周向軍 ，高茹霞 ，齊 婷

（1.天水師范學院 生物工程與技術(shù)學院，甘肅 天水 741001；2.甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點實驗室，甘肅 天水 741001）

農(nóng)作物秸稈作為一種數(shù)量極大的可再生生物質(zhì)資源，其資源化利用方式主要包括：肥料化、飼料化、能源化、原料化和基料化等[1]。其中，秸稈還田是實現(xiàn)農(nóng)作物秸稈肥料化利用的重要手段之一。該模式不僅可避免秸稈焚燒所造成的環(huán)境污染，而且還具有能提高土壤微生物酶活性，改善土壤團粒結(jié)構(gòu)[2]，增加土壤孔隙度和土壤肥力等多重功能，因而正日益成為一種綠色的保護性耕作技術(shù)手段。溶解性有機質(zhì)（Dissolved organic matter，DOM）是指能通過0.45 μm濾膜的碳基有機混合物[3]。秸稈源DOM作為土壤溶解性有機碳（Dissolved organic carbon，DOC）的重要來源之一，對于促進土壤養(yǎng)分循環(huán)和最終實現(xiàn)農(nóng)田固碳等同樣具有重要意義[4]。韋夢雪等[5]研究表明，水稻/油菜秸稈腐解釋放的DOM濃度呈現(xiàn)一定的階段性，腐解前期（10 d內(nèi)）以小分子芳香性組分為主，蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素類組分主要在腐解后期被降解；李艷等[6]利用三維熒光—平行因子法對玉米秸稈和牛糞發(fā)酵形成的DOM熒光組分進行分析，結(jié)果表明，秸稈/牛糞體積比為6∶4可作為堆肥參考值；范春輝等[7]利用紫外光譜和熒光光譜研究了pH對DOM光譜的影響，初步闡述pH對秸稈腐殖化過程DOM性質(zhì)的影響。李婉秋等[8]針對秸稈生物質(zhì)DOM的光譜特性及其與Cu2+的相互作用開展了相關(guān)研究，結(jié)果表明，生物質(zhì)炭來源的DOM可對Cu2+的環(huán)境行為產(chǎn)生影響。

由于秸稈DOM化學結(jié)構(gòu)復雜多樣，難以進行有效的組分分離，導致其在農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中的釋放特征和熒光組分等仍缺少系統(tǒng)性研究，不利于進一步掌握秸稈還田腐解規(guī)律和養(yǎng)分釋放特征等基本信息，同時，盡管前人相關(guān)研究均支持土壤微生物影響秸稈腐解以及光譜學可用于DOM化學表征這一觀點，但目前尚不清楚小麥秸稈腐解過程DOM的釋放特征及其熒光組分的類型變化，同時也需要進一步評估光譜學方法是否能用于小麥秸稈DOM的化學結(jié)構(gòu)表征。目前，用于DOM研究的技術(shù)方法主要可分為色譜法和光譜法[9]，其中，光譜學方法由于具有成本低、速度快、精確度相對較高和應用性較強等特點，能初步區(qū)分DOM化學結(jié)構(gòu)的差異性，追蹤不同腐解階段秸稈殘體的結(jié)構(gòu)變化，因而逐漸成為科研人員的關(guān)注熱點領(lǐng)域之一。常見的DOM光譜學研究方法主要有紫外可見光譜（UV-Vis）、紅外光譜（FTIR）、三維熒光光譜（3D-EEM）和核磁共振（NMR）等[10]。其中，UVVis具有操作簡便、樣品用量少和靈敏度高等優(yōu)點，通過DOM特征性參數(shù)可對其芳香化和腐殖化過程進行評估；3D-EEM能及時準確地提供DOM熒光組分的“指紋”信息[11]；FTIR能提供DOM主要官能團的光譜學信息，從而可實現(xiàn)對DOM化學結(jié)構(gòu)變化進行跟蹤的目的[12]；NMR雖然對DOM化學結(jié)構(gòu)的解析度較高，但對儀器平臺和試驗成本等均要求較高。

本研究利用總有機碳法、UV-Vis、FTIR和3D-EEM技術(shù)，對不同腐解階段小麥秸稈DOM的釋放特征、光譜學特性和熒光組分等進行解析，為進一步了解小麥秸稈腐解過程中DOM的結(jié)構(gòu)變化和腐解機制等提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

小麥秸稈采自甘肅省天水市秦州區(qū)郊區(qū)農(nóng)田。

1.2 試驗設(shè)備

UV-2600紫外分光光度計（島津（中國）有限公司）；F-7000熒光分光光度計（日立（中國）有限公司）；Nicolet IS5傅里葉紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5810R離心機（德國艾本德公司）；Multi N/C2100 TOC分析儀（德國耶拿分析儀器有限公司）；FD-1D-50真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液制備及小麥秸稈腐解 小麥秸稈風干粉碎過篩得粒徑約1 mm秸稈粉末，備用。采用五點取樣法采集農(nóng)田黃綿土，過0.84 mm篩，按15 g/100 mL加入蒸餾水，振蕩5 h后上清液在4 000 r/min離心10 min，收集菌液。稱取小麥秸稈粉5.00 g，加入少許石英砂和50 mL蒸餾水，分散后加入菌液10 mL，室溫120 r/min恒溫避光振蕩?？紤]到60 d后腐解體系pH逐漸不利于微生物生長，故在 0、1、3、5、10、15、20、30、45、60 d分別取樣5 mL并及時補充水分。8層紗布過濾，采用Centrifuge 5810R離心機在8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾即為DOM[13]。

1.3.2 DOM測定 樣品酸化至pH值2.0以除去溶解性無機碳，采用Multi N/C2100 TOC分析儀測定DOC14]。DOM濃度通常被認為是DOC濃度的 2倍[15]。

1.3.3 紫外光譜分析 在250～500 nm范圍內(nèi)，利用UV-2600紫外分光光度計測定DOM的紫外吸收光譜。

式中，aλ和Aλ分別為波長λ處吸收系數(shù)（m-1）和吸收度，l為光程（m）。

1.3.4 紅外光譜分析 DOM經(jīng)過FD-1D-50真空冷凍干燥機冷凍后，采用Nicolet IS5傅里葉紅外光譜儀在1 000～3 600 cm-1范圍內(nèi)測定紅外光譜。

1.3.5 三維熒光光譜分析 以超純水為空白，采用F-7000熒光分光光度計在光源150 W氙燈，PMT電壓700 V條件下，設(shè)定Ex為220～400 nm，Em為250～550 nm，波長步長10 nm，狹縫5 nm，掃描速度1 200 nm/min[16]進行測定。采用紫外吸收度值進行熒光內(nèi)濾效應校正。

式中，F(xiàn)C和F為校正前后的熒光強度，AEx和AEm為激發(fā)/發(fā)射波長處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗采用Origin 8.0作圖和SPSS 16.0進行最小顯著性差異法（LSD）統(tǒng)計分析，P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOM的釋放特征分析

小麥秸稈腐解釋放DOM的濃度變化如圖1所示。

圖1 小麥秸稈腐解過程DOM濃度變化Fig.1 Change of DOM concentration in decomposition process of wheat straw

從圖1可以看出，小麥秸稈腐解釋放DOM具有明顯的階段性，基本可分為3個階段：在腐解初期（0～5 d），DOM濃度呈波動趨勢；在腐解中期（5～20 d），DOM濃度快速降低（P＜0.05），表明其生成速度低于分解速度；在腐解后期（20～60 d），DOM濃度又逐漸增加（P＜0.05），其生成速度高于分解速度。分析原因認為是：在腐解初期，一方面新鮮小麥秸稈可快速釋放生物利用性較高的氨基酸、有機酸、單糖等親水性小分子化合物，另一方面該類化合物也可作為底物進而誘導土壤微生物大量繁殖，因而，DOM濃度出現(xiàn)波動趨勢；在腐解中期，淀粉類碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類等易降解生物大分子進入快速分解期，甚至最終被礦化后以CO2和CH4形式釋放，因而，DOM濃度不斷降低；在腐解后期，小麥秸稈進入緩慢分解期，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等難降解性化合物逐漸被土壤微生物酶系所降解，同時微生物代謝產(chǎn)物及其殘體也成為DOM來源，故DOM濃度又逐漸增加。

2.2 DOM的紫外光譜及其特性分析

2.2.1 紫外光譜 小麥秸稈腐解釋放DOM的紫外光譜如圖2所示，小麥秸稈不同腐解階段DOM的紫外吸收光譜具有一定的相似性，且吸收強度幾乎均隨波長增加而逐漸降低，這表明不同腐解階段DOM組分的化學結(jié)構(gòu)具有一定相似性。在217～220 nm（peak 1）范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰是由無機離子如溴化物和硝酸鹽等以及肽類化合物的π-π*躍遷引起的。當腐解至第3 天后，217～220 nm的吸收峰先紫移后紅移，原因可能是DOM與水溶液間的氫鍵作用得到增強，同時水分子具有的偶極矩使DOM極性增強而發(fā)生溶劑化作用[17]，因而，DOM發(fā)生紅移。研究還發(fā)現(xiàn)，當腐解1 d后，在270～280 nm（peak 2）和325 nm（peak 3）附近較弱的吸收峰幾乎完全消失。

圖2 小麥秸稈腐解過程DOM的紫外光譜分析Fig.2 UV spectrum analysis of DOM in decomposition process of wheat straw

2.2.2 吸光度比值分析E2/E3代表DOM在λ250和λ365處的吸收度比，與其芳香化程度成反比[18]。從圖3可以看出，在0～3 d范圍內(nèi)，E2/E3先降低后增加，隨后E2/E3逐漸下降。當腐解第15天后，E2/E3緩慢增加后又下降，但在整個腐解過程中E2/E3值范圍變化不大。E2/E4代表DOM在λ240和λ420處的吸收度比值，與DOM縮合度成反比[19]。從圖3可以看出，在0～3 d范圍內(nèi)，E2/E4先降低后增加，隨后E2/E4急劇下降（P＜0.05）。當腐解20 d后，E2/E4先增加后降低。原因是腐解中期生成的部分DOM產(chǎn)物相互作用形成分子量較大的腐殖質(zhì)類物質(zhì)，在腐解后期其分解和形成處于動態(tài)變化過程。E2/E4和E2/E3變化趨勢較為相似，結(jié)合E2/E3與芳香化程度成反比以及E2/E4與DOM縮合度成反比這一觀點，可認為DOM芳香化程度與其縮合度具有相關(guān)性。

圖3 小麥秸稈腐解過程E2/E3和E2/E4分析Fig.3 Analysis of E2/E3 and E2/E4 values in decomposition process of wheat straw

2.2.3 SUVA254特征分析 SUVA254是DOM在λ254處的吸收系數(shù)與DOM濃度之比，與芳香性成正比[20]。從圖4可以看出，在0～3 d范圍內(nèi)，SUVA254值迅速降低（P＜0.05），表明DOM芳香化程度降低，原因與腐解初期大量繁殖的土壤微生物促進芳香類腐殖質(zhì)降解有關(guān)。在3～20 d范圍內(nèi)，SUVA254值逐漸增加（P＜0.05），其原因是腐解中期秸稈水解又重新形成了部分芳香性DOM化合物。在20～60 d范圍內(nèi)，SUVA254值先明顯降低（P＜0.05）后略有增加（P＞0.05），說明木質(zhì)素源芳香類化合物開始被土壤微生物降解形成部分芳香類化合物。

圖4 小麥秸稈腐解過程SUVA254值變化Fig.4 Change of SUVA254 values in decomposition process of wheat straw

2.3 紅外光譜分析

小麥秸稈腐解過程DOM的紅外光譜分析結(jié)果如圖5所示。

圖5 小麥秸稈腐解過程DOM的紅外光譜分析Fig.5 Analysis of infrared spectroscopy of DOM in decomposition process of wheat straw

在不同腐解階段，小麥秸稈DOM均出現(xiàn)5個主要吸收峰：3 382～3 400、2 927～2 939、1 593～1 650、1 397～1 416、1 115～1 125 cm-1，但其相對吸收強度有所差異，表明在不同腐解階段DOM的組成和含量有所不同。其中，3 382～3 400 cm-1處的寬峰歸屬為形成氫鍵的O-H、N-H伸縮振動，如纖維素、半纖維素、淀粉類化合物和單糖等化合物，以及水分子中O-H的伸縮振動[21]；2 927～2 939 cm-1處的弱峰歸屬為脂肪族或碳水化合物中-CH2中CH的反對稱伸縮振動[22]；1 593～1 650 cm-1處的強峰歸屬為COO-反對稱伸縮振動、酰胺II帶中N-H、芳香環(huán)骨架以及C=O、C=C的伸縮振動[23]；1 397～1 416 cm-1處的強峰歸屬為C-N的伸縮振動、苯環(huán)C-H的彎曲振動以及蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的NH4+、NO3-和-COO-吸收[24]；1 115～1 125 cm-1處的強峰歸屬為碳水化合物、醇類、羧酸類和酯類中CO-C的不對稱伸縮振動[25]。綜上所述，小麥秸稈含有脂肪族、酰胺類、含氧/氮基團和芳香類等化合物。

腐解初期：3 382～3 400 cm-1處的吸收峰逐漸降低，主要原因是具有分子間氫鍵的含O-H類化合物被逐漸分解。2 927～2 939 cm-1處的峰強和峰形變化不明顯，原因是多種化合物均在此區(qū)域有紅外吸收。腐解中期：3 382～3 400 cm-1處的吸收峰先增強后減弱，表明淀粉類、脂類化合物等被土壤微生物所分解，從而將更多含-OH、-NH2類化合物暴露在溶劑體系，隨后DOM又被微生物作為底物而消耗。腐解后期：3 382～3 400 cm-1處的峰強度有所增強，1 630～1 650 cm-1處出現(xiàn)多個混雜峰，表明木質(zhì)素、單寧、蠟質(zhì)開始被降解生成小分子聚糖類化合物。另外，纖維素化合物具有高度的結(jié)晶性和致密結(jié)構(gòu)以及存在分子間氫鍵作用，因而，一般不易被分解，但當腐解至第45天后，1 506～1 507 cm-1處的弱吸收峰徹底消失，表明小麥秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)逐漸受到破壞，木質(zhì)素包裹作用減弱[26]，與圖4中腐解45 d后SUVA254值緩慢增加的結(jié)論一致。第45、60天的DOM峰強和峰形較為相似，表明未降解的部分碳氫類化合物、有機酸、酰胺類以及碳水化合物等以木質(zhì)素源芳環(huán)為核心發(fā)生聚合作用形成聚合度較高的芳香類腐殖質(zhì)，使DOM結(jié)構(gòu)更加復雜化。

2.4 三維熒光光譜及熒光組分分析

3D-EEM可同時提供熒光強度隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的關(guān)系，故根據(jù)熒光基團的光譜信息，可推測不同腐解階段小麥秸稈DOM的結(jié)構(gòu)組成。DOM的熒光峰位置及熒光類型如表1所示。

表1 不同腐解過程DOM的熒光峰類型Tab.1 Fluorescence peak types of DOM in different decomposition processes

根據(jù)魯遙等[27]研究結(jié)果，λEx/λEm=230～270 nm/370～460 nm、λEx/λEm=300～360 nm/370～440 nm范圍內(nèi)熒光峰，主要與胡敏酸C=O、-COOH和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的有機化合物等有關(guān)[28]；λEx/λEm=350～440 nm/430～510 nm范圍內(nèi)熒光峰，主要與胡敏酸的腐殖化程度有關(guān)；λEx/λEm=290～310 nm/400～450 nm范圍內(nèi)熒光峰，主要與類富里酸的微生物降解產(chǎn)物有關(guān)[29]。

在腐解初期后半階段，類富里酸的分解速度大于類胡敏酸，原因是類富里酸主要由碳水化合物和不同分子量大小的脂肪族化合物組成，因而，容易被土壤微生物礦化而分解。在腐解中后期（15～20 d），類胡敏酸逐漸被大部分降解，原因是類胡敏酸主要由類多糖、脂肪族木質(zhì)素類、長鏈脂肪族化合物等組成，且難降解性芳香類化合物的比例高于類富里酸，因而，主要在腐解中后期被降解[30]。在腐解后期，3D-EEM出現(xiàn)了類富里酸熒光峰，該熒光峰基本歸屬為芳香類化合物且與COOH、C=O和酚羥基的含量密切相關(guān)，原因與木質(zhì)素及其降解產(chǎn)物如酚類、醌類及脂肪族類化合物相互聚集形成類富里酸有關(guān)[31]。研究還發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈腐解初/中期幾乎均存在類蛋白峰，原因是類蛋白峰的出現(xiàn)與該腐解階段土壤微生物的代謝比較旺盛有關(guān)，同時也有秸稈添加量較多有關(guān)[32]。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除在腐解初期發(fā)生波動外，DOM濃度在腐解中、后期呈V型趨勢，具有明顯的階段性。這與韋夢雪等[5]關(guān)于油菜和水稻腐解過程DOM濃度呈W型變化有所不同。原因是秸稈DOM的釋放過程是一個土壤微生物代謝和腐解中間產(chǎn)物相互轉(zhuǎn)化共同控制的復雜過程，不同腐解階段的DOM組成和存在狀態(tài)均具有一定的異質(zhì)性[33]。如小麥秸稈與油菜/玉米秸稈DOM不僅在分子大小、親/疏水性和C/N等秸稈腐解內(nèi)在因素方面存在差異，而且也與土壤微生物種類、豐度以及秸稈顆粒大小等外在因素有關(guān)[34]。另外，小麥秸稈腐解過程中存在腐解中期速度較快、腐解后期速度較慢等特點，這與韋夢雪等[5]關(guān)于油菜和水稻腐解規(guī)律基本一致，其原因在于活化后的土壤微生物活性較高，首先以秸稈有機質(zhì)為底物進行快速分解，隨后難降解性組分分解形成DOM并發(fā)生部分團聚性的腐殖化過程。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOM的紫外吸收均隨波長增加而下降，最大吸收峰位于270～280 nm且在325 nm附近出現(xiàn)肩峰，這一結(jié)果類似于余旭芳等[11]關(guān)于小麥秸稈堆肥過程中水溶性有機物的UV-Vis光譜變化狀況，但與范春輝等[7]關(guān)于玉米秸稈紫外吸收峰位于229 nm有一定差異，這主要與腐解體系有機質(zhì)的復雜性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，270～280 nm范圍內(nèi)的吸收峰在腐解中后期消失，原因是部分芳香類DOM組分通過土壤微生物酶降解或化學聚合作用而不斷減少[35]。有研究表明，盡管E2/E3和E2/E4等特征性參數(shù)常用來比較DOM的腐殖化程度、分子量大小和縮合度等指標，但該值易受溶液體系中各種無機離子的干擾[36]。本研究E2/E3和E2/E4的范圍存在較大差異即證明了這一點，但E2/E3和E2/E4的變化趨勢基本一致，表明DOM芳香化程度與其縮合度具有相關(guān)性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈DOM的芳香性呈波動變化趨勢，且腐解10 d后，其芳香性高于腐解初期。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腐解初期和中期，3 382～3 400、2 927～2 939 cm-1處的吸收強度逐漸下降，表明碳水化合物和脂類含量逐漸降低，最終以CO2形式釋放。當腐解15 d后，1 593～1 650 cm-1處吸收強度發(fā)生起伏變化并逐漸藍移至1 650 cm-1處，以及1 400～1 420、1 120～1 130 cm-1處的吸收峰明顯增強后減弱，表明部分羧酸酯類化合物不斷發(fā)生分解生成羧酸鹽，同時蛋白質(zhì)類化合物也被降解后形成CO2、硝酸鹽或銨鹽等。研究還發(fā)現(xiàn)，當腐解15 d后，1 629～1 654 cm-1處開始出現(xiàn)尖銳的雙峰，表明酰胺類化合物以及難降解的芳酮類化合物部分形成[37]。上述結(jié)果表明，小麥秸稈在不同腐解過程中并不是單純降解某一類化合物，而是同時也伴隨著其他化合物的分解或轉(zhuǎn)化。劉佳琪等[38]對高粱和玉米秸稈腐解過程進行紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)腐解過程中碳水化合物含量降低，氨基酸等小分子化合物被分解，羧基含量增多且芳香類化合物增多，這與小麥秸稈腐解過程具有一定的相似性?？傮w而言，氨基酸等親水性小分子化合物首先被降解，隨后以分解淀粉類多糖、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子為主，羧基酸鹽含量增多，最后以降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素類化合物為主。

三維熒光光譜發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈腐解初期存在類蛋白、類富里酸和類胡敏酸3種熒光峰，腐解中期類胡敏酸熒光峰逐漸消失，類富里酸熒光峰逐漸出現(xiàn)，而腐解后期僅存在類富里酸峰，與韋夢雪等[5]關(guān)于油菜秸稈僅在腐解初期具有類蛋白熒光組分，以及水稻秸稈始終未檢測到類蛋白質(zhì)熒光組分這一結(jié)果不同，這表明盡管小麥秸稈中蛋白質(zhì)類屬于易降解性化合物，但由于小麥秸稈添加量較多等原因，在腐解初期、中期均發(fā)現(xiàn)類蛋白峰的存在，同時也表明土壤微生物代謝較為活躍旺盛，腐解過程中新生成了大量類蛋白化合物。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨腐解過程的進行，胡敏酸類化合物逐漸消失而富里酸類化合物進一步形成，原因可能是小麥秸稈的過量添加使微生物分解作用增加，延緩了富里酸向胡敏酸的轉(zhuǎn)化進程[39]，同時也不利于以雜環(huán)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的類胡敏酸縮聚成核。

本研究結(jié)果表明，除腐解初期發(fā)生波動外，小麥秸稈DOM釋放過程基本呈V型分布，整體表現(xiàn)為：腐解前期波動、腐解中期降解較快和后期降解較慢的特點。小麥秸稈DOM釋放過程可分為3個階段：腐解初期（0～5 d）、腐解初期（5～20 d）和腐解后期（20～60 d），DOM釋放過程呈現(xiàn)明顯的階段性。紫外光譜表明，隨腐解過程的進行，小麥秸稈DOM中芳香性化合物先降低后整體逐漸增加，E2/E4和E2/E3變化趨勢相同，也表明DOM芳香化程度與其縮合度具有相關(guān)性。紅外光譜表明，親水性小分子化合物首先被釋放，然后小麥秸稈以釋放易降解性生物大分子為主，最后以釋放難降解性生物大分子為主，但整個腐解階段秸稈有機質(zhì)的降解不存在明顯的界限。三維熒光光譜表明，腐解初期DOM含有類蛋白、類胡敏酸和類富里酸化合物，腐解中期類富里酸的消耗速度快于其他化合物，而腐解后期則類蛋白、類胡敏酸的消耗速度快于類富里酸形成速度。