李 金，閆思遠(yuǎn)，陳思杰，顧沛雯

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

植物內(nèi)生真菌是指生活史的全部或某一階段定殖于植物體內(nèi)，但對(duì)宿主植物不造成明顯病害癥狀的一類真菌[1]。有益內(nèi)生真菌的定殖能夠促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng),增強(qiáng)宿主抗逆抗病能力,而內(nèi)生真菌發(fā)揮促生和防病作用的前提是與植物建立良好共生關(guān)系[2-3]。目前，用于檢測(cè)內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)定殖的方法有基因標(biāo)記法[4]、抗生素標(biāo)記法[5]、同位素示蹤法[6]、核酸探針?lè)╗7]和免疫學(xué)等方法[8]。報(bào)告基因技術(shù)的發(fā)展為研究?jī)?nèi)生真菌在植物中定殖和互作關(guān)系提供了極大的便利。綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)易于檢測(cè)、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害、表達(dá)穩(wěn)定，在多種生物細(xì)胞中均可表達(dá)，使其成為廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記之一[9]。丁婷等[10]利用GFP標(biāo)記，觀察發(fā)現(xiàn)杜仲內(nèi)生真菌DZJ07-6可在小麥根和莖組織的細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)大量定殖；陳楠等[11]利用GFP標(biāo)記的堿蓬內(nèi)生真菌JP4-1轉(zhuǎn)化子侵染水稻幼苗，并在熒光顯微鏡下示蹤JP4-1菌株及其侵染特性。

枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4(專利號(hào)：CN202010357046.4)分離自‘寧杞8號(hào)’健康枸杞的根部，經(jīng)鑒定為輪狀鐮刀菌(Fusariumnematophilum)。胡麗杰等[12]研究表明，NQ8GⅡ4菌株對(duì)枸杞膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioide)的抑制率高達(dá)93.43%，生防菌菌絲能纏繞并穿透膠孢炭疽菌菌絲,使菌絲膨脹崩解。NQ8GⅡ4菌株的發(fā)酵濾液對(duì)紅棗、葡萄等果品的致腐病原真菌具有明顯的抑菌作用，能大大降低紅棗貯存期間的腐爛速率，延長(zhǎng)貨架期15d左右[13]。閆思遠(yuǎn)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NQ8GⅡ4菌株僅能定殖于枸杞根部，并成功構(gòu)建NQ8GⅡ4菌株的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得1株與野生型性狀一致的GFP標(biāo)記轉(zhuǎn)化子NQ8GⅡ4-GFP菌株。為明確NQ8GⅡ4菌株的定殖和促生作用，本試驗(yàn)采用生物學(xué)方法測(cè)定野生型NQ8GⅡ4菌株的促生潛力，研究NQ8GⅡ4-GFP菌株在不同植物根部的定殖情況及對(duì)其枸杞的促生作用，以期為該生防菌株作為微生物肥料的開發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試種子分別為‘寧杞5號(hào)’枸杞(寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究所)、‘綠秀5號(hào)’西葫蘆(上海匯陽(yáng)種業(yè)有限公司)、‘寧春4號(hào)’小麥(寧夏科豐種業(yè)有限公司)、‘加州王’芹菜(寧夏科泰種業(yè)有限公司)、‘大速生’生菜(青豐種業(yè)有限公司)和‘白砂糖’番茄(壽光金鵬種業(yè)有限公司)，上述種子經(jīng)消毒(75%酒精,30 s; 1% NaClO,5 min)后栽種到裝有已消毒營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(二者等體積混合)的72孔穴盤(54 cm×28 cm×4.5 cm)內(nèi)，于光照培養(yǎng)箱(RQX-250，上海恒宇公司)中26 ℃、12 h光照/12 h黑暗交替培養(yǎng)培育至3～5片真葉，備用。

1.2 菌 種

野生型NQ8GⅡ4菌株，由胡麗杰[15]從健康枸杞根部分離獲得；GFP標(biāo)記菌株NQ8GⅡ4-GFP由閆思遠(yuǎn)等[16]通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得，菌種均保存于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 野生型菌株促生活性測(cè)定

1.3.1 菌株產(chǎn)赤霉素活性 將NQ8GⅡ4菌株接種于PDB液體培養(yǎng)基，搖菌5 d后利用福林法[17]初步鑒定NQ8GⅡ4產(chǎn)赤霉素能力。定量測(cè)定：參考劉文芳[18]的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y= 0.924 8x+0.031 3 (R2=0.995)，式中y為680 nm處的比色值，x為赤霉素含量(μg)，將 NQ8GⅡ4孢子液比色后測(cè)定A680 nm，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)計(jì)算出NQ8GⅡ4菌株產(chǎn)赤霉素的濃度。

1.3.2 菌株產(chǎn)鐵載體能力 定性分析：參考汪少林[19]的方法，吸取50 μL的NQ8GⅡ4菌株去鐵查氏培養(yǎng)濾液與等體積的CAS檢測(cè)液混勻，以混合液變?yōu)?橙)紅色為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否具有產(chǎn)鐵載體活性。定量測(cè)定：將NQ8GⅡ4菌株的菌液接種至去鐵查氏培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)7 d，將菌液上清液與等體積CAS檢測(cè)液混合后測(cè)定630 nm波長(zhǎng)下的比色值(As)，用同樣的方法測(cè)定空白去鐵查氏培養(yǎng)液比色值(Ar)，以As/Ar分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[20]表示產(chǎn)鐵載體能力。

1.3.3 菌株解磷、產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶定性分析 選擇培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)[21-23]，將NQ8GⅡ4菌株接種到改良PVK無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d后，通過(guò)觀察透明圈的大小，判斷解磷、產(chǎn)蛋白酶能力。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基則經(jīng)剛果紅染色后，觀察降解圈的形成情況判斷產(chǎn)纖維素酶活性。

1.4 GFP標(biāo)記菌株在植物根部的定殖

1.4.1 接種 NQ8GⅡ4-GFP菌株孢子液的制備參考張譽(yù)薺等[24]的方法，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整濃度為107CFU/mL。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的枸杞、番茄、小麥、芹菜、西葫蘆和生菜苗，每株幼苗分4次沿根圍澆灌200 mL的NQ8GⅡ4-GFP菌液，以無(wú)菌水為對(duì)照處理，每處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，參照“1.1”條件培養(yǎng)50 d后用于定殖研究。

1.4.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 隨機(jī)取處理后的各植物根段若干，洗凈后徒手切片，制成水玻片，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(SP5，德國(guó)萊卡公司)在藍(lán)光(488 nm)下觀察菌株在植物中的定殖，以無(wú)菌水處理的植物為空白對(duì)照。

1.4.3 定殖率測(cè)定 參考李曉慧等[25]的方法，使用PDA檢測(cè)法測(cè)定NQ8GⅡ4-GFP標(biāo)記菌株在各植物根部的定殖率，PDA檢測(cè)培養(yǎng)基中添加50 mg/L Amp和30 mg/L HmB，用于篩選NQ8GⅡ4-GFP標(biāo)記菌株。樣品材料進(jìn)行表面消毒(方法同“1.1”)，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻擺放9塊根樣，28 ℃培養(yǎng),7 d后觀察并記錄植物根段上菌體生長(zhǎng)情況，定殖率=出現(xiàn)目標(biāo)菌落的根段數(shù)量/ 根段總數(shù)×100%，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.5 NQ8GⅡ4-GFP菌株對(duì)枸杞的促生作用

按照“1.4.1”的方法配制107CFU/mL的NQ8GⅡ4-GFP孢子液，稀釋成106、105、104和103CFU/mL。枸杞苗栽培培養(yǎng)方法同“1.1”，待枸杞苗長(zhǎng)至3片真葉后進(jìn)行灌根處理，每株幼苗分3次沿根圍澆灌150 mL的孢子液，以等體積無(wú)菌水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置9個(gè)重復(fù)。澆灌30 d后，測(cè)量不同接種濃度下枸杞苗株高、根長(zhǎng)、葉數(shù)、葉面積(長(zhǎng)×寬)、根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等生長(zhǎng)指標(biāo)，并測(cè)量最佳接種濃度下枸杞苗葉片的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和根系活力等生理指標(biāo)，每個(gè)處理重復(fù)6次。葉綠素、可溶性糖含量和根系活力用相關(guān)試劑盒測(cè)定，可溶性蛋白含量參照蔡慶生[26]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和事后LSD檢驗(yàn)比較不同處理之間的顯著性差異(α= 0.05)。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.01為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型NQ8GⅡ4菌株的促生活性

產(chǎn)赤霉素定性試驗(yàn)表明，在加入福林試劑后，野生型NQ8GⅡ4菌株的發(fā)酵液呈淺綠色(圖1- A6)，與空白對(duì)照的黃色(圖1-A1)對(duì)比明顯，表明NQ8GⅡ4菌株具有產(chǎn)赤霉素的能力。進(jìn)一步定量分析表明，NQ8GⅡ4菌株培養(yǎng)5 d的發(fā)酵濾液中赤霉素含量可達(dá)16.6 μg/mL。產(chǎn)鐵載體定性分析顯示(圖1-B)，NQ8GⅡ4菌株培養(yǎng)濾液與CAS檢測(cè)液反應(yīng)呈橙紅色，而空白對(duì)照則呈現(xiàn)藍(lán)色，表明NQ8GⅡ4菌株具有分泌鐵載體能力。鐵載體定量檢測(cè)As/Ar值為0.7，根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定其產(chǎn)鐵載體能力為中等。NQ8GⅡ4菌株均可在測(cè)定解磷(無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷)、產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)纖維素酶的4種選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在無(wú)機(jī)磷PVK培養(yǎng)基上未觀察到透明圈(圖2-A)，而在蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基、蛋白酶培養(yǎng)基能夠觀察到明顯的透明圈(圖2-B～2-C),在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基可見較明顯降解圈(圖2-D)，上述現(xiàn)象說(shuō)明NQ8GⅡ4菌株具有一定解有機(jī)磷、產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力，對(duì)植物可能有促生活性。

A.赤霉素福林法比色，1～5分別為0 mg、0.04 mg、0.08 mg、0.16 mg、0.32 mg的赤霉素標(biāo)準(zhǔn)比色液，6為NQ8GⅡ4發(fā)酵濾液比色；B.鐵載體定性檢測(cè);CK.空白對(duì)照

A.無(wú)機(jī)磷PVK培養(yǎng)基；B.蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基；C.蛋白酶培養(yǎng)基；D.羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基；箭頭所指為透明圈(降解圈)

2.2 GFP菌株在植物根部的定殖觀察

通過(guò)激光共聚焦熒光顯微觀察，在接種后的50 d，NQ8GⅡ4-GFP標(biāo)記菌株能夠成功定殖于枸杞、番茄、和小麥3種植物根部(圖3-A～3-F)，而在芹菜、生菜和西葫蘆根部均未發(fā)現(xiàn)定殖。標(biāo)記菌株的菌絲通過(guò)穿透根側(cè)表皮細(xì)胞進(jìn)入植物根內(nèi)，隨后菌絲逐漸向根內(nèi)生長(zhǎng)，沿根縱向上下延伸。經(jīng)NQ8GⅡ4-GFP標(biāo)記菌處理的枸杞、番茄和小麥根部觀察均可見綠色熒光，但不同植物的熒光強(qiáng)度有差異。其中宿主植物枸杞根系中標(biāo)記菌株菌絲熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，非宿主植物番茄根系中標(biāo)記菌株菌絲熒光強(qiáng)度次之，小麥根系中菌絲熒光最弱(圖3-D～3-F)。NQ8GⅡ4-GFP菌株菌絲主要定殖于枸杞、番茄和小麥根部皮層組織細(xì)胞及細(xì)胞連接處，部分侵入維管束組織，并且能明顯看到菌絲團(tuán)，菌絲圈等內(nèi)生真菌根結(jié)構(gòu)。

A～C.枸杞、番茄和小麥根部明場(chǎng)視野；D～F.枸杞、番茄和小麥根部熒光視野。紅色箭頭所指為菌絲圈，黑色箭頭為菌絲團(tuán)；標(biāo)尺為50 μm

2.3 GFP菌株在植物根部的定殖情況

PDA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅枸杞、番茄和小麥的根段長(zhǎng)出GFP標(biāo)記的NQ8GⅡ4菌落，而芹菜、生菜和西葫蘆的根段均未見目標(biāo)菌落，這說(shuō)明NQ8GⅡ4-GFP標(biāo)記菌株能在枸杞、番茄和小麥根部定殖，而不能在芹菜、生菜和西葫蘆根部定殖，這與激光掃描共聚焦熒光觀察的結(jié)果一致。定殖分析顯示(表1)，在宿主植物枸杞根部中的定殖率最高，為93.90%，在非宿主植物番茄根部定殖率次之，為91.84%，在小麥根部中定殖率最低，僅為21.43%，且菌株在枸杞和番茄的定殖率顯著地高于小麥。

表1 NQ8GⅡ4-GFP菌株在不同植物中的定殖情況Table 1 Colonization rate of NQ8GⅡ4-GFP strain in different plants

2.4 GFP菌株對(duì)枸杞的促生作用

接種NQ8GⅡ4-GFP菌株30 d后，隨著接種濃度的增加，NQ8GⅡ4-GFP菌株處理組的生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照組相比較呈先升高后下降的趨勢(shì)(圖4，表2)。接種濃度為106CFU/mL時(shí)，枸杞苗的株高、根長(zhǎng)、葉數(shù)和葉面積分別是對(duì)照組的1.51、1.54、1.5和2.18倍，根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量是對(duì)照組的3.16和2.62倍，具有顯著的促生作用。接種濃度為105CFU/mL時(shí)株高、葉面積、根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別是對(duì)照處理的1.23、1.92、2.28和 2.09倍，也具有一定的促生作用。

1～6分別為0(CK)、107、106、105、104、103 CFU/mL處理組

表2 NQ8GⅡ4-GFP菌株不同接種濃度對(duì)枸杞苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Table 2 Effect of NQ8GⅡ4-GFP strain with different concentrations on growth of Chinese wolfberry seedlings

接種106CFU/mL的NQ8GⅡ4-GFP菌株孢子液后，枸杞苗的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)含量和根系活力等生理指標(biāo)均顯著的高于對(duì)照組(圖5)。葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量分別是對(duì)照組的1.13、2.32和1.39倍；可溶性糖、可溶性蛋白含量和根系活力分別是對(duì)照的1.97、3.25和1.41倍。說(shuō)明接種106CFU/mL的NQ8GⅡ4-GFP菌株孢子液后對(duì)枸杞生理指標(biāo)具有促進(jìn)作用。

CK表示未接種空白對(duì)照。圖中數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”。**表示經(jīng)t檢驗(yàn)法比較差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

有益內(nèi)生真菌在宿主植物中的成功定殖，是發(fā)揮其促生抗病作用的重要條件[27]。GFP作為一種重要的分子標(biāo)記，在微生物與宿主之間的互作、環(huán)境微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等諸多方面展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景[28-29]。趙興麗等[30]利用GFP標(biāo)記的鉤狀木霉ACCC31649-GF21，研究該菌株在辣椒組織中的定殖及擴(kuò)散規(guī)律。Sun等[31]利用GFP標(biāo)記的稻鐮狀瓶霉Falciphoraoryzae證明了在擬南芥根部的定殖能力，為后續(xù)將擬南芥作為研究促生機(jī)制的模型提供了理論支撐。本研究證明GFP標(biāo)記的NQ8GⅡ4菌株能夠在宿主枸杞和非宿主番茄、小麥根部中定殖，可通過(guò)菌絲定殖于根部皮層組織細(xì)胞或細(xì)胞間隙，部分到達(dá)維管束組織。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，NQ8GⅡ4-GFP菌株可能更傾向于定殖茄科植物，在枸杞和番茄中的定殖率顯著大于小麥，但這一結(jié)果還需要進(jìn)一步擴(kuò)大宿主植物的定殖范圍來(lái)證實(shí)。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)枸杞內(nèi)生真菌的文獻(xiàn)報(bào)道多為內(nèi)生真菌多樣性和抑菌活性研究，而關(guān)于枸杞內(nèi)生真菌促生效果的研究報(bào)道較少。本研究促生活性測(cè)定顯示NQ8GⅡ4菌株自身具有較強(qiáng)的產(chǎn)赤酶素能力，第5天時(shí)菌液中的赤霉素濃度可達(dá) 16.6 μg/mL，同時(shí)NQ8GⅡ4菌株還具有一定解磷、產(chǎn)鐵載體、分泌蛋白酶和纖維素酶的能力，這表明NQ8GⅡ4菌株可通過(guò)產(chǎn)植物生長(zhǎng)激素和促進(jìn)宿主植物根系營(yíng)養(yǎng)元素吸收等機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)。盆栽試驗(yàn)顯示，接種適宜濃度的NQ8GⅡ4-GFP孢子液后對(duì)枸杞苗的生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)等方面均具有顯著促進(jìn)作用，這可能與NQ8GⅡ4菌株自身具有促生活性相關(guān)。

有研究認(rèn)為，有益菌在一定接種濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)植物生長(zhǎng),過(guò)低的接種濃度,對(duì)植物促生作用不顯著[32]。例如,賈瑞敏等[33]將生防菌QLP12、SL01和Fo47接種甘藍(lán)后發(fā)現(xiàn),菌粉濃度為1.00×107CFU/g時(shí),SL01和QLP12菌株對(duì)甘藍(lán)苗鮮質(zhì)量、株高表現(xiàn)出顯著的抑制作用,施用濃度為1.25×106～5.00×106CFU/g時(shí),3株菌株對(duì)甘藍(lán)表現(xiàn)出促生作用。李哲[34]發(fā)現(xiàn)當(dāng)FZBA2-gfp菌液濃度為3.65×106CFU/mL時(shí),對(duì)小麥的發(fā)芽率、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)以及鮮質(zhì)量具有顯著的促生作用,當(dāng)濃度過(guò)低(3.65×105CFU/mL)促生效果不明顯。本研究結(jié)果表明NQ8GⅡ4-GFP孢子液濃度為105～106CFU/mL時(shí)，對(duì)枸杞有顯著的促生效果,這也與上述報(bào)道的結(jié)論類似。在內(nèi)生真菌與植物共生互作中，內(nèi)生真菌可作為誘導(dǎo)子激發(fā)宿主植物抗逆性或促進(jìn)生長(zhǎng)，但激發(fā)的強(qiáng)度與內(nèi)生真菌的施用濃度、方式和時(shí)間等密切相關(guān)[35]。本研究討論了濃度因素對(duì)促生作用的影響，施用方式和時(shí)間是否影響促生效果也值得進(jìn)一步探究。