周文婧 曾文鋒 遲 浩** 賀思敏**

（1）中國科學(xué)院智能信息處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院計(jì)算技術(shù)研究所，北京 100190；2）中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

1 蛋白質(zhì)組學(xué)與質(zhì)譜分析

蛋白質(zhì)組學(xué)以特定時(shí)空下的一組蛋白質(zhì)為對(duì)象來研究基因和細(xì)胞的功能，質(zhì)譜分析是蛋白質(zhì)組學(xué)的常用手段［1］。在常規(guī)的自底向上的蛋白質(zhì)組學(xué)中，生物樣品中的蛋白質(zhì)首先酶切為肽段，經(jīng)過色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜，進(jìn)行質(zhì)量分析和檢測，得到一級(jí)譜圖。隨后，質(zhì)譜儀會(huì)從一級(jí)譜圖中選取高豐度肽段信號(hào)進(jìn)行碎裂，并采集二級(jí)譜圖。一級(jí)譜圖和二級(jí)譜圖構(gòu)成了串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，其包含三維信息：肽段離子的質(zhì)荷比、強(qiáng)度和保留時(shí)間。質(zhì)譜分析是指從串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中解析出生物樣品包含的肽段和蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解析結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究至關(guān)重要。質(zhì)譜數(shù)據(jù)中鑒定的肽段可以作為蛋白質(zhì)存在的直接證據(jù)，進(jìn)而證明基因表達(dá)活動(dòng)［2-4］；同時(shí)，鑒定的肽段，特別是交聯(lián)肽段，能夠幫助解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，研究蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系［4-6］；更重要的是，作為基因的直接表達(dá)產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量的上下波動(dòng)可以幫助發(fā)現(xiàn)致病基因及研制具有相應(yīng)靶向作用的藥物［7-9］。常用的質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析方法有數(shù)據(jù)庫搜索［10-12］、肽段從頭測序［13-16］和譜庫搜索［17-18］等。得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)的初步解析結(jié)果后，需要對(duì)譜圖和肽段層次的解析結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，即控制解析結(jié)果的錯(cuò)誤率。這一過程也被稱為過濾，即通過控制鑒定結(jié)果的錯(cuò)誤率范圍，過濾掉不可信鑒定結(jié)果，最終報(bào)告出可信結(jié)果。經(jīng)過譜圖和肽段層面的質(zhì)量控制后，可以基于可信肽段推斷蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)層面的質(zhì)量控制，最終得到高可信蛋白質(zhì)并進(jìn)行下游生物學(xué)研究［19-22］。

然而，在目前的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定到的肽段和蛋白質(zhì)的可信度可能仍然存在較大問題。造成錯(cuò)誤鑒定的原因繁多，數(shù)據(jù)庫不完整，單核苷酸突變，酶切位點(diǎn)、電荷、修飾類型、修飾位點(diǎn)的錯(cuò)誤判斷以及同位素峰的誤匹配都可能造成錯(cuò)誤鑒定［23-24］。如果對(duì)鑒定的肽段和蛋白質(zhì)不進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，會(huì)嚴(yán)重影響鑒定結(jié)果的可信度。2014年Kim等［2］和Wilhelm等［3］在《自然》（Nature）雜志同期發(fā)表了兩項(xiàng)人類蛋白質(zhì)組草圖研究結(jié)果，是人類蛋白質(zhì)組研究的里程碑。兩篇文章均構(gòu)建和使用了自定義的質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析流程，分別鑒定得到17 294和18 097個(gè)人類基因，覆蓋了人類基因組的84%和92%。然而，兩篇草圖文章的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和鑒定結(jié)果公開后，領(lǐng)域?qū)Σ輬D文章鑒定結(jié)果的可信度產(chǎn)生了質(zhì)疑［25-27］。首先，人類蛋白質(zhì)組草圖研究中蛋白質(zhì)的推斷標(biāo)準(zhǔn)不嚴(yán)格，僅由單肽段鑒定的蛋白質(zhì)也被保留，如果不考慮這部分結(jié)果，那么Kim等的文章會(huì)有5 288個(gè)基因被排除，而Wilhelm文章中也有1 259個(gè)僅由單肽段鑒定的蛋白質(zhì)不能計(jì)入最終鑒定結(jié)果（未提供基因數(shù)目）［26］。另外，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度都存在問題。最為明顯的錯(cuò)誤是，兩篇人類蛋白質(zhì)草圖文章都未制備嗅覺組織樣品，但分別鑒定到了108個(gè)和200個(gè)嗅覺組織所特有的嗅覺受體蛋白質(zhì)［25］，而嗅覺受體蛋白是一種跨膜蛋白，只能在鼻黏膜組織中才能鑒定到［28］。此外，本應(yīng)普遍出現(xiàn)的3種細(xì)胞受體因子的表達(dá)模式?jīng)]有在草圖中得到鑒定，說明草圖還遠(yuǎn)未達(dá)到完整［27］。低可信度的鑒定結(jié)果會(huì)影響后續(xù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能、相互作用關(guān)系和致病機(jī)理等的研究，所以對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果進(jìn)行可信度評(píng)價(jià)極為關(guān)鍵。肽段的可信度是蛋白質(zhì)可信度評(píng)價(jià)方法的前提和基礎(chǔ)，領(lǐng)域內(nèi)對(duì)于肽段的可信度評(píng)價(jià)方法研究更久更成熟，所以本文將重點(diǎn)對(duì)肽段的可信度評(píng)價(jià)方法進(jìn)行綜述。

肽段鑒定可信度評(píng)價(jià)方法歷經(jīng)了多次發(fā)展，早期主要使用基于閾值的評(píng)價(jià)方法，包括設(shè)定搜索引擎打分閾值、P-value和E-value等。設(shè)定搜索引擎打分閾值的方法是指對(duì)于搜索引擎給出的所有鑒定結(jié)果，將打分高于某特定閾值的結(jié)果認(rèn)為是可信鑒定結(jié)果，打分低于特定閾值的結(jié)果認(rèn)為是不可信鑒定結(jié)果［29-30］，比如有研究認(rèn)為Mascot引擎打分超過30分的結(jié)果為可信鑒定結(jié)果［30］。這種設(shè)定打分閾值的方法使用簡便，但是打分閾值的設(shè)定極大依賴于人工經(jīng)驗(yàn)。P-value（x）是指在給定譜圖的情況下，隨機(jī)匹配打分大于x的概率［31］，E-value（x）是指在給定譜圖和數(shù)據(jù)庫的情況下，隨機(jī)匹配打分大于x的肽段數(shù)目的期望［31］。這兩者的關(guān)系為E-value（x）=n×P-value（x），其中n為候選肽段數(shù)目。P-value和E-value讓不同搜索引擎的鑒定結(jié)果的可信度變得可比，但是和打分閾值方法一樣，P-value和E-value的閾值同樣也依靠人工經(jīng)驗(yàn)。

2002年，Keller和Nesvizhskii等［32］提出了基于貝葉斯公式的質(zhì)量控制方法PeptideProphet，將概率模型引入肽段可信度評(píng)價(jià)方法。PeptideProphet方法認(rèn)為正確肽段的打分服從高斯分布，錯(cuò)誤肽段的打分服從伽馬分布，并且對(duì)特異酶切位點(diǎn)數(shù)目不同和電荷數(shù)目不同的肽段分別擬合分布，估算每個(gè)肽段-譜圖匹配是正確匹配的概率。為了適應(yīng)不同的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)，可以在以上分布的基礎(chǔ)上，采用期望最大化方法（expectation maximization，EM）構(gòu)建混合模型，不斷迭代擬合正確和錯(cuò)誤鑒定結(jié)果的分布。后續(xù)10年間，PeptideProphet衍生出了一系列方法。2003年，Nesvizhskii等［33］在PeptideProphet的基礎(chǔ)上提出了評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)可信度的ProteinProphet方法，該方法認(rèn)為蛋白質(zhì)存在的概率可以通過該蛋白質(zhì)鑒定的肽段至少有一條是正確的概率來估算。2007年，該團(tuán)隊(duì)提出了基于PeptideProphet的半監(jiān)督模型［34］，將部分誘餌庫鑒定結(jié)果用于EM訓(xùn)練中。隨后，該團(tuán)隊(duì)提出了可變成分混合模型和半?yún)?shù)混合模型兩種方法［35］，打破了PeptideProphet混合模型中限制參數(shù)估計(jì)的假設(shè)。2008年，該團(tuán)隊(duì)提出生成模型方法［36］，首先對(duì)譜圖進(jìn)行聚類，每一類估計(jì)一個(gè)混合模型。同時(shí)，對(duì)每張譜圖的前10名候選肽段均計(jì)算PeptideProphet概率，并根據(jù)概率重新排列這些候選肽段的順序。2011年，為了能夠利用多種搜索引擎的特性，鑒定更多和更可信的肽段和蛋白質(zhì)，該團(tuán)隊(duì)提出iProphet［37］，在PeptideProphet的基礎(chǔ)上，結(jié)合重復(fù)實(shí)驗(yàn)鑒定情況、重復(fù)引擎鑒定情況、重復(fù)譜圖、重復(fù)母離子和重復(fù)修飾等特征，能夠合并多種搜索引擎和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得到更好的混合模型。PeptideProphet方法經(jīng)歷了長久發(fā)展，在標(biāo)注數(shù)據(jù)集上能取得較好的擬合效果，但該方法依賴于估計(jì)的數(shù)據(jù)分布與真實(shí)數(shù)據(jù)分布的相似程度，而且EM方法可能需要耗費(fèi)較多的訓(xùn)練輪次和訓(xùn)練時(shí)間。

2007年，Elias和Gygi［19］總結(jié)并評(píng)測了Moore等提出的目標(biāo)-誘餌庫方法（target-decoy approach，TDA）［38-40］，通過估計(jì)假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR），對(duì)鑒定的肽段的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)。FDR是對(duì)真實(shí)錯(cuò)誤率的一種估計(jì)，通常只將FDR小于等于1%的鑒定結(jié)果作為可信結(jié)果。由于TDA方法公式簡單、使用簡便，它逐漸成為質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析過程中最主流的質(zhì)量控制方法，并在子類肽段（包括一般子類肽段、突變肽段和修飾肽段等）和交聯(lián)肽段等特殊鑒定目標(biāo)的可信度評(píng)價(jià)中進(jìn)行了衍生和演化。本文將在第二節(jié)中重點(diǎn)講述TDA常規(guī)方法及其特殊演化方法在蛋白質(zhì)組學(xué)肽段鑒定可信度評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

本文綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定的肽段的可信度評(píng)價(jià)方法。第一節(jié)講述蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)制備及數(shù)據(jù)分析方法，同時(shí)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果的可信度問題以及早期的肽段鑒定可信度評(píng)價(jià)方法進(jìn)行闡述。第二節(jié)首先講述評(píng)價(jià)肽段可信度的TDA常規(guī)方法，然后講述在子類肽段和交聯(lián)肽段等特殊鑒定目標(biāo)中的TDA演化方法，最后講述TDA方法的局限。第三節(jié)首先介紹肽段可信度評(píng)價(jià)方法的統(tǒng)一衡量指標(biāo)——檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率，然后綜述領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)有的Beyond-TDA方法，即在TDA方法的基礎(chǔ)上，對(duì)鑒定結(jié)果的可信度進(jìn)行進(jìn)一步檢驗(yàn)，并對(duì)它們的檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率進(jìn)行比較。第四節(jié)對(duì)全文內(nèi)容進(jìn)行總結(jié)。

2 目標(biāo)-誘餌庫方法（TDA）

隨著質(zhì)譜采集技術(shù)的快速進(jìn)步和鑒定軟件的蓬勃發(fā)展，一次質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)分析即可獲取海量的肽段-譜圖匹配結(jié)果，這些鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)后續(xù)生物分析至關(guān)重要。TDA（圖1）可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鑒定結(jié)果可信度的快速和相對(duì)準(zhǔn)確地評(píng)估。本節(jié)將對(duì)TDA常規(guī)方法、特殊方法以及TDA方法的局限性進(jìn)行詳細(xì)闡述。

Fig. 1 Target-decoy approach圖1 目標(biāo)-誘餌庫方法

2.1 常規(guī)方法

TDA方法通過構(gòu)造誘餌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（以下簡稱“誘餌庫”）對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。誘餌庫的構(gòu)建方式主要有4種：蛋白質(zhì)序列反轉(zhuǎn)［38-39］、肽段序列反轉(zhuǎn)［19］、氨基酸隨機(jī)置換［19］和馬爾可夫方法［41］。蛋白質(zhì)序列反轉(zhuǎn)是將目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（以下簡稱“目標(biāo)庫”）的每個(gè)蛋白質(zhì)序列整體進(jìn)行N-C端方向反轉(zhuǎn)，肽段反轉(zhuǎn)是指將目標(biāo)庫蛋白質(zhì)理論酶切后生成的所有肽段序列反轉(zhuǎn)，隨機(jī)置換是指將目標(biāo)庫蛋白質(zhì)理論酶切后生成的所有肽段序列中的每個(gè)氨基酸與序列中的其他氨基酸的位置進(jìn)行隨機(jī)置換，馬爾可夫方法是使用馬爾可夫鏈從目標(biāo)庫學(xué)習(xí)到氨基酸分布規(guī)律，然后根據(jù)氨基酸分布規(guī)律構(gòu)建誘餌庫。前兩種方法本質(zhì)都是序列反轉(zhuǎn)，后兩種方法本質(zhì)都是序列隨機(jī)化。這4種方法均是為了構(gòu)造與目標(biāo)庫同規(guī)模且同氨基酸分布的誘餌庫。其中，蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)的方法最為常用。有研究表明，誘餌庫構(gòu)建方法對(duì)最終結(jié)果沒有顯著影響［42-43］，但是可以通過隨機(jī)置換的方法生成多種隨機(jī)庫分別估計(jì)FDR后取平均值作為最終的FDR估計(jì)值，這樣估計(jì)的FDR更接近真實(shí)錯(cuò)誤率［44-46］。

TDA方法應(yīng)用的前提是假設(shè)一次錯(cuò)誤匹配結(jié)果（Elias和Gygi的文章描述為incorrect result，具體是指錯(cuò)誤匹配中的隨機(jī)匹配）匹配到目標(biāo)庫和誘餌庫的概率是相等的。在此基礎(chǔ)上，該假設(shè)通過匹配到的誘餌庫鑒定結(jié)果的數(shù)目ND來估計(jì)目標(biāo)庫鑒定結(jié)果中的錯(cuò)誤鑒定結(jié)果數(shù)目，用目標(biāo)庫錯(cuò)誤鑒定結(jié)果數(shù)目比上所有的目標(biāo)庫鑒定結(jié)果數(shù)目NT，就可以計(jì)算出目標(biāo)庫鑒定結(jié)果中的假發(fā)現(xiàn)率（FDR）：

TDA假設(shè)簡單，實(shí)現(xiàn)方便，而且能對(duì)鑒定結(jié)果的可信度做出簡單評(píng)估，具有相對(duì)合理性，比如FDR越小，過濾時(shí)的打分閾值越高，鑒定結(jié)果越可信。由于FDR并不隨著鑒定結(jié)果打分的降低而單調(diào)遞增，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)出現(xiàn)鑒定結(jié)果高打分區(qū)域的FDR高于低打分區(qū)域的FDR，這樣會(huì)影響根據(jù)FDR閾值進(jìn)行過濾的實(shí)際操作。為了解決這個(gè)問題，在實(shí)際應(yīng)用中通常使用q-value來替代FDR。q-value是指能過濾出打分為x的肽譜匹配結(jié)果所需要的FDR閾值的最小值［47］，相當(dāng)于對(duì)FDR做了平滑操作，后續(xù)提到的FDR均指q-value。本文將采用TDA估計(jì)FDR進(jìn)而對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制的方法稱為“TDA-FDR”方法。

由于前述TDA-FDR方法不能評(píng)估單個(gè)鑒定結(jié)果的后驗(yàn)錯(cuò)誤概率（posterior error probability，PEP），Local FDR方法逐漸得到發(fā)展和應(yīng)用［34，48-49］。LocalFDR是指打分等于x的鑒定結(jié)果中誘餌庫鑒定結(jié)果和目標(biāo)庫鑒定結(jié)果的比例，而前述FDR是指全局FDR，即打分大于等于x的鑒定結(jié)果中誘餌庫鑒定結(jié)果和目標(biāo)庫鑒定結(jié)果的比例。Kall等［48］的研究認(rèn)為，在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，LocalFDR比FDR和q-value更保守。

質(zhì)譜分析會(huì)給出每張譜圖所對(duì)應(yīng)的肽段信息，每個(gè)鑒定結(jié)果就是一個(gè)肽段-譜圖匹配（peptidespectrum match，PSM），由PSM可以得到肽段，而由肽段又可以推斷出鑒定到的蛋白質(zhì)，所以質(zhì)譜鑒定結(jié)果包含譜圖、肽段和蛋白質(zhì)3個(gè)層面的鑒定信息。相應(yīng)地，譜圖、肽段和蛋白質(zhì)3個(gè)層面均可估計(jì)各自的FDR。這3個(gè)層面的FDR估計(jì)基本方法均是通過當(dāng)前打分閾值下的誘餌庫鑒定結(jié)果（譜圖/肽段/蛋白質(zhì)）數(shù)目除以目標(biāo)庫鑒定結(jié)果數(shù)目。人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃（Human Proteome Project，HPP）要求質(zhì)譜分析中譜圖、肽段和蛋白質(zhì)3個(gè)層面的FDR均不能超過1%［50-51］。

2.2 特殊方法

TDA-FDR方法萌發(fā)于常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)，但蛋白質(zhì)組學(xué)分析中常常會(huì)對(duì)某些特殊的鑒定結(jié)果感興趣，比如子類肽段和交聯(lián)肽段等，常規(guī)的TDAFDR方法并不能直接用于特殊鑒定結(jié)果的可信度評(píng)價(jià)，需要針對(duì)特殊目標(biāo)進(jìn)行改進(jìn)和演化。

2.2.1 針對(duì)子類肽段的TDA-FDR方法

對(duì)于某些子類鑒定結(jié)果，比如蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析在注釋相對(duì)完全的物種中鑒定到的新肽段，或者富含翻譯后修飾的鑒定結(jié)果，由于這些子類鑒定結(jié)果的數(shù)目相對(duì)于總的鑒定結(jié)果而言并不多，而這些子類肽段的搜索空間比常規(guī)肽段的搜索空間更大［52］，如果所有鑒定結(jié)果合并進(jìn)行過濾會(huì)導(dǎo)致子類鑒定結(jié)果的FDR估計(jì)不準(zhǔn)確［4，52-54］。所以，需要對(duì)每種子類鑒定結(jié)果單獨(dú)計(jì)算FDR，即分開過濾，這種方法被稱為“Separate FDR”，核心思想是對(duì)于鑒定結(jié)果按數(shù)據(jù)類型分組（鑒定到不同種類的翻譯后修飾或者鑒定為新肽段或已注釋肽段），在每組數(shù)據(jù)上單獨(dú)使用TDA來估計(jì)組內(nèi)數(shù)據(jù)的FDR并對(duì)組內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。Separate FDR方法計(jì)算公式如下：

其中k代表肽段類別，F(xiàn)DRk代表第k類肽段的FDR，ND_k代表第k類誘餌庫肽段鑒定數(shù)目，NT_k代表第k類目標(biāo)庫肽段鑒定數(shù)目。這種方法可以更準(zhǔn)確地估計(jì)每類肽段的FDR，但是對(duì)于子類肽段數(shù)目比較敏感。當(dāng)子類肽段數(shù)目較少時(shí)，計(jì)算的FDR可能并不準(zhǔn)確。

李婧等［55］發(fā)現(xiàn)，對(duì)于突變肽段這種子類鑒定結(jié)果，即使采用Separate FDR方法，也不能有效解決突變肽段打分向低分區(qū)域聚攏的問題（即鑒定到的突變肽段不可信），她們認(rèn)為子類數(shù)據(jù)中鑒定到的誘餌庫結(jié)果可能與該子類數(shù)據(jù)占總體數(shù)據(jù)的比例有關(guān)，所以根據(jù)鑒定結(jié)果中的子類數(shù)據(jù)與總體數(shù)據(jù)的比例重新估計(jì)子類數(shù)據(jù)中的誘餌庫鑒定結(jié)果數(shù)目，在此基礎(chǔ)上重新估計(jì)子類數(shù)據(jù)的FDR。由于該方法最早用于估計(jì)突變肽段的FDR，所以稱該方法為“Variant FDR”，計(jì)算公式如下：

其中k代表肽段類別，F(xiàn)DRk+代表打分閾值之上的第k類肽段的FDR，ND+代表打分閾值之上的所有誘餌庫肽段數(shù)目，ND-代表打分閾值之下的所有誘餌庫肽段數(shù)目，ND-_k代表打分閾值之下的第k類誘餌庫肽段數(shù)目，NT+_k代表打分閾值之上的第k類目標(biāo)庫肽段數(shù)目?；蚪M證據(jù)表明，Variant FDR方法比常規(guī)TDA-FDR和Separate FDR過濾出的突變肽段的準(zhǔn)確性更高。

當(dāng)子類鑒定結(jié)果樣本量較小時(shí)，即使是分開過濾，直接使用TDA公式計(jì)算得到的FDR可能并不準(zhǔn)確，此時(shí)可以使用Transfer FDR方法估計(jì)任意數(shù)目的子類鑒定結(jié)果的FDR。該方法由付巖等［56］提出，通過線性擬合誘餌匹配中子類肽段比例與打分間的函數(shù)關(guān)系，更準(zhǔn)確地估計(jì)打分閾值處的子類錯(cuò)誤目標(biāo)匹配數(shù)量，以此估計(jì)子類數(shù)據(jù)的FDR，避免子類數(shù)據(jù)樣本數(shù)目較少帶來的FDR估計(jì)不準(zhǔn)確的問題。Transfer FDR的計(jì)算公式如下：

其中k為肽段類別，F(xiàn)DRk為第k類肽段的FDR，x代表肽段打分，N(x)代表打分超過x的所有肽段數(shù)目，Nk(x)代表打分超過x的第k類肽段數(shù)目，a和b代表線性擬合常數(shù)項(xiàng)，F(xiàn)DR代表所有肽段的全局FDR。

分開過濾的思想可以很自然地應(yīng)用于蛋白質(zhì)基因組學(xué)鑒定的新肽段和已注釋肽段的可信度評(píng)價(jià)中。蛋白質(zhì)基因組學(xué)是通過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定蛋白質(zhì)，結(jié)合基因組信息對(duì)生物的基因進(jìn)行重注釋，即發(fā)現(xiàn)新基因、新現(xiàn)象（比如新N端、可變剪接）和校正已注釋基因，對(duì)應(yīng)到質(zhì)譜分析中主要為發(fā)現(xiàn)新肽段和校正已注釋肽段［4，54，57］。Krug等［58］研究表明，對(duì)于大腸桿菌等注釋程度較高的物種，鑒定到的新肽段的后驗(yàn)錯(cuò)誤概率分布與誘餌庫肽段的后驗(yàn)概率分布幾乎相同，所以蛋白質(zhì)基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)新肽段需要進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控。如果對(duì)新肽段單獨(dú)估計(jì)FDR，可能會(huì)因?yàn)樽⑨尦潭容^高的物種中新肽段數(shù)目較少而導(dǎo)致估計(jì)值不夠準(zhǔn)確；而如果對(duì)新肽段和已注釋肽段統(tǒng)一進(jìn)行FDR估計(jì)，則會(huì)降低新肽段的準(zhǔn)確度。Zhang等［54］將分開過濾的思想應(yīng)用到蛋白質(zhì)基因組學(xué)中，推導(dǎo)了已注釋肽段和新肽段的FDR與全局FDR的關(guān)系，并證明了已注釋肽段的FDR小于全局FDR小于新肽段FDR［59］，這兩類肽段的FDR計(jì)算公式如下所示：

公式（5）和公式（6）中，F(xiàn)DRnew(x)和FDRann(x)分別代表打分高于x的新肽段和已注釋肽段的FDR，μ指基因組序列注釋比例，θ指基因注釋完整性比例?；蚪M序列注釋比例是指已注釋基因總長占基因組長度的比值，基因注釋完整性比例是指已注釋基因占基因組上所有真實(shí)表達(dá)基因的長度比例。這兩個(gè)變量中，μ可以直接計(jì)算得到，但很遺憾的是，θ是未知量，無法得知，所以無法通過以上公式精確計(jì)算兩類肽段的FDR。但是通過μ與θ的關(guān)系（由定義可知，μ≤θ且θ＞0）可以從公式（5）和公式（6）中推導(dǎo)出FDRnew(x)＞FDR(x)＞FDRann(x)［59］。

為了更精準(zhǔn)地計(jì)算出兩類肽段的FDR，張昆［59］又將Transfer FDR方法應(yīng)用到蛋白質(zhì)基因組學(xué)中，通過線性擬合的方法重新估計(jì)新肽段中的錯(cuò)誤鑒定數(shù)目，單獨(dú)計(jì)算釀酒酵母蛋白質(zhì)基因組學(xué)分析中鑒定到新肽段的FDR（方法同公式（4））。酵母新肽段中的合成實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)基因組學(xué)中，Transfer FDR方法比Separate FDR方法估計(jì)的新肽段FDR更準(zhǔn)確。

2.2.2 針對(duì)交聯(lián)肽段的TDA-FDR方法

交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)（這里特指二肽交聯(lián)）質(zhì)譜數(shù)據(jù)由兩條相互交聯(lián)的肽段碎裂打譜得到，與常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定肽段結(jié)果非對(duì)即錯(cuò)相比，交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定得到的是兩條相互交聯(lián)的肽段，它們存在全對(duì)、全錯(cuò)、一對(duì)一錯(cuò)這3種情況，這使得FDR的計(jì)算方式變?yōu)?/p>

其中，NTD代表交聯(lián)肽段一條來自目標(biāo)庫，而另一條來自誘餌庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，NDD代表交聯(lián)肽段中兩條肽段均來自誘餌庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，NTT代表交聯(lián)肽段中兩條肽段均來自目標(biāo)庫的鑒定結(jié)果數(shù)目［6，60］。在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于不同蛋白質(zhì)之間（inter-protein）和同一蛋白質(zhì)之內(nèi)（intra-protein）這兩類交聯(lián)肽段要應(yīng)用公式（7）分別計(jì)算FDR，這里也應(yīng)用了分開過濾的思想［60-61］。

糖基化修飾是一種特殊的修飾，糖蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定的糖肽可以看作是特殊的修飾肽段，但由于糖鏈的特殊性，不妨將糖肽看作糖鏈和肽段的交聯(lián)，類似于交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)中的交聯(lián)二肽。早期計(jì)算糖肽鑒定結(jié)果的FDR比較困難，因?yàn)殡y以對(duì)糖鏈構(gòu)建誘餌庫，所以無法直接估計(jì)糖鏈的FDR，僅通過估計(jì)肽段的FDR進(jìn)行質(zhì)控。2013年，Strum等［62］提出糖不變而蛋白質(zhì)隨機(jī)置換以及糖增加11 u而蛋白質(zhì)不變兩種方法構(gòu)建誘餌庫，這種方法最早提出了誘餌糖庫的思想，但只是改進(jìn)打分，未對(duì)FDR進(jìn)行研究。2017年，Liu等［63］提出將糖庫中的理論Y離子質(zhì)量隨機(jī)增加1~30 u來構(gòu)造糖鏈的誘餌譜圖，作者想出該方法是受到了肽段誘餌庫的啟發(fā)，肽段誘餌庫可以通過反轉(zhuǎn)序列后生成誘餌譜圖，也可以先生成譜圖，然后譜峰偏移構(gòu)建誘餌譜圖，所以作者認(rèn)為通過偏移糖庫中的理論Y離子質(zhì)量也可以達(dá)到構(gòu)建糖鏈誘餌譜圖的效果。通過鑒定的糖鏈誘餌譜圖和肽段誘餌譜圖的數(shù)目分別估計(jì)出糖鏈和肽段的FDR，然后用容斥原理估計(jì)出糖肽的FDR：

其中FDR(x)建模了糖肽鑒定錯(cuò)誤的概率，F(xiàn)DRG(x)建模了糖鏈鑒定錯(cuò)誤的概率，F(xiàn)DRP(x)建模了肽段鑒定錯(cuò)誤的概率，F(xiàn)DRG∩P(x)建模了糖鏈和肽段同時(shí)鑒定錯(cuò)誤的概率。

公式（7）與公式（8）形式上似乎差異很大，但實(shí)際上只是同種計(jì)算方法的不同呈現(xiàn)形式。前面提到可以將糖肽看作是糖鏈與肽段的交聯(lián)，同時(shí)假設(shè)糖鏈和肽段各自的誘餌庫鑒定結(jié)果數(shù)目與錯(cuò)誤鑒定結(jié)果數(shù)目的比例是相等的，那么如果以NTD代表糖鏈和肽段其中一個(gè)來自目標(biāo)庫而另一個(gè)來自誘餌庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，N”TD代表糖鏈來自目標(biāo)庫而肽段來自誘餌庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，N”DT代表糖鏈來自誘餌庫而肽段來自目標(biāo)庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，NDD代表糖鏈和肽段均來自誘餌庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，NTT代表糖鏈和肽段均來自目標(biāo)庫的鑒定結(jié)果數(shù)目，可知有NTD=N”TD+N”DT，那么公式（8）可以變?yōu)椋?/p>

從而得到與公式（7）相同的計(jì)算公式［64］。所以，交聯(lián)鑒定和糖肽鑒定中的TDA-FDR方法本質(zhì)上是相同的。

2.2.3 針對(duì)蛋白質(zhì)層面的TDA-FDR方法

質(zhì)譜分析的終極目標(biāo)是鑒定蛋白質(zhì)。由譜圖可以鑒定出肽段，進(jìn)而推斷出蛋白質(zhì)，但這個(gè)向上遞推的過程會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果逐漸積累［65-66］。例如，第一節(jié)提到的兩篇人類蛋白質(zhì)組草圖研究中報(bào)告了多種錯(cuò)誤蛋白質(zhì)，其主要原因是這兩篇草圖文章都只對(duì)肽段的可信度進(jìn)行了質(zhì)控，沒有對(duì)蛋白質(zhì)層面做質(zhì)量控制，在肽段推斷蛋白質(zhì)時(shí)，錯(cuò)誤率得到了積累［26］。由于正確鑒定的肽段更有可能集中到相同的蛋白質(zhì)，而錯(cuò)誤鑒定的肽段則有可能分散到不同的蛋白質(zhì)，這樣就造成了從肽段推斷到蛋白質(zhì)后，蛋白質(zhì)層面的錯(cuò)誤率積累，造成蛋白質(zhì)層面的FDR較高，是肽段層面的數(shù)倍或數(shù)十倍（圖2a）。所以，從肽段推斷到蛋白質(zhì)后，還要對(duì)蛋白質(zhì)層面進(jìn)行質(zhì)量控制。蛋白質(zhì)的推斷方式影響著蛋白質(zhì)層面的質(zhì)量控制，共享肽段的分配影響著蛋白質(zhì)推斷結(jié)果。有研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)推斷需要遵循奧卡姆剃刀原則，即用最少的蛋白質(zhì)解釋所有的肽段［67］。也有研究認(rèn)為“one-hit-wonders”不可信［68-70］，需要引入雙特異肽段推斷方法，但Gupta等［71］認(rèn)為雙特異肽段推斷過于保守。人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃則明確表示鑒定遺漏蛋白質(zhì)需要不低于9個(gè)氨基酸長度的非嵌套的雙特異肽段［50-51］。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)組數(shù)據(jù)集規(guī)模較大（能鑒定數(shù)十萬條肽段）時(shí)，鑒定到的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)數(shù)目越來越多，造成新鑒定的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)和誘餌庫蛋白質(zhì)比例失衡，新鑒定的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)越來越少，新鑒定的誘餌庫蛋白質(zhì)越來越多，造成誘餌庫蛋白質(zhì)累積和蛋白質(zhì)FDR的高估。針對(duì)大數(shù)據(jù)集帶來的目標(biāo)庫和誘餌庫蛋白質(zhì)匹配概率失衡的問題，領(lǐng)域內(nèi)目前發(fā)展了MAYU［72］和Picked FDR［73-74］等蛋白質(zhì)推斷及質(zhì)控方法。這里介紹思想最簡單、實(shí)現(xiàn)最方便又能取得較好效果的Picked FDR方法［73］，該方法將目標(biāo)庫蛋白質(zhì)及其序列反轉(zhuǎn)得到的誘餌庫蛋白質(zhì)看作一組，每組蛋白質(zhì)中如果兩個(gè)蛋白質(zhì)都被鑒定，那么只保留打分高的蛋白質(zhì)匹配，刪除打分低的蛋白質(zhì)匹配。在具體實(shí)現(xiàn)時(shí)可以將所有鑒定的蛋白質(zhì)按照打分從高到低進(jìn)行排序，對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)，如果其對(duì)應(yīng)的反轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)（目標(biāo)庫蛋白質(zhì)的反轉(zhuǎn)為誘餌蛋白質(zhì)，誘餌蛋白質(zhì)的反轉(zhuǎn)為目標(biāo)蛋白質(zhì)）已經(jīng)在前述蛋白質(zhì)列表出現(xiàn)過，那么刪除當(dāng)前蛋白質(zhì)，反之，則保留當(dāng)前蛋白質(zhì)。以圖2b為例，目標(biāo)庫蛋白質(zhì)PROTEIN 1獲得了20分，其對(duì)應(yīng)的誘餌庫蛋白質(zhì)PROTEIN 2獲得了3分，那么打分高的PROTEIN 1被保留，打分低的PROTEIN 2被刪除，不再參與后續(xù)蛋白質(zhì)FDR計(jì)算。同理，目標(biāo)蛋白質(zhì)PROTEIN 3獲得了15分，其對(duì)應(yīng)的誘餌庫蛋白質(zhì)PROTEIN 4獲得了18分，那么打分高的PROTEIN 4被保留，打分低的PROTEIN 3被刪除。通過這種方法能夠解決低打分區(qū)域鑒定到的目標(biāo)庫和誘餌庫蛋白質(zhì)數(shù)目不平衡的問題，使得TDA的1∶1假設(shè)在蛋白質(zhì)層面得到滿足，從而得到更準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)FDR。Percolator 3.0文章中對(duì)Picked FDR方法進(jìn)行了檢驗(yàn)和肯定［75］。在Picked FDR原理基礎(chǔ)上，Prieto等［74］認(rèn)為，誘餌庫蛋白質(zhì)的打分是無意義的，不應(yīng)該刪除比誘餌庫蛋白質(zhì)打分低的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)。所以，他們對(duì)Picked FDR方法做了改進(jìn)，即對(duì)于打分低于目標(biāo)庫的誘餌庫蛋白質(zhì)予以刪除，但對(duì)于打分低于誘餌庫的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)予以保留。Prieto等認(rèn)為改進(jìn)的Picked FDR方法能夠在保持與原Picked FDR方法相當(dāng)?shù)撵`敏度的情況下，保留更多的高分蛋白質(zhì)。

Fig. 2 Protein inference and protein level quality control圖2 蛋白質(zhì)推斷與質(zhì)量控制

2.3 TDA-FDR方法的局限

TDA-FDR方法簡單易用，并且能在子類肽段和交聯(lián)肽段等特殊鑒定任務(wù)中演化出更合適的版本，但是該方法還存在兩個(gè)局限。a. TDA-FDR方法估計(jì)的準(zhǔn)確度有待考究。領(lǐng)域內(nèi)普遍認(rèn)為，目標(biāo)庫中的錯(cuò)誤鑒定結(jié)果有兩個(gè)來源：真正的隨機(jī)匹配和同源錯(cuò)誤匹配［24，76］。當(dāng)使用目標(biāo)庫序列反轉(zhuǎn)或者隨機(jī)化構(gòu)建誘餌庫序列時(shí)，TDA-FDR理論上能夠模擬出隨機(jī)匹配的分布情況，但卻無法模擬出同源錯(cuò)誤匹配情況，所以理論上TDA-FDR會(huì)低估真實(shí)的錯(cuò)誤率［66］。另外，在二次搜索等特殊場景下，TDA-FDR會(huì)嚴(yán)重低估真實(shí)錯(cuò)誤率，Jeong等［77］研究表明，在采用兩步搜索方法對(duì)酵母數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索時(shí)，TDA方法估計(jì)的FDR是真實(shí)錯(cuò)誤率的1/20。這可能是由于第二次搜索時(shí)采用第一次搜索鑒定的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)構(gòu)造蛋白質(zhì)小庫，雖然通過目標(biāo)庫蛋白質(zhì)序列反轉(zhuǎn)構(gòu)建了同等數(shù)目的誘餌庫蛋白質(zhì)，但此時(shí)的目標(biāo)庫蛋白質(zhì)比誘餌庫蛋白質(zhì)更容易獲得高分，造成TDA失衡。b. TDA-FDR方法不能對(duì)單個(gè)鑒定結(jié)果的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)。Nesvizhskii［66］認(rèn)為，TDA-FDR是全局方法，是對(duì)一組已經(jīng)獲取個(gè)體置信度分?jǐn)?shù)的鑒定結(jié)果的假發(fā)現(xiàn)率進(jìn)行的估計(jì)。鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度會(huì)影響后續(xù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、研究致病機(jī)理和靶向治療方案等工作的可行性和準(zhǔn)確性。所以還需要在TDA-FDR方法的基礎(chǔ)上，使用更嚴(yán)格的可信度評(píng)價(jià)方法，保證鑒定結(jié)果可以用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能分析，這也是下一節(jié)提到的Beyond-TDA方法的由來。

3 Beyond-TDA方法

造成錯(cuò)誤匹配的因素眾多，搜索空間［12］、碎片離子強(qiáng)度［45，76］和與實(shí)驗(yàn)參數(shù)相關(guān)的信息，如母離子誤差、保留時(shí)間、酶切特異端點(diǎn)和遺漏酶切位點(diǎn)數(shù)目等［66］，都能幫助區(qū)分正確和錯(cuò)誤鑒定結(jié)果。因此，在TDA方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合前述有效信息，可以進(jìn)一步檢驗(yàn)鑒定結(jié)果可信度。本文將這類方法統(tǒng)稱為Beyond-TDA方法，即在TDA-FDR方法的基礎(chǔ)上，對(duì)鑒定結(jié)果的可信度做進(jìn)一步檢驗(yàn)。我們認(rèn)為“評(píng)價(jià)”包含對(duì)群體鑒定可信度的評(píng)價(jià)（如TDA-FDR）和對(duì)個(gè)體鑒定可信度的評(píng)價(jià)，而本章介紹的Beyond-TDA方法均是對(duì)個(gè)體可信度的評(píng)價(jià)，即檢驗(yàn)每個(gè)鑒定結(jié)果的正確性，所以我們又將其稱為可信度檢驗(yàn)方法。Beyond-TDA方法根據(jù)其使用的有效信息可以分為4類：a. 基于搜索空間的方法，包括陷阱庫檢驗(yàn)和開放式搜索檢驗(yàn)；b. 基于譜圖相似性的方法，包括合成肽段檢驗(yàn)和理論譜圖預(yù)測；c. 基于化學(xué)信息的方法，包括保留時(shí)間預(yù)測和同位素標(biāo)記檢驗(yàn)；d. 基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，包括Percolator、pValid和DeepRescore等。

3.1 可信度檢驗(yàn)方法的兩個(gè)衡量指標(biāo)

肽段鑒定可信度檢驗(yàn)方法通常會(huì)給肽段的可信度進(jìn)行打分，根據(jù)打分高低衡量不同肽段的可信程度。但是，在應(yīng)用這些方法之前需要首先評(píng)估它們的檢驗(yàn)?zāi)芰Γ瑱z驗(yàn)假陽率（false positive rate，F(xiàn)PR）和檢驗(yàn)假陰率（false negative rate，F(xiàn)NR）就是這樣兩個(gè)衡量指標(biāo)。在本文中，檢驗(yàn)的目標(biāo)就是為了發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤鑒定結(jié)果，類似于臨床中診斷疾病，患該疾病則為陽性，反之為陰性。所以本文將檢驗(yàn)結(jié)果呈陽性定義為檢驗(yàn)方法判斷鑒定結(jié)果為錯(cuò)誤鑒定，檢驗(yàn)呈陰性則是指判斷鑒定結(jié)果為正確，檢驗(yàn)的假陽是指真實(shí)正確的鑒定結(jié)果被判斷為陽性（錯(cuò)誤鑒定），檢驗(yàn)的假陰是指真實(shí)錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果被判斷為陰性（正確鑒定）。進(jìn)一步，檢驗(yàn)假陽率是指正確鑒定結(jié)果被報(bào)告為不可信結(jié)果（即檢驗(yàn)結(jié)果陽性）的比例，檢驗(yàn)假陰率是指錯(cuò)誤鑒定結(jié)果被報(bào)告為可信結(jié)果（即檢驗(yàn)結(jié)果陰性）的比例［78］。從定義上看，這兩個(gè)指標(biāo)都是越小越好。同時(shí)，這些方法的檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率與應(yīng)用它們排除檢驗(yàn)陽性的結(jié)果前后鑒定結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度存在一定的關(guān)系，即檢驗(yàn)假陽率越低，排除檢驗(yàn)陽性的結(jié)果后，鑒定結(jié)果的靈敏度越高，檢驗(yàn)假陰率越低，排除檢驗(yàn)陽性的結(jié)果后，鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度越高［78］。檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率越低的方法對(duì)鑒定結(jié)果的正誤判斷越準(zhǔn)確，在實(shí)際檢驗(yàn)肽段鑒定可信度的過程中，應(yīng)該選擇檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率都較低的方法，保留檢驗(yàn)方法認(rèn)為可信的鑒定結(jié)果，排除它們認(rèn)為不可信的鑒定結(jié)果。

3.2 基于搜索空間的可信度檢驗(yàn)方法

搜索空間對(duì)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度有較大影響。當(dāng)搜索空間不足即正確鑒定結(jié)果不在搜索空間內(nèi)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致鑒定出錯(cuò)。而擴(kuò)大搜索空間，會(huì)有兩種情況：第一，正確鑒定結(jié)果被包括到搜索空間中，只要肽段-譜圖匹配打分無誤，就可以鑒定到正確鑒定結(jié)果，將原始鑒定判錯(cuò)；第二，正確鑒定結(jié)果仍然不在搜索空間中，但此時(shí)搜索空間中更多的候選結(jié)果有更大的概率打敗小空間搜索時(shí)的錯(cuò)誤結(jié)果，這樣也能評(píng)價(jià)原始鑒定結(jié)果的正確性。無論哪種情況，我們主要利用搜索空間增大后結(jié)果的不穩(wěn)定性，對(duì)原始鑒定結(jié)果的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)搜索空間的不同擴(kuò)增方式，又分為陷阱庫檢驗(yàn)和開放式搜索檢驗(yàn)。

陷阱庫方法已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用多年，其主要思想是使用與目標(biāo)物種無關(guān)的蛋白質(zhì)作為陷阱進(jìn)行匹配，如果一張譜圖在搜索目標(biāo)蛋白質(zhì)和陷阱蛋白質(zhì)合并構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫時(shí)匹配到陷阱庫蛋白質(zhì)的肽段，那么認(rèn)為該譜圖的鑒定結(jié)果是不可信的，這就可以用于評(píng)價(jià)不同引擎和不同方法的準(zhǔn)確度［79-84］。馬潔等［80］使用古細(xì)菌蛋白質(zhì)庫作為人類肝臟數(shù)據(jù)的陷阱庫，比對(duì)搜索引擎在不同搜索參數(shù)下的錯(cuò)誤率，提升搜索引擎的靈敏度和準(zhǔn)確度。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mascot的Ion Score和Relative Score可以幫助提升鑒定靈敏度，使用貝葉斯非參數(shù)模型可以比根據(jù)人工經(jīng)驗(yàn)確定的打分閾值過濾出的結(jié)果獲得更高的準(zhǔn)確度。Granholm等［81］使用流感嗜血桿菌蛋白質(zhì)庫作為18個(gè)ISB標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的陷阱庫，評(píng)測搜索引擎打分函數(shù)對(duì)正確和錯(cuò)誤鑒定結(jié)果的區(qū)分能力。實(shí)驗(yàn)證明，使用了Intraset特征的Percolator的打分以及X！Tandem和MSGFDB中計(jì)算的q-value都是有偏的。Feng等［84］使用人類蛋白質(zhì)庫作為強(qiáng)烈火球菌的陷阱庫蛋白質(zhì)，使用古細(xì)菌蛋白質(zhì)庫作為人類數(shù)據(jù)的陷阱庫，基于強(qiáng)烈火球菌和人類數(shù)據(jù)的陷阱庫檢驗(yàn)，評(píng)測了5種搜索引擎和四種質(zhì)量控制方法，在這種評(píng)測條件下，搜索引擎MS-GF+和后處理方法PepDistiller［85］表現(xiàn)最優(yōu)，同時(shí)也證明了使用分開過濾方法單獨(dú)估計(jì)子類數(shù)據(jù)的FDR能夠同時(shí)提升鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。具體使用陷阱庫方法時(shí)有多種實(shí)現(xiàn)方式，選擇不同物種、不同規(guī)模的蛋白質(zhì)庫作為陷阱庫，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不同程度的影響。Feng等［83］的研究指出，需要使用規(guī)模為目標(biāo)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫十倍的陷阱庫才能保證隨機(jī)匹配幾乎只發(fā)生在陷阱庫上，使得陷阱庫方法發(fā)揮最佳效果。

上述應(yīng)用陷阱庫思想的研究中都只搜索了目標(biāo)庫和陷阱庫的合并蛋白質(zhì)庫，陷阱庫可以幫助找出搜索合并庫時(shí)的一部分錯(cuò)誤鑒定，但沒法對(duì)常規(guī)情況下只搜索目標(biāo)庫時(shí)的鑒定結(jié)果做檢驗(yàn)，所以我們前期的工作中提出了額外搜索合并庫的陷阱庫檢驗(yàn)方法［78］。合并庫中的陷阱庫蛋白質(zhì)擴(kuò)大了搜索空間，如果搜索合并庫時(shí)的鑒定結(jié)果與之前只搜索目標(biāo)庫時(shí)的鑒定結(jié)果不一致，則認(rèn)為之前只搜索目標(biāo)庫時(shí)的鑒定結(jié)果錯(cuò)誤。

開放式搜索檢驗(yàn)與陷阱庫檢驗(yàn)的思想類似，都是通過擴(kuò)大搜索空間后再次搜庫，檢驗(yàn)原始搜索空間鑒定的結(jié)果是否會(huì)產(chǎn)生變化。不同之處在于開放式搜索檢驗(yàn)擴(kuò)大的搜索空間中可能包含正確鑒定結(jié)果，但是實(shí)際操作中與陷阱庫檢驗(yàn)區(qū)別并不大。陷阱庫檢驗(yàn)需要額外搜索目標(biāo)庫和陷阱庫的合并蛋白質(zhì)庫，而開放式搜索需要額外搜索目標(biāo)物種庫的所有酶切和所有修飾情況。由于開放式搜索空間包含真實(shí)正確鑒定結(jié)果，所以開放式搜索檢驗(yàn)更容易發(fā)現(xiàn)原始結(jié)果中的錯(cuò)誤，即開放式搜索檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)假陰率會(huì)優(yōu)于陷阱庫檢驗(yàn)方法，我們前期的研究中也證明了這個(gè)結(jié)論［78］。

值得一提的是，前文提到的TDA方法，本質(zhì)上也應(yīng)用了擴(kuò)大搜索空間的思想。實(shí)際上，如果首先僅搜索一次目標(biāo)庫，再搜索一次目標(biāo)庫和誘餌庫的合并庫，那么，TDA也是一種基于陷阱庫的檢驗(yàn)方法，誘餌庫在這里起到陷阱庫的作用，且目標(biāo)庫與陷阱庫具有同規(guī)模的特點(diǎn)（也正是這一特點(diǎn)，可以在TDA方法基礎(chǔ)上進(jìn)行FDR估計(jì)）。具體講，TDA用作檢驗(yàn)方法時(shí)，假陽性結(jié)果是指將原本正確的鑒定結(jié)果檢驗(yàn)為陽性即錯(cuò)誤鑒定結(jié)果，也就是只搜索目標(biāo)庫時(shí)鑒定為目標(biāo)庫的正確結(jié)果，搜索目標(biāo)庫和誘餌庫的合并庫時(shí)鑒定為誘餌庫結(jié)果。當(dāng)然，這種可能性極小，原則上，如果真實(shí)結(jié)果存在于目標(biāo)庫中，那么一般認(rèn)為誘餌庫競爭不過目標(biāo)庫中的真實(shí)結(jié)果，因此可以認(rèn)為TDA方法的檢驗(yàn)假陽率是0。TDA方法檢驗(yàn)所得的假陰性結(jié)果是指將原本錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果檢驗(yàn)為陰性即正確鑒定結(jié)果，也就是搜索目標(biāo)庫時(shí)錯(cuò)誤的目標(biāo)庫鑒定結(jié)果，在搜索目標(biāo)庫和誘餌庫的合并庫時(shí)，仍然鑒定到目標(biāo)庫結(jié)果，這種可能性是存在的，如果隨機(jī)匹配到目標(biāo)庫和誘餌庫的概率是1∶1的假設(shè)成立，那么可以認(rèn)為TDA的檢驗(yàn)假陰率是50%。

3.3 基于譜圖相似性的可信度檢驗(yàn)方法

搜索引擎對(duì)每個(gè)肽段-譜圖匹配的打分其實(shí)就是對(duì)實(shí)驗(yàn)譜圖與肽段的理論譜圖的相似程度進(jìn)行打分，理論譜圖估計(jì)得越準(zhǔn)確，打分的可信度越高。常規(guī)的數(shù)據(jù)庫搜索引擎在生成肽段的理論譜圖時(shí)，沒有考慮碎片離子的強(qiáng)度信息，即給理論譜圖中的所有碎片離子賦予相同的強(qiáng)度，這會(huì)造成一部分肽段-譜圖匹配錯(cuò)誤。在Beyond-TDA方法中，有一類方法通過在肽段-譜圖匹配打分時(shí)考慮碎片離子強(qiáng)度，對(duì)鑒定的肽段的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括合成肽段檢驗(yàn)和理論譜圖預(yù)測兩種方法。

3.3.1 合成肽段檢驗(yàn)

合成肽段檢驗(yàn)方法能夠獲取最真實(shí)和最精準(zhǔn)的肽段理論譜圖，所以合成肽段檢驗(yàn)方法是領(lǐng)域內(nèi)檢驗(yàn)鑒定結(jié)果可信度的金標(biāo)準(zhǔn)。合成肽段檢驗(yàn)方法常用來檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的新現(xiàn)象（比如新基因、遺漏注釋蛋白質(zhì)和新修飾），即對(duì)相應(yīng)的新肽段進(jìn)行合成，在盡可能相同的液相色譜條件和質(zhì)譜儀參數(shù)等條件下打譜，通過計(jì)算新肽段對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)譜圖與合成肽段對(duì)應(yīng)的合成譜圖的余弦相似度，判斷新肽段的可信度［86-88］。一般以0.9作為合成肽段檢驗(yàn)的余弦相似度閾值，達(dá)到或超過這個(gè)閾值則認(rèn)為鑒定結(jié)果可信；反之，低于該閾值則認(rèn)為鑒定結(jié)果不可信［87-88］。合成肽段檢驗(yàn)方法是領(lǐng)域內(nèi)目前公認(rèn)的最好的個(gè)體可信度檢驗(yàn)方法，我們前期的工作中評(píng)測合成肽段檢驗(yàn)方法的FPR為0.06%，F(xiàn)NR為1.44%［78］。然而該方法的應(yīng)用成本非常高，需要消耗時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本，難以大規(guī)模應(yīng)用。

3.3.2 理論譜圖預(yù)測

理論譜圖預(yù)測方法可以看作是合成肽段檢驗(yàn)的一種替代方法。采用機(jī)器學(xué)習(xí)特別是深度學(xué)習(xí)技術(shù)預(yù)測特定儀器、特定碎裂能量、特定電荷狀態(tài)的肽段理論碎裂的譜圖，將這類譜圖稱為預(yù)測譜圖。常用的理論譜圖預(yù)測軟件有采用隨機(jī)森林方法的MS2PIP［89］，采用雙向長短期記憶網(wǎng)絡(luò)的pDeep［90］、pDeep2［91］、DeepMass［92］和Guan_2019（關(guān)慎恒等人開發(fā)的軟件）［93］以及采用雙向遞歸循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的Prosit［94］等。與合成肽段檢驗(yàn)方法類似，得到預(yù)測譜圖后，計(jì)算實(shí)驗(yàn)譜圖和預(yù)測譜圖的余弦相似度，pValid文章中綜合考慮FPR和FNR后選取0.7作為實(shí)驗(yàn)譜圖和pDeep2預(yù)測譜圖的相似度閾值，余弦相似度達(dá)到或者超過0.7認(rèn)為鑒定結(jié)果可信，反之余弦相似度低于0.7則認(rèn)為鑒定結(jié)果不可信，取閾值0.7時(shí)理論譜圖預(yù)測方法的FPR和FNR分別是0.26%和10.80%［78］。理論譜圖預(yù)測方法不僅可以用于檢驗(yàn)鑒定結(jié)果的可信度，也可以幫助改進(jìn)肽段和譜圖的匹配打分，DeepMass從理論譜圖中提取強(qiáng)度Top-3、Top-5、Top-7、Top-10和Top-13的譜峰計(jì)算Andromeda打分［95］，雖然參與打分的譜峰數(shù)目比原始譜圖要少，但是由于譜峰預(yù)測更準(zhǔn)確，反而可以提升打分。

Xu等［96］對(duì)4種理論譜圖預(yù)測軟件的預(yù)測能力進(jìn)行了評(píng)測，采用10個(gè)不同物種、酶切、儀器和碎裂能量的公共數(shù)據(jù)，對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析，采用5種數(shù)據(jù)庫搜索引擎進(jìn)行搜庫，取搜庫結(jié)果交集作為標(biāo)注集，根據(jù)鑒定肽段的離子類型、長度和電荷進(jìn)行分組，然后采用MS2PIP、Prosit、pDeep 2和Guan_2019預(yù)測肽段的理論譜圖，計(jì)算理論譜圖和實(shí)驗(yàn)譜圖的皮爾遜相似度。從預(yù)測譜圖與實(shí)驗(yàn)譜圖的相似程度看，Prosit和pDeep2表現(xiàn)最好；從GPU和CPU上的運(yùn)行時(shí)間看，pDeep2在GPU和CPU上運(yùn)行時(shí)間均優(yōu)于Prosit。

3.4 基于化學(xué)信息的可信度檢驗(yàn)方法

除了上述基于搜索空間和譜圖相似性的Beyond-TDA方法，引入保留時(shí)間和同位素標(biāo)記等化學(xué)信息也可以幫助評(píng)價(jià)肽段的可信度。保留時(shí)間預(yù)測方法可以提供肽段的理論保留時(shí)間，而同位素標(biāo)記方法相當(dāng)于對(duì)待檢驗(yàn)的目標(biāo)增加了額外的譜圖信息。

3.4.1 保留時(shí)間預(yù)測

肽段的保留時(shí)間是指肽段從色譜進(jìn)入質(zhì)譜所需要的時(shí)間，通俗來說是指肽段離子在質(zhì)譜中從有信號(hào)到信號(hào)達(dá)到最高峰這段過程的時(shí)間，它與肽段的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，在特定分離條件下肽段的保留時(shí)間應(yīng)該是相對(duì)恒定的，所以通過檢驗(yàn)肽段的保留時(shí)間是否在一定的范圍內(nèi)，就可以判斷鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性［66，97-98］。保留時(shí)間預(yù)測方法有采用支持向量回歸方法的Elude［99-100］、采用高斯過程回歸方法的GPTime［101］、采用膠囊網(wǎng)絡(luò)和遷移學(xué)習(xí)方法的DeepRT［102］、采用雙向遞歸循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的Prosit［94］、采用雙向長短期記憶網(wǎng)絡(luò)的Guan_2019［93］以及基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和長短期記憶網(wǎng)絡(luò)的AutoRT［103］?？梢灾苯硬捎妙A(yù)測保留時(shí)間與實(shí)際保留時(shí)間的差值檢驗(yàn)鑒定結(jié)果的可信度，也可以將差值作為一維特征，與理論譜圖相似度等其他特征聯(lián)合判斷鑒定結(jié)果的可信度。

P-IVS［104］是一種結(jié)合合成肽段和保留時(shí)間特征的可信度檢驗(yàn)方法，該方法對(duì)于感興趣的目標(biāo)肽段進(jìn)行合成，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)樣品和合成樣品中均混入一定量的標(biāo)準(zhǔn)肽段，統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)肽段在兩種樣品中的譜圖皮爾遜相似度和保留時(shí)間差值的范圍，確定置信區(qū)間，然后對(duì)于目標(biāo)肽段計(jì)算其在兩種樣品中的皮爾遜相似度和保留時(shí)間差值，通過前述確定的皮爾遜相似度和保留時(shí)間差值的置信區(qū)間對(duì)目標(biāo)肽段的可信度進(jìn)行檢驗(yàn)。P-IVS的優(yōu)勢是結(jié)合了合成肽段和保留時(shí)間，使得可信度檢驗(yàn)較為精準(zhǔn)，但是不能大規(guī)模應(yīng)用，文章中僅僅對(duì)11條目標(biāo)肽段的可信度進(jìn)行了檢驗(yàn)（使用了40條標(biāo)準(zhǔn)肽段）。

3.4.2 同位素標(biāo)記檢驗(yàn)

同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法（圖3）需要在樣品制備過程中同時(shí)制備無標(biāo)記樣品和重同位素標(biāo)記樣品，將無標(biāo)記樣品和標(biāo)記樣品按比例混合后再進(jìn)行酶切和質(zhì)譜采集。對(duì)于搜索引擎鑒定的每條肽段，如果鑒定為無標(biāo)記肽段，則在一級(jí)譜尋找其對(duì)應(yīng)的重同位素標(biāo)記肽段的信號(hào)峰；如果鑒定為重同位素標(biāo)記肽段，則在一級(jí)譜尋找其對(duì)應(yīng)的無標(biāo)記肽段的信號(hào)峰。如果能找到該鑒定結(jié)果對(duì)應(yīng)的另一種標(biāo)記肽段的信號(hào)峰，那么認(rèn)為該鑒定結(jié)果可信；反之，則認(rèn)為該鑒定結(jié)果不可信［12，61，63］。更嚴(yán)格的同位素標(biāo)記檢驗(yàn)可以計(jì)算無標(biāo)記和標(biāo)記肽段信號(hào)峰的強(qiáng)度比值，只有比值符合或接近樣品制備時(shí)無標(biāo)記樣品和標(biāo)記樣品的濃度比例，才認(rèn)為鑒定結(jié)果可信，反之認(rèn)為不可信。

同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法目前在常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)、交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)都得到了應(yīng)用［12，61，63］。糖蛋白質(zhì)組學(xué)中最早應(yīng)用了同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法［63］，糖肽搜索引擎pGlyco 2首次應(yīng)用15N和13C兩種同位素標(biāo)記方法標(biāo)記釀酒酵母數(shù)據(jù)，其中無標(biāo)記、15N標(biāo)記和13C標(biāo)記3種標(biāo)記樣品的比例是1∶1∶1。pGlyco 2和Byonic鑒定結(jié)果的15N和13C標(biāo)記檢驗(yàn)表明pGlyco 2的可信度遠(yuǎn)高于Byonic。pGlyco 2采用所有誘餌庫結(jié)果估計(jì)同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)假陰率，但沒有估計(jì)檢驗(yàn)假陽率，最后使用估計(jì)得到的檢驗(yàn)假陰率對(duì)目標(biāo)庫結(jié)果的錯(cuò)誤率做了校正，算得pGlyco 2鑒定到的糖肽的錯(cuò)誤率低于Byonic。

在常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)中，開放式搜索引擎OpenpFind也應(yīng)用了15N和13C兩種同位素標(biāo)記方法標(biāo)記大腸桿菌數(shù)據(jù)［12］，其中無標(biāo)記、15N標(biāo)記和13C標(biāo)記三種標(biāo)記樣品的比例是1∶1∶1。8種搜索引擎鑒定結(jié)果的15N標(biāo)記檢驗(yàn)和13C標(biāo)記檢驗(yàn)均表明Open-pFind的鑒定結(jié)果具有最高的準(zhǔn)確度，且Open-pFind相對(duì)其他引擎單獨(dú)鑒定的差集部分具有與交集部分相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度。Open-pFind采用多引擎交集作為正樣本估計(jì)兩種同位素標(biāo)記方法的檢驗(yàn)假陽率，采用低打分區(qū)域的目標(biāo)庫鑒定結(jié)果作為負(fù)樣本估計(jì)兩種同位素標(biāo)記方法的檢驗(yàn)假陰率，最后根據(jù)檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率估計(jì)出鑒定結(jié)果的錯(cuò)誤率。

Fig. 3 Stable isotopic labeling validation method圖3 同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法

在交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)中，搜索引擎pLink 2的研究中采用15N標(biāo)記大腸桿菌數(shù)據(jù)［61］，無標(biāo)記和15N標(biāo)記樣品的比例是1∶1，分別采用兩種交聯(lián)劑Leiker和二硫鍵進(jìn)行交聯(lián)，在這兩批交聯(lián)劑數(shù)據(jù)上對(duì)三種交聯(lián)引擎Kojak、pLink 1和pLink 2進(jìn)行評(píng)測，檢驗(yàn)結(jié)果表明pLink 2的鑒定結(jié)果具有最高的準(zhǔn)確度。pLink 2采用多引擎交集作為正樣本評(píng)測15N標(biāo)記檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)假陽率，采用通過TDA-FDR閾值的誘餌庫鑒定結(jié)果作為負(fù)樣本評(píng)測15N標(biāo)記檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)假陰率，最后根據(jù)檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率估計(jì)出pLink 2的鑒定結(jié)果在三個(gè)引擎的鑒定結(jié)果中錯(cuò)誤率最低。

同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法的應(yīng)用并不限于在常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)、交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)，還可以應(yīng)用到微生物組學(xué)和蛋白質(zhì)基因組學(xué)。同時(shí)，同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法也不限于MS1（一級(jí)質(zhì)譜圖）檢驗(yàn)，還可以用于MS2（二級(jí)質(zhì)譜圖）檢驗(yàn)，預(yù)期將有更高的檢驗(yàn)效率。標(biāo)記方法不限于15N標(biāo)記和13C標(biāo)記，其他代謝標(biāo)記，如細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）和化學(xué)標(biāo)記方法，都值得探索。

3.5 基于機(jī)器學(xué)習(xí)的可信度檢驗(yàn)方法

上述3種基于搜索空間、譜圖相似性和化學(xué)信息的Beyond-TDA方法都具有各自的優(yōu)勢，如果能結(jié)合以上3種方法的多種特征進(jìn)行可信度檢驗(yàn)，并結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)等方法挖掘數(shù)據(jù)特性，將會(huì)得到更精準(zhǔn)的可信度檢驗(yàn)方法。Percolator［105］采用半監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，使得它能適配不同搜索引擎和不同物種的數(shù)據(jù)。Percolator采用互相關(guān)系數(shù)、質(zhì)量、碎片離子匹配率、酶切特異性、肽段長度、電荷和鑒定結(jié)果數(shù)目等未用于打分的特征，使用支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）作為分類器，對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行重打分。重打分的目的是為了讓目標(biāo)庫和誘餌庫結(jié)果區(qū)分度更高，達(dá)到檢驗(yàn)鑒定結(jié)果可信度的目的。

DeepRescore［106］使用AutoRT［103］預(yù)測保留時(shí)間，計(jì)算預(yù)測保留時(shí)間與實(shí)驗(yàn)保留時(shí)間的差值DeltaRT，同時(shí)使用pDeep2預(yù)測理論譜圖，計(jì)算理論譜圖和實(shí)驗(yàn)譜圖之間的譜圖夾角（spectra angle，SA），將DeltaRT和SA作為特征加入Percolator，同搜索引擎給出的打分等特征一起重新訓(xùn)練，對(duì)每個(gè)鑒定結(jié)果重新打分，并重新計(jì)算FDR。

pValid方法從開放式搜索及理論譜圖預(yù)測中提取與鑒定結(jié)果相關(guān)的特征，并采用SVM方法作為分類器，對(duì)鑒定結(jié)果的可信度進(jìn)行預(yù)測［78］。開放式搜索同時(shí)考慮了特異、半特異、非特異酶切形式以及Unimod［107］中的所有修飾，也是一種擴(kuò)大搜索空間的檢驗(yàn)方法。pValid綜合了開放式搜索和理論譜圖預(yù)測兩種可信度檢驗(yàn)方法，獲得了更低的檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率，我們前期的工作中對(duì)以上提到的陷阱庫、開放式搜索、合成肽段、理論譜圖預(yù)測和pValid方法的檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率進(jìn)行了研究［78］。采用3種數(shù)據(jù)庫搜索引擎（pFind、MaxQuant和PEAKS）的交集構(gòu)建正樣本，評(píng)測各種方法的檢驗(yàn)假陽率，采用正樣本譜圖母離子偏離5 u和10 u構(gòu)建誘餌譜圖重新搜庫的方法構(gòu)建負(fù)樣本，評(píng)測各種方法的檢驗(yàn)假陰率。在3批標(biāo)注數(shù)據(jù)集上，pValid的檢驗(yàn)假陰率最低，檢驗(yàn)假陽率僅次于陷阱庫方法。pValid的平均檢驗(yàn)假陽率為0.03%，陷阱庫方法的平均檢驗(yàn)假陽率為0.01%，pValid的平均檢驗(yàn)假陰率為1.79%，但陷阱庫方法的平均檢驗(yàn)假陰率高達(dá)56.13%。綜合考慮檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率，pValid方法優(yōu)于陷阱庫、開放式搜索和理論譜圖預(yù)測方法。在合成肽段數(shù)據(jù)集上，pValid的檢驗(yàn)假陽率和檢驗(yàn)假陰率媲美合成肽段檢驗(yàn)方法（表1）?？梢哉J(rèn)為基于機(jī)器學(xué)習(xí)的pValid方法在一定條件下超越了陷阱庫、開放式搜索和理論譜圖預(yù)測方法，甚至也超越了合成肽段檢驗(yàn)方法。

Table 1 Beyond-TDA validation methods表1 Beyond-TDA方法

4 總結(jié)與展望

質(zhì)譜分析對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)至關(guān)重要。質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果能夠給出基因表達(dá)的直接證據(jù)，同時(shí)幫助解析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)以及研制靶向治療方案。然而，質(zhì)譜分析結(jié)果的可信度亟待評(píng)價(jià)。對(duì)常規(guī)肽段使用TDA進(jìn)行質(zhì)量控制的方法雖然在子類肽段和交聯(lián)肽段中都進(jìn)行了演化改進(jìn)，但仍然存在估計(jì)值不準(zhǔn)確以及無法評(píng)價(jià)單個(gè)鑒定結(jié)果可信度的局限。因此，領(lǐng)域內(nèi)在TDA基礎(chǔ)上開發(fā)了結(jié)合搜索空間、譜圖相似性、化學(xué)信息和機(jī)器學(xué)習(xí)等有效手段的Beyond-TDA方法。

Beyond-TDA方法主要介紹了基于搜索空間、譜圖相似性和化學(xué)信息的3類方法，包括陷阱庫、開放式搜索、合成肽段、理論譜圖預(yù)測、保留時(shí)間預(yù)測和同位素標(biāo)記檢驗(yàn)方法。陷阱庫方法可以快速檢驗(yàn)大規(guī)模鑒定結(jié)果，TDA方法本質(zhì)上也可以看作是陷阱庫檢驗(yàn)。開放式搜索也是一種擴(kuò)大搜索空間的檢驗(yàn)方法，因其擴(kuò)大的空間中可能包含正確鑒定結(jié)果，所以它的檢驗(yàn)假陰率理論上會(huì)優(yōu)于陷阱庫方法。合成肽段方法是檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)，但是時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本較高，不適用于大規(guī)模質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果的檢驗(yàn)，由此產(chǎn)生了理論譜圖預(yù)測方法模擬和替代合成肽段方法。保留時(shí)間預(yù)測方法采用預(yù)測保留時(shí)間與實(shí)際保留時(shí)間的差值作為鑒定結(jié)果可信度的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，常常與理論譜圖預(yù)測等方法聯(lián)用。同位素標(biāo)記檢驗(yàn)?zāi)壳耙呀?jīng)在常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)、交聯(lián)蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)中得到了應(yīng)用并發(fā)揮了重要價(jià)值，但這種方法還可以繼續(xù)改進(jìn)，比如不僅僅考慮無標(biāo)記和重同位素標(biāo)記肽段信號(hào)峰的存在性，將肽段的同位素峰簇比值以及碎片離子同位素峰簇比值都納入檢驗(yàn)范圍，以及進(jìn)一步從MS1拓展到MS2，從15N和13C拓展到SILAC，從代謝標(biāo)記拓展到化學(xué)標(biāo)記。

基于機(jī)器學(xué)習(xí)的可信度評(píng)價(jià)方法主要用于對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行重打分，自動(dòng)選擇最優(yōu)重打分閾值檢驗(yàn)鑒定結(jié)果的可信度，這些方法各自使用了多種特征，比如Percolator使用了XCorr互相關(guān)系數(shù)、肽段長度、電荷、鑒定結(jié)果數(shù)目等肽段-譜圖匹配相關(guān)的特征，DeepRescore使用了保留時(shí)間差值和理論譜圖預(yù)測，pValid使用了開放式搜索和理論譜圖預(yù)測。這些特征都能幫助區(qū)分正確和錯(cuò)誤鑒定結(jié)果，未來可以將這些特征綜合應(yīng)用到一個(gè)分類器中，并結(jié)合深度學(xué)習(xí)帶來的優(yōu)勢，提升分類結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來也可以考慮結(jié)合所有Beyond-TDA方法的優(yōu)勢，構(gòu)建更準(zhǔn)確的可信度評(píng)價(jià)方法。需要注意的是，機(jī)器學(xué)習(xí)方法受限于訓(xùn)練數(shù)據(jù)的規(guī)模和質(zhì)量，產(chǎn)生質(zhì)譜數(shù)據(jù)的真實(shí)肽段是未知的，可以通過取多種搜索引擎交集的方法構(gòu)建大規(guī)模高質(zhì)量的正確鑒定結(jié)果，但構(gòu)建同樣規(guī)模的高質(zhì)量的錯(cuò)誤鑒定結(jié)果卻很困難，這也是未來需要解決的問題。我們也注意到，近年來有研究認(rèn)為，隨著質(zhì)譜儀精度越來越高，基于統(tǒng)計(jì)的方法（P-value和Benjamini-Hochberg方法［108］）的準(zhǔn)確度優(yōu)于常規(guī)的TDAFDR［109］，理論上，這類方法也可以和文中提到的其他Beyond-TDA方法進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)一步檢驗(yàn)鑒定結(jié)果的可信度。

蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域內(nèi)發(fā)展了TDA方法和基于搜索空間、譜圖相似性、化學(xué)信息和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的Beyond-TDA方法，對(duì)肽段鑒定的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)，但是對(duì)于蛋白質(zhì)層面的可信度評(píng)價(jià)關(guān)注不算多。蛋白質(zhì)作為質(zhì)譜分析的最終目標(biāo)，具有非常重要的意義。Picked FDR方法讓人們意識(shí)到日益增長的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中的蛋白質(zhì)FDR高估問題，給出了簡便且有效的解決方法，未來還需要更多地關(guān)注蛋白質(zhì)層面的可信度評(píng)價(jià)方法。未來也可以嘗試將目前的肽段可信度評(píng)價(jià)方法遷移和拓展到蛋白質(zhì)的可信度評(píng)價(jià)中，比如，對(duì)于每個(gè)待評(píng)價(jià)的蛋白質(zhì)，只要有一條特異的肽段通過了可信度評(píng)價(jià)，那么就可以認(rèn)為此蛋白質(zhì)也通過了可信度評(píng)價(jià)，具體實(shí)現(xiàn)方式與方法可行性還有待進(jìn)一步分析探索。