張思雨，郭亞寧，艾 靜，張盼盼，王富剛

（榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 榆林 719000）

綠豆（Vigna radiata（L.）Wilczek）作為我國主要的食用豆之一，其籽粒富含蛋白質(zhì)、脂肪和抗氧化物質(zhì)等[1-2]，且生育期短、抗逆性強，是重要的藥食同源作物[3-4]。陜北榆林地處毛烏素沙地南緣，接壤黃土高原[5]，土壤沙質(zhì)，光照充足，晝夜溫差大，是綠豆的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)[6-8]。

榆林市橫山區(qū)的橫山大明綠豆，因籽粒飽滿、色澤鮮亮、營養(yǎng)含量豐富，暢銷日本、韓國等地，是我國的地標作物[9]。榆林地區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，雨熱同季，春季降雨量少，綠豆在榆林地區(qū)5月中下旬種植，降雨量少導(dǎo)致綠豆出苗困難，嚴重影響當(dāng)?shù)鼐G豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，在發(fā)芽期進行綠豆資源的抗旱性鑒定，對于當(dāng)?shù)氐木G豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義深遠。

以PEG 6000（聚乙二醇）高滲溶液模擬干旱脅迫條件是目前常用方法之一[10-11]，在各種作物中使用普遍[12-16]。干旱處理發(fā)芽期種子，會導(dǎo)致種子在形態(tài)、生理和分子方面均發(fā)生變化。形態(tài)方面研究較多的指標包括發(fā)芽勢[17]、發(fā)芽率[18]、發(fā)芽指數(shù)[19]、抗旱系數(shù)、胚根長度、胚芽長度、干物質(zhì)等，干旱脅迫導(dǎo)致種子發(fā)芽受到抑制，發(fā)芽率和發(fā)芽勢下降，胚根伸長受阻，不能有效吸收水分，胚芽發(fā)育緩慢[20]。生理指標方面測定的指標包括脯氨酸含量、丙二醛（Malonodialdehyde，MDA）、可溶性蛋白、過氧化物酶（Peroxidase，POD）活力、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等[21]。

干旱脅迫引起細胞膜的滲透勢變化，細胞內(nèi)發(fā)生一系列抗氧化反應(yīng)，過氧化物在胞內(nèi)累積，抗氧化酶活力增強[22]。因此，通過形態(tài)指標和生理指標綜合評價綠豆資源的抗旱性，對于綠豆的抗旱性鑒定具有實踐意義。

本研究利用15% PEG 6000模擬干旱脅迫條件，基于40份綠豆資源，測定不同綠豆資源的形態(tài)指標和生理指標，通過變異系數(shù)分析、相關(guān)性分析、隸屬函數(shù)分析、生理指標分析和聚類分析等，構(gòu)建40份綠豆資源的抗旱性評價指標體系，以篩選出抗旱綠豆資源，旨在為榆林綠豆的抗旱性育種奠定理論基礎(chǔ)和資源基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究選取40份綠豆資源作為材料，按照順序編碼為 LD01～LD40（表 1），其中，LD01～LD39為全國各地主栽綠豆品種，由西北農(nóng)林科技大學(xué)小雜糧研究團隊提供；LD40為榆林地區(qū)主栽綠豆品種榆綠1號，榆綠1號由榆林市農(nóng)技推廣中心提供。

表1 供試綠豆的編號及來源Tab.1 Codes and sources of different mung beans

1.2 試驗方法

利用15% PEG 6000模擬干旱脅迫條件[23]，選取健康、飽滿的綠豆籽粒，清洗干凈后晾干，0.5%的次氯酸鈉滅菌7 min，蒸餾水清洗干凈，濾紙吸干水分，晾24 h后備用。取干凈的培養(yǎng)皿，稱質(zhì)量后標記質(zhì)量，每個培養(yǎng)皿中放入直徑11 cm的干凈濾紙，均勻擺放綠豆籽粒30粒。各資源設(shè)置處理和對照，處理取10 mL 15% PEG 6000溶液，對照取10 mL純凈水，分別倒入培養(yǎng)皿中，稱質(zhì)量并標記質(zhì)量和資源編號。將所有培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中，設(shè)置恒溫25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)6 d。每個資源設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 形態(tài)指標及生理指標測定

以胚根長度≥種子長度為發(fā)芽標記，每日定時記錄發(fā)芽種子數(shù)，并根據(jù)質(zhì)量差稱質(zhì)量進行補水。6 d后，隨機選取10粒，測定鮮質(zhì)量、根長、MDA和可溶性蛋白含量，計算相對發(fā)芽勢（Relative germination potential，RGP）、相對發(fā)芽率（Relative germination rate，RGR）、相對發(fā)芽指數(shù)（Relative germination index，RGI）和相對活力指數(shù)（Relative vitality index，RVI）[24-25]?？扇苄缘鞍缀繙y定參照文獻[26]的方法進行，MDA含量測定參照文獻[27]的方法進行。

1.4 抗旱性綜合評價

參照郝俊峰等[28]的方法，采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對40份綠豆資源進行抗旱性綜合評價。

式中，Xj代表某一指標的隸屬函數(shù)值，X代表某一指標的測定值；Xmax和Xmin分別表示該指標的最大值和最小值。

式中，Vj代表某指標的標準差系數(shù)代表某一指標的隸屬函數(shù)平均值；Wj代表某指標的權(quán)重系數(shù)；D代表某材料所有指標的綜合評價值（D值越大，表示抗旱性越強，反之較差）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，計算各形態(tài)指標及生理指標的值；通過SPSS 25.0軟件進行主成分分析，計算載荷值和方差貢獻率等[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆資源抗旱性相關(guān)指標的分析

干旱處理6 d后，對40份綠豆資源進行8個抗旱性指標測定，結(jié)果如表2所示。

表2 抗旱指標的變異Tab.2 Variation of drought resistant indexes %

從表2可以看出，15% PEG處理6 d后，各綠豆資源的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度和活力指數(shù)均下降，8個抗旱指標的變異系數(shù)分布在25%～313%；活力指數(shù)反映不同綠豆資源的發(fā)芽速度及生長狀況[30]，活力指數(shù)越大，綠豆資源的抗旱性越強，相對活力指數(shù)平均值為12.28%，參照品種榆綠1號的相對活力指數(shù)為12.41%，相對活力指數(shù)最大值37.11%，最小值0.94%，變異系數(shù)為69%，表明干旱處理導(dǎo)致40份綠豆資源的活力指數(shù)均下降，不同資源的下降比例豐富度較高，同時40份資源間的相對發(fā)芽勢變異系數(shù)高達69%，發(fā)芽勢和活力指數(shù)可作為40份綠豆資源抗旱性鑒定的指標；MDA作為膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物，過量積累對植物才會造成損傷，干旱處理后，各綠豆資源的相對MDA含量變化差異明顯，平均上升至對照的55.84倍，變異系數(shù)高達313%，而可溶性蛋白含量在干旱處理后均上升6.25倍，各資源間的變異系數(shù)為70%。相對發(fā)芽率和相對鮮質(zhì)量的變異系數(shù)分別為25%和30%，變異幅度較小，不是40份綠豆材料抗旱性篩選的最佳指標。發(fā)芽勢、相對活力指數(shù)、MDA和可溶性蛋白含量的變異系數(shù)高，說明其是抗旱性篩選的重要指標。

2.2 抗旱性指標的相關(guān)性分析

抗旱性指標的相關(guān)性分析如表3所示。

表3 抗旱性指標的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of drought resistance indexes

為了進一步分析各指標間的關(guān)系，對8個指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示，相對發(fā)芽率與相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），說明15% PEG 6000脅迫處理條件下，綠豆資源的發(fā)芽率越高，其活力指數(shù)和鮮質(zhì)量越高，發(fā)芽狀態(tài)愈佳；相對活力指數(shù)分別與相對發(fā)芽指數(shù)和相對根長呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），說明種子活力高，發(fā)芽力強的綠豆資源，其根系伸長力較強；可溶性蛋白作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[31]，干旱脅迫初期，可溶性蛋白大量產(chǎn)生，響應(yīng)干旱造成的滲透脅迫，可溶性蛋白和相對活力指數(shù)存在顯著的負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），抗旱性資源中可溶性蛋白的上升比例小于不抗旱資源，干旱環(huán)境會引起芽苗中的可溶性蛋白含量上升，干旱脅迫越嚴重MDA含量越大。

2.3 40份綠豆資源的抗旱性綜合評價

基于相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對胚根長、相對活力指數(shù)和相對鮮質(zhì)量共6個指標，利用隸屬函數(shù)法，計算40份綠豆資源的抗旱性綜合得分D值，結(jié)果如表4所示，40份資源的綜合得分分布在0.07～0.08，平均值為0.38，變異系數(shù)為36%。當(dāng)?shù)刂髟苑N（LD40）的D值為0.54，資源LD14、LD16和LD28的D值均大于LD40，其中最大值為0.70，最小值為0.59，說明該3份綠豆材料較榆綠1號具有更好的芽期抗旱性，可作為當(dāng)?shù)乜购狄N的潛在綠豆資源；其余36份綠豆資源的D值均小于LD40，D值的差異性反映了綠豆參試資源抗旱的多樣性。

表4 40份綠豆資源的抗旱性綜合評價Tab.4 Comprehensive evaluation of drought resistance for 40 mung bean resources

續(xù)表4 40份綠豆資源的抗旱性綜合評價Tab.4（Continued） Comprehensive evaluation of drought resistance for 40 mung bean resources

2.4 40份資源的抗旱性聚類分析結(jié)果

基于6個發(fā)芽和根長指標，計算歐氏距離，通過類平均法，對40份資源進行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 40份綠豆資源的抗旱性聚類分析結(jié)果Fig.1 Clustering dendrogram of drought-resistance for 40 mung bean resources

從圖1可以看出，40份綠豆資源科可劃分為四大類，其中，I類包含20份綠豆資源，主要為敏旱資源；II類由13份綠豆資源構(gòu)成，主要包含一般抗旱性資源；III類涉及4份綠豆資源，抗旱水平中等；IV類為抗旱性材料，包含LD16、LD28和LD40，其中較對照抗旱性強的LD16和LD28資源均來源于吉林省。

2.5 PEG脅迫對綠豆資源MDA和可溶性蛋白含量的影響

MDA作為膜脂過氧化產(chǎn)物，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性，大量積累會對綠豆芽苗造成損傷[32]。15% PEG處理后，各綠豆資源的MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢，且40份綠豆資源的增長比例差異性顯著。從圖2可以看出，干旱處理后，LD20的MDA含量顯著性上升，增加至對照的1 037倍，LD17的MDA含量上升455倍，其余資源的MDA含量增加量集中在20倍以內(nèi)?？扇苄缘鞍资侵参飸?yīng)對滲透脅迫的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)[23]，它們的增加和積累能提高細胞的保水能力，對細胞的生命物質(zhì)以及生物膜起到保護作用，因此，經(jīng)常用作篩選抗性的指標之一。干旱脅迫6 d后，LD09的可溶性蛋白含量上升至對照的18倍，增幅顯著性高于其他資源，LD38的可溶性蛋白含量變化最小，為對照的0.95倍。

圖2 PEG處理后40份綠豆資源的MDA和RSP含量Fig.2 MDA and RSP contents of 40 mung bean resources after PEG treatment

3 結(jié)論與討論

干旱脅迫作為旱區(qū)綠豆種植的限制因子，利用不同濃度PEG模擬室內(nèi)干旱處理，成為研究不同綠豆芽期抗旱性的重要方法[13]。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均體現(xiàn)了種子的活力，種子的質(zhì)量會直接影響生育期抗旱性，可溶性蛋白的增加能夠提高細胞的保水能力，可對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用。因此，常作為篩選抗性的指標，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，MDA從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，從而使之喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松弛，或抑制蛋白質(zhì)的合成。因此，MDA的積累可能對膜和細胞造成一定的傷害?？赏ㄟ^MDA的含量反映膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。綜合這些指標能夠?qū)?0份綠豆資源做出抗旱性評價。

作物種子萌發(fā)期的抗旱性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，是會受到多種因素的協(xié)同作用，作物的單項指標對抗旱性的評價貢獻是不同的，鑒于作物抗旱性的復(fù)雜度，單一指標不能客觀反映各綠豆資源的抗旱性[20,33]，因此，需要結(jié)合統(tǒng)計方法來對其抗旱性進行綜合性評價。作物抗旱性評價方法常用的隸屬函數(shù)、主成分分析、聚類分析和灰色關(guān)聯(lián)分析等方法進行綜合評價,本研究利用變異系數(shù)相關(guān)分析, 發(fā)現(xiàn)發(fā)芽勢、相對活力指數(shù)、MDA和可溶性蛋白含量可作為萌發(fā)期抗旱性鑒定的重要指標。基于6個發(fā)芽相關(guān)指標進行聚類分析和隸屬函數(shù)計算，最終得到40份綠豆資源的抗旱性綜合排名。各綠豆資源單一指標反映的抗旱性和綜合抗旱性差異明顯，排名第一的綠豆資源LD28在干旱處理后，發(fā)芽率100%，鮮質(zhì)量0.495 g/粒，均大于對照，但是其胚根長僅占對照的19.84%，說明該資源在15% PEG 6000處理下，胚根伸長受阻，但種子吸水能力加強，根系活力旺盛，隸屬函數(shù)法得出的抗旱評級與抗旱表型結(jié)果基本一致，和聚類分析結(jié)果也相對一致，說明利用隸屬函數(shù)法對多指標進行綜合分析，抗旱性鑒定的結(jié)果可靠性更高[34]。

大量研究表明，干旱處理后，抗旱植物的MDA含量上升幅度小，不抗旱植物的MDA積累，同時可溶性蛋白在脅迫處理一定階段大量產(chǎn)生[35-36]。本研究中，綠豆資源LD14、LD16、LD28和LD40的抗旱性最高，除LD16的MDA相對增加43.69倍，其余3份抗旱性資源的MDA含量升幅均在10倍內(nèi)。LD20的抗旱性綜合排名最低，MDA含量上升1 000多倍，但是部分材料的MDA含量變化無明顯規(guī)律，同時4份抗旱綠豆資源的可溶性蛋白含量相對上升2.68～6.11倍，低于40份綠豆資源的平均值7.25倍，其他材料的可溶性蛋白含量與其抗旱性排名差異較大，該結(jié)果可能與脅迫處理的濃度、時間、各綠豆資源的物質(zhì)產(chǎn)生及積累特性有關(guān)。因此，將本研究中的MDA和可溶性蛋白僅單獨分析，未合并計算隸屬函數(shù)值。

本研究結(jié)果表明，在15% PEG 6000濃度脅迫下，40份綠豆資源表現(xiàn)的抗旱性差異明顯。RGP和RVI的變異系數(shù)均達到69%，是發(fā)芽指標中篩選抗旱性資源的優(yōu)良指標。綜合RGR、RGP、RGI、RRL、RVI和RFW指標，利用隸屬函數(shù)法及類平均法系統(tǒng)聚類，以MDA和可溶性蛋白含量變化為輔助指標，最終將40份綠豆資源按照抗旱性不同綜合評分，并分為4類，研究結(jié)果為綠豆的抗旱性育種奠定了理論和資源基礎(chǔ)。