發(fā)展，許多新型前處理方法不斷涌現(xiàn)。本文對近年來生物胺的前處理方法進行簡要概述。

2.1 液相萃取

2.1.1 液液萃取 液液萃取是根據(jù)目標待測物質(zhì)的溶解度差異，從而達到分離純化的前處理方法。液液萃取是國內(nèi)外提取生物胺的公認方法，在生物胺的測定國標[18]中用正丁醇/三氯甲烷混合試劑萃取生物胺，高效液相色譜法定量分析。雖然該方法適用于大部分食品，檢測結(jié)果準確，但步驟極為繁瑣，整個前處理過程耗時4 h以上。部分學者在液液萃取的基礎(chǔ)上對其進行了改進。Francisco等[19]采用鹽析輔助液液萃取技術(shù)凈化酸奶中的生物胺，加入硫酸銨進行鹽析反應(yīng)，加速向有機相轉(zhuǎn)移，縮短了萃取時間，獲得了較高的提取回收率。傳統(tǒng)液液萃取多消耗大量高毒有機溶劑[20]，無法與綠色新型檢測方法聯(lián)用，而與色譜技術(shù)聯(lián)用又需進行衍生化處理，時間冗長。隨著近年來樣品處理技術(shù)的不斷發(fā)展，液液萃取逐漸克服有機溶劑消耗量大、操作復雜的缺點，許多新技術(shù)基于液液萃取的原理不斷涌現(xiàn)。

2.2 固相萃取

2.2.1 傳統(tǒng)固相萃取 固相萃取是提取食品中生物胺的常用方法之一[24]。其原理是取用選擇性強的固體吸附劑例如十八烷基、石墨碳、苯基等來吸附復雜基質(zhì)中的待測化合物，使其達到與雜質(zhì)分離的效果，隨后通過加熱或者洗脫液洗脫解除吸附，從而實現(xiàn)凈化與富集樣品的目的。Liu等[25]建立了固相萃取-高效液相色譜法測定奶酪和香腸中的6種生物胺，先使用鹽酸和高氯酸提取奶酪和香腸中的生物胺，然后采用Oasis?MCX cartridge固相萃取柱對提取物進行凈化，隨后進行色譜檢測。該方法中奶酪生物胺回收率達到91.0%～99.1%，香腸中生物胺回收率達到90.3%～95.4%，較好地實現(xiàn)了富含蛋白質(zhì)和脂肪的食品中生物胺的分離。相較于液液萃取，固相萃取無需選擇兩種不相溶的試劑，也不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，但萃取效率會伴隨著固相萃取材料的使用次數(shù)增加而下降。因而需要發(fā)展更高效、具有特異性的填料。

2.2.2 分子印跡固相萃取 分子印跡固相萃取[26]是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展而來的新型萃取技術(shù)，以印跡聚合物(MIP)為填料，解決了傳統(tǒng)萃取材料特異性能差等缺點，且聚合物制備簡單，重復利用率高。Li等[27]首次將分子印跡固相萃取與絲網(wǎng)印刷電極檢測技術(shù)聯(lián)用來檢測血清和牛奶中的酪胺，以酪胺為模板分子制備印跡聚合物，在電極上涂層修飾MIP進行檢測，得到牛奶中的酪胺回收率為 99.6%～102.4%，對酪胺具有強選擇性，滿足檢測需求。然而分子印跡技術(shù)依然存在不足，主要問題在于印跡聚合物在水環(huán)境下的選擇能力較差，水相萃取效果差。目前的解決方向主要集中于：①多步萃取，避開水相萃取；②用有機溶劑在填料表面形成有機物保護殼，從而保護具有識別功能的官能團，增強水相萃取能力。 隨著分子印跡固相萃取技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新模式分子固相萃取應(yīng)運而生，例如磁性分子印跡聚合物微球萃取技術(shù)、分子印跡基質(zhì)固相分散萃取等，其可能成為未來最具發(fā)展?jié)摿Φ那疤幚砑夹g(shù)之一。

2.2.3 固相微萃取 固相微萃取與固相萃取原理相似，但樣品的前處理操作有很大差異。微萃取是集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的無溶劑處理技術(shù)，基于不同涂層材料的纖維或金屬絲來達到萃取、濃縮樣品中待測物質(zhì)的目的。整個過程包括吸附和解吸兩步。具有涂層材料的金屬絲或萃取纖維首先在適當溶劑中進行探針的活化以去除表面雜質(zhì)，隨后將探針放入樣品中萃取目標物，萃取完成后將探針放入水等溶劑中沖洗去吸附層表面的干擾物，最后吸附目標物質(zhì)的探針直接插入氣相等儀器的進樣口進行測定。Papageorgiou等[28]優(yōu)化了固相微萃取過程中的萃取纖維類型、提取時間、解吸過程、pH等因素，實驗結(jié)果表明該方法完全滿足葡萄酒產(chǎn)業(yè)中的生物胺分析。整個過程中固相微萃取無需有機溶劑，對環(huán)境危害程度小，但目前發(fā)展過程中固相微萃取仍存在以下問題：①纖維萃取針頭脆弱易斷且無法多次使用，雜質(zhì)容易在上面吸附影響提取效果；②萃取纖維造價昂貴，目前可以商品化的纖維屈指可數(shù)，限制了日常應(yīng)用，故而固相微萃取技術(shù)仍需在萃取纖維方面進行深度優(yōu)化研究，未來隨著性能更佳、成本更合理的萃取纖維頭的出現(xiàn)，必將提高固相微萃取應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性和使用重復性。

2.2.4 基質(zhì)輔助固相分散萃取 基質(zhì)輔助固相分散萃取與傳統(tǒng)樣品前處理方式不同，樣品的提取及凈化流程是同時進行的。分散劑例如硅藻土、硅膠、C18等與粉碎后的固體樣品碾磨充分，隨后作為填料裝柱，在淋洗劑的作用下實現(xiàn)目標物質(zhì)的分離，具備同時分析多種樣品、平衡時間短、萃取效率高等優(yōu)點。Milheiro等[29]采用基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)凈化富集酒類樣品中的生物胺，該法向樣品中加入Dowex?50W X8吸附劑，隨后采用氫氧化鈉溶液洗脫，結(jié)果表明該法能準確測定對133～509 μg/L內(nèi)的生物胺?；|(zhì)輔助固相分散無需進行離心、過濾等操作，在一定程度上避免了樣品的損失。但該方法不易進行廣泛推廣，主要受制于人為因素導致填裝技術(shù)的差異及研磨的顆粒大小不同。

2.2.5 吸附分離 吸附提取是一種低能耗的固相萃取技術(shù)，利用一些高分子聚合材料吸附干擾物質(zhì)從而實現(xiàn)目標物質(zhì)的純化。聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，因其呈多孔不規(guī)則團塊狀，比表面積與微孔面積大，吸附能力強，常被用來處理基質(zhì)簡單的液體樣品。Daniel等[30]建立了一種PVPP吸附結(jié)合毛細管電泳-質(zhì)譜的檢測方法，測定酒類樣品中的多種生物胺，首先將PVPP(0.5 g)與酒類樣品(10 mL)混合，均質(zhì)離心處理后再通過0.45 μm再生纖維素膜(Agilent P/N 5190-5284)進一步除去干擾物，隨后進行分析測定。該方法對生物胺的回收率達到了87%～113%，檢測限低至1～2 μg/L，適用于酒類樣品中生物胺的檢測需求。PVPP吸附處理時間基本能控制在10 min以內(nèi)，操作步驟簡單，滿足綠色檢測需求，但PVPP應(yīng)用領(lǐng)域較窄，多用于吸附多酚物質(zhì)，對其他干擾物質(zhì)的吸附率較低。未來吸附提取發(fā)展趨勢將是根據(jù)待測物的結(jié)構(gòu)開發(fā)出更多高效的吸附劑，從而實現(xiàn)對不同物質(zhì)的凈化。

2.3 電膜萃取

與傳統(tǒng)消耗大量有機溶劑的前處理方法不同，Pedersen-Bjergaard等[31]在2006年提出的電膜萃取前處理方法，可以大量減少甚至避免有機溶劑的使用。電膜萃取是以電場為驅(qū)動力的萃取手段，使用酸堿等試劑調(diào)節(jié)pH使目標物以離子形式存在，帶電目標物質(zhì)在電場驅(qū)動下通過有機溶劑形成的極薄支撐液膜(SLM)到達接受相溶液，從而實現(xiàn)樣品的凈化與富集，原理見圖1。Zarghampour等[32]使用芯片電膜萃取技術(shù)凈化富集香腸中的生物胺，前處理過程僅需30 min，提取回收率>95%，完全滿足食品中生物胺的檢測需求。目前許多學者將電膜萃取與其他前處理方法聯(lián)用，彌補單一前處理技術(shù)的不足。Kamankesh等[33]建立了電膜萃取與液液微萃取相結(jié)合的前處理方法，樣品經(jīng)電膜萃取后再經(jīng)液液微萃取，有機溶劑需求量極低，符合綠色檢測的要求。該法高效、快速，富集倍數(shù)高，最終提取回收率達到82%～99%。

電膜萃取作為一種微型化萃取方法，對于基質(zhì)復雜的樣品具有顯著的富集純化效果，同時裝置容易制備，所需樣品和溶劑的量都以μL計，是一種環(huán)境友好型的檢測方法。但目前仍受限于SLM的不穩(wěn)定性，萃取效率在一定范圍內(nèi)與電壓呈正相關(guān)，但SLM可能會在高電壓的情況受熱脫落，導致實驗失敗。因此，對于不同目標物質(zhì)，尋找適宜、穩(wěn)定的SLM至關(guān)重要。未來的電膜萃取趨勢也將是發(fā)展更穩(wěn)定的新型SLM，從而給樣品分析帶來更多新選擇。

圖1 電膜萃取過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of electromembrane extraction

3 結(jié)論與展望

前處理方法是生物胺檢測過程中不可或缺的過程，傳統(tǒng)液液萃取作為最常用的生物胺處理方法，存在有機溶劑消耗量大、易發(fā)生乳化現(xiàn)象等缺點，固相萃取可以避免乳化現(xiàn)象的發(fā)生，但萃取材料無法多次使用。電膜萃取可應(yīng)用于不同的基質(zhì)，并且解決了后續(xù)檢測技術(shù)不兼容的問題，但支撐液膜無法在高萃取電壓下保持良好的穩(wěn)定性，可能導致萃取溶劑流失，需要開發(fā)出耐熱性強、穩(wěn)定性好的膜材料。未來樣品前處理方法發(fā)展趨勢將轉(zhuǎn)向綠色高效，主要發(fā)展發(fā)向可概括為以下幾點：①簡化步驟，盡可能減少甚至避免使用有機溶劑；②對目標物質(zhì)具有較高的選擇性，可以在較短時間內(nèi)完成富集；③所用到材料易于制備、穩(wěn)定性強、成本低；④脫離實驗室檢測環(huán)境，實現(xiàn)商品化，可廣泛應(yīng)用于日常生活的檢測。除以上發(fā)展趨勢外，多種前處理方法聯(lián)合應(yīng)用也將是未來分析方法發(fā)展的新趨勢，優(yōu)勢互補，可以得到更高的富集倍數(shù)，更低的檢測限。隨著食品分析領(lǐng)域的需求不斷提高，今后將會不斷涌現(xiàn)更多高效、快速、便捷的新型樣品前處理技術(shù)，為食品中生物胺的快速精準測量提供重要的保障。