王 寧，黃 偉，魯致遠(yuǎn)，羅 義，馬昊翔，張麗娟，王 瑋

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091)

蘋果樹腐爛病(Apple tree valsa cancer)是由殼囊孢(Valsamalivar.mali)侵染引起的一種真菌性病害，主要造成樹皮、樹干、枝條腐爛，導(dǎo)致樹勢衰弱、蘋果品質(zhì)和產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時可致整棵樹枯死[1-2]。目前該病的防治主要通過化學(xué)農(nóng)藥，但長期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會產(chǎn)生環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題，對人類健康造成潛在威脅[3-4]。因此，利用生物防治植物病害成為當(dāng)前的研究熱點，特別是利用微生物防治植物病害越來越受到人們的重視。

放線菌是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價值的微生物資源，從微生物中發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)約70%由其所產(chǎn)生，其中約50%來自鏈霉菌[5-6]。利用鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行植物病害的防治，因其具有高效、低毒無污染、不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性等特點，更符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展思路[7-9]。鏈霉菌能產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，包括脂肽類抗生素、揮發(fā)性物質(zhì)和抗菌蛋白(如細(xì)胞壁降解酶：幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和纖維素酶等)[10-11]，在植物病害的生物防治方面具有巨大的應(yīng)用價值。目前已有較多學(xué)者對這方面進(jìn)行了相關(guān)研究，Li等[12]篩選獲得了一株鏈霉菌，經(jīng)鑒定命名為楊凌糖絲菌，其發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌具有明顯的抑菌作用，抑菌帶寬度達(dá)20.2 mm。Prabavathy等[13]從鏈霉菌PMS的代謝產(chǎn)物中分離出脂肽類化合物SPM5C-1，濃度為25 μg/mL時完全抑制稻瘟病和水稻紋枯病的生長?；诖?，本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析確定菌株A144的分類地位，并研究了菌株A144的發(fā)酵濾液、脂肽粗提物、蛋白粗提物以及揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果，旨在為今后蘋果樹腐爛病的生物防治提供菌株資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 菌株A144由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所耐輻射微生物資源庫保藏。

植物病原真菌：馬鈴薯黑痣病菌(Rhizoctoniasolani)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、水稻惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、蘋果樹腐爛病菌(Valsamailvar.mail)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李健強(qiáng)教授 贈予。

1.1.2 培養(yǎng)基 高氏一號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、ISP4培養(yǎng)基均購自海博生物技術(shù)有限公司。海生菌肉湯2216E培養(yǎng)基購自美國BD公司。ISP2培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)[14]配置，大米浸液Ⅰ、小米浸液Ⅰ和小米浸液Ⅱ培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)[15]配置。

1.1.3 主要試劑與儀器 供試試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，甲醇，鹽酸，硫酸銨，磷酸鹽緩沖劑，0.22 μm微孔濾膜均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

供試儀器：超凈工作臺(浙江孚夏，型號SW-CJ-1F)，氣浴振蕩培養(yǎng)箱(上海天呈，型號TS-2102C)，高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安，型號LDZM-60KGS-Ⅲ)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi，型號R-300)，掃描電鏡(日本電子，型號JEM-1230HC)，全自動菌落分析儀(澤析生物，型號ZX-400)，正置熒光數(shù)碼顯微鏡(Nikon，型號Ci-L)。

1.2 菌株A144的鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 將斜面保藏的菌株A144接種至ISP4固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)5～7 d觀察菌株生長狀態(tài)，挑取菌絲進(jìn)行革蘭氏染色，記錄菌落顏色形態(tài)、氣生菌絲顏色、基內(nèi)菌絲顏色以及可溶性色素的有無。采用插片法在顯微鏡和掃描電鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)。

1.2.2 生理生化特征 參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]和《放線菌快速鑒定和系統(tǒng)分類》[17]中的方法進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。

1.2.3 16S rDNA序列測定 挑取菌株A144的單菌落接種于100 mL/250 mL三角瓶的ISP4液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)3 d，10 000 r/min離心1 min收集菌絲體，液氮速凍后研磨，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組。菌株的16S rDNA序列測定選擇通用引物27F和1492R進(jìn)行擴(kuò)增測序，引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ；1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增采用30 μL擴(kuò)增體系(模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，Mix 15 μL，ddH2O 11 μL)，擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶經(jīng)切膠回收后委托北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對，通過MEGA7.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1 000，確定菌株A144的分類地位。

1.3 菌株A144抑菌譜的測定

挑取菌株A144的單菌落接種于50 mL/100 mL三角瓶的2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)3 d作為種子液。將種子液接種于新鮮的2216E液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為接種量2%、裝液量100 mL/250 mL三角瓶、發(fā)酵溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、培養(yǎng)時間14 d，即得到菌株A144的發(fā)酵液。將發(fā)酵液在4 ℃高速冷凍離心機(jī)中，10 000 r/min離心10 min，收集上清，過0.22 μm微孔濾膜得到無菌發(fā)酵濾液。

采用含藥平板法[18]檢測無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性。將無菌發(fā)酵濾液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基以體積比1∶10混合倒板，制成含發(fā)酵濾液的PDA平板。在含藥平板中心接種直徑為5 mm的供試真菌菌餅，以不含發(fā)酵濾液的平板作為對照，30 ℃培養(yǎng)5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率，所有試驗均設(shè)置3個重復(fù)。

抑菌率=(對照組病原真菌菌落直徑- 處理組病原真菌菌落直徑)/對照組病原真菌菌落直 徑×100%

1.4 菌株A144代謝產(chǎn)物的抑菌活性

1.4.1 菌株A144不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 將菌株A144的種子液以2%的接種量，接種于不同培養(yǎng)基中， 30 ℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)14 d。按照“1.3”中的方法收集無菌發(fā)酵濾液并制成含發(fā)酵濾液的PDA平板。以蘋果樹腐爛病病原菌為指示菌，將直徑為5 mm的菌餅接種于含藥平板中央，以不含發(fā)酵濾液的PDA平板作為對照，每組3個重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)5 d，測量病原菌菌落直徑，根據(jù) “1.3”中的公式計算抑菌率，篩選菌株A144最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4.2 菌株A144脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 按照“1.3”中的方法收集菌株A144的ISP2培養(yǎng)基無菌發(fā)酵濾液，采用酸沉淀法提取脂肽，使用6.0 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，4 ℃靜置過夜，4 ℃、10 000 r/min離心30 min后收集沉淀，用等體積100%甲醇萃取2～3次，合并萃取液，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮得到脂肽提取物[19]。用無水甲醇溶解，分別配制成濃度為1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL的脂肽粗提物溶液，并置于4 ℃冰箱保存，備用。

采用平板涂抹法[20]檢測脂肽粗提物的抑菌效果。取100 μL不同濃度的菌株A144脂肽粗提物均勻涂抹于PDA平板上，然后將蘋果樹腐爛病病原菌接種于PDA平板中央，以未涂抹脂肽類粗提物的PDA平板為對照，每組3個重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑 菌率。

1.4.3 菌株A144蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 按照“1.3”中的方法收集菌株A144的ISP2培養(yǎng)基無菌發(fā)酵濾液，在無菌發(fā)酵濾液中緩慢加入固體硫酸銨至80%飽和度， 4 ℃靜置過夜，10 000 r/min離心20 min收集蛋白沉淀，用少量滅菌的0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.2)進(jìn)行溶解，再置于透析袋(截留分子質(zhì)量為 7 000 u)放入裝有PBS緩沖液的燒杯中透析除鹽，每8 h換1次PBS緩沖液[21]。將透析得到的蛋白粗提液用無菌的PBS緩沖液分別配制成濃度為50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL的蛋白粗提物溶液，檢測活性方法同“1.5”，對照組為涂抹PBS緩沖液的PDA平板，每組3個重復(fù)，30 ℃培養(yǎng)5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑菌率。

1.4.4 菌株A144揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性測定 通過平板對扣法[14]檢測菌株A144的揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性。通過劃線法將菌株A144接種于ISP2培養(yǎng)基上，與中央接種蘋果樹腐爛病菌的PDA平板對扣(菌株A144平板在下層板，蘋果樹腐爛病菌的PDA平板在上層板)，用雙層封口膜密封，以未接種A144的平板為對照，每組3個重復(fù)， 30 ℃培養(yǎng)5 d，測量病原菌菌落直徑，計算抑 菌率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行鄧肯(Duncan’s)多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Graph prism 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A144的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株A144革蘭氏染色呈陽性，在ISP4固體平板上30 ℃培養(yǎng)7 d后，形成直徑約4～7 mm的圓形菌落，向培養(yǎng)基表面隆起，菌落中央呈灰色，邊緣白色，疏松、多孔，呈同心環(huán)；氣生菌絲初為白色，產(chǎn)孢后轉(zhuǎn)為鼠灰色，表面干燥、粗糙；基內(nèi)菌絲顏色不恒定，呈灰白色或者淺黃色，無可溶性色素產(chǎn)生(圖1-A)。菌絲生長旺盛，分支較多，大部分呈松散的螺旋狀，部分為勾狀(圖1-B,1-D)；孢子呈卵圓形或橢圓形，鏈狀聚集，表面光滑(圖1-C)。

A.菌落圖；B.菌體圖；C.分生孢子；D.掃描電鏡

2.1.2 生理生化特征 菌株A144生理生化特征結(jié)果見表1，耐鹽范圍0～9% NaCl；在pH 5～10內(nèi)生長；生長溫度為15～55 ℃。菌株A144可以產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、脲酶、酪氨酸水解酶、苯丙氨酸脫氫酶和甘油脫氫酶活性，未產(chǎn)生接觸酶和硫化氫，無運動性和明膠液化現(xiàn)象，MR試驗、V-P試驗呈陰性，硝酸還原、七葉甘水解、葡萄糖氧化均呈陽性。

表1 菌株A144的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain A144

2.1.3 16S rDNA序列分析 通過PCR擴(kuò)增菌株A144的16S rDNA，經(jīng)測序結(jié)果分析，其序列大小為1 420 bp，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(Genbank序列登錄號：MZ959802)，與StreptomycesrocheiNRRL B-2410達(dá)到 99.78%，并與多株鏈霉菌屬菌株相似性在98%以上。選取同源性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析的結(jié)果，最終將菌株A144鑒定為婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建菌株A144的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A144 based on 16s rDNA sequence cluster analysis

2.2 菌株A144的抑菌譜測定

由圖3可知，通過將菌株A144的2216E培養(yǎng)基發(fā)酵濾液制成含藥平板，對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果最好，抑菌率為68.15%±2.62%，對西瓜枯萎病菌和水稻惡苗病菌的抑菌效果無顯著差異(P>0.05)，抑菌率分別為28.90%±1.79%和33.77%±2.59%，對番茄早疫病菌的抑菌率為 11.43%±0.81%，對馬鈴薯黑痣病菌和西瓜枯萎病菌無抑菌效果?？梢?，菌株A144的發(fā)酵濾液對多種植物病原菌都具有抑菌活性。

圖中相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同?！?”表示無抑制效果。A.馬鈴薯黑痣病菌；B.西瓜枯萎病菌；C.水稻惡苗病菌；D.棉花枯萎病菌；E.番茄早疫病菌；F.蘋果樹腐爛病菌

2.3 菌株A144代謝產(chǎn)物的抑菌活性

2.3.1 菌株A144不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖4可知，菌株A144不同培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率差異顯著(P<0.05)，表明培養(yǎng)基的成分對菌株A144抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生具有一定的影響。其中ISP4、PDB、MRS培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對病原菌抑菌效果較弱，抑菌率分別為10.70%±0.15%、 18.73%±2.10%和12.01%±1.62%；而ISP2培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果最好，抑菌率為85.06%±0.86%。根據(jù)抑菌率的大小，菌株A144不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌效果強(qiáng)弱為：ISP2=小米Ⅱ>ISP3=小米Ⅰ>大米Ⅰ>2216E>TSB>高氏一號=LB>PDB>MRS=ISP4。由表2可知，含小米Ⅱ培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的PDA平板與含ISP2培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的PDA平板培養(yǎng)至第5天，病原菌菌落直徑?jīng)]有顯著差異 (P>0.05)。但隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)至第15天時，含小米Ⅱ培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑達(dá)33.62 mm±6.26 mm，含ISP2培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑達(dá)19.38 mm±0.18 mm，兩種培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液抑菌效果差異顯著(P< 0.05)。綜上所述，選擇ISP2培養(yǎng)基作為菌株A144的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

A.ISP2培養(yǎng)基；B.ISP3培養(yǎng)基；C.ISP4培養(yǎng)基；D.大米浸液Ⅰ培養(yǎng)基；E.小米浸液Ⅰ培養(yǎng)基；F.小米浸液Ⅱ培養(yǎng)基； G.PDB培養(yǎng)基；H.MRS培養(yǎng)基；I.2216E培養(yǎng)基；J.LB培養(yǎng)基； K.TSB培養(yǎng)基；L.高氏一號培養(yǎng)基

表2 菌株A144的ISP2培養(yǎng)基和小米Ⅱ培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of ISP2 medium and millet Ⅱmedium fermentation broth of strain A144 on Valsa mali var. mali

2.3.2 菌株A144脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖5可知，菌株A144的脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌具有較好的抑菌活性。由表3可知，50 mg/mL脂肽粗提物的抑菌率比10 mg/mL和1 mg/mL脂肽粗提物的抑菌率分別高出43.61%和61.23%，具有顯著差異(P<0.05)。

A.甲醇對照；B.1 mg/mL脂肽粗提物；C.10 mg/mL脂肽粗提物；D.50 mg/mL脂肽粗提物

表3 菌株A144脂肽粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率Table 3 Inhibition rate of crude lipopeptides of strain A144 on Valsa mali var. mali

2.3.3 菌株A144蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖6可知，菌株A144的蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌具有較好的抑菌活性。由表4可知，150 mg/mL蛋白粗提物的抑菌率比100 mg/mL和50 mg/mL蛋白粗提物的抑菌率分別高17.29%和28.24%，具有顯著差異(P<0.05)。

A.緩沖液對照；B.50 mg/mL蛋白粗提物；C.100 mg/mL蛋白粗提物；D.150 mg/mL蛋白粗提物

表4 菌株A144蛋白粗提物對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率Table 4 Inhibition rate of crude proteins of strain A144 on Valsa mali var. mali

2.3.4 菌株A144揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性 由圖7和圖8可知，菌株A144與蘋果樹腐爛病菌進(jìn)行平板對扣共培養(yǎng)5 d，對照組和試驗組的病原菌菌落直徑存在顯著差異 (P<0.05)，抑菌率為22.87%±4.40%，說明菌株A144產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌具有一定的抑菌活性。

圖7 菌株A144揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果Fig.7 Inhibitory effect of volatile substances of strain A144 on Valsa mali var. mali

A.對照組；B.試驗組

3 討 論

目前，蘋果樹腐爛病的防治主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治存在農(nóng)藥殘留、病原菌易產(chǎn)生抗藥性及環(huán)境污染等問題[22]，生物防治具有高效、低毒無污染以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點[8,23]，成為當(dāng)前的研究熱點。本研究在前期工作中發(fā)現(xiàn)鏈霉菌A144對蘋果樹腐爛病菌具有很好的抑菌活性，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析將其鑒定為婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)。婁徹氏鏈霉菌廣泛存在于自然界中，其用來防治植物病害已有相關(guān)報道。薛應(yīng)鈺等[4]從蘋果樹根際土壤中分離出一株婁徹氏鏈霉菌，其發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病具有較好的抑制效果。李永麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果內(nèi)生菌婁徹氏鏈霉菌Am-1發(fā)酵液對葡萄座腔菌、蘋果擬莖點霉的抑菌率可達(dá)95%以上。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分不僅會影響微生物的生長繁殖，還會影響微生物活性次級代謝產(chǎn)物的合成速率以及產(chǎn)物的產(chǎn)量和種類[25-26]。本研究中菌株A144的12種不同培養(yǎng)基發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌效果具有顯著性差異(P<0.05)，其中使用ISP2培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株A144發(fā)酵濾液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌率最高，達(dá)到85.06%±0.86%，高于薛應(yīng)鈺等[4]和袁雪等[27]分離的鏈霉菌對蘋果樹腐爛病菌的抑制效果。小米Ⅱ培養(yǎng)基與ISP2培養(yǎng)基的發(fā)酵濾液制成的含藥PDA平板培養(yǎng)至第5天時，抑菌效果差異不顯著(P>0.05)，但培養(yǎng)至第15天時含小米Ⅱ培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑比含ISP2培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的PDA平板上的病原菌菌落直徑大14.24 mm，具有顯著性差異(P<0.05)，說明ISP2培養(yǎng)基發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)比小米Ⅱ培養(yǎng)基發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性更好。推測可能的原因一方面是ISP2的培養(yǎng)基更有利于菌株A144抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生和其活性的提高，另一方面是培養(yǎng)時間會影響含藥PDA平板中抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性。本研究中ISP2培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌率比ISP4培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌率高出74.36%，差異極顯著(P<0.01)。ISP4培養(yǎng)基營養(yǎng)成分單一，只有可溶性淀粉作為唯一碳源，(NH4)2SO4作為無機(jī)氮源。ISP2培養(yǎng)基成分中葡萄糖作為碳源，酵母提取物和麥芽提取物作為有機(jī)氮源。葡萄糖作為速效碳源可直接被微生物利用，可溶性淀粉為遲效碳源，不能被微生物直接利用，需要被分解為單糖才能被利用[28]。有機(jī)氮源更利于微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的合成[29]。

鏈霉菌在生長代謝過程中會產(chǎn)生多種類型的抑菌活性物質(zhì)，這些抑菌物質(zhì)是鏈霉菌表現(xiàn)較高抑菌活性和較廣抑菌譜的重要原因之一[30]。本試驗中菌株A144的脂肽粗提物和蛋白粗提物以及揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌均具有較好的抑制效果，抑菌率分別為81.44%±0.92%、 47.92%±2.55%和22.87%±4.40%。脂肽粗提物是由非核糖體途徑合成的，其主要影響病原菌的細(xì)胞膜滲透作用，從而抑制病原菌的生長[26]。Wang等[31]分離出來的楊凌糖絲菌Hhs.01對蘋果樹腐爛病具有抑制作用，從其代謝產(chǎn)物中分離出兩種戊烯大環(huán)類脂類物質(zhì)WH01和WH02。蛋白粗提物是由核糖體途徑合成的，包括一些細(xì)胞壁降解酶(幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶以及淀粉酶)，植物病原菌的細(xì)胞壁主要以纖維素和幾丁質(zhì)為骨架，以β-1,3-葡聚糖和蛋白質(zhì)為主要填充物質(zhì)，故蛋白粗提物的作用機(jī)理為降解植物細(xì)胞壁，抑制病原菌生長[32-33]。鏈霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體種類豐富，包括醇類、醛類、有機(jī)酸類、酮類和烯烴類等化合物，主要通過抑制病原菌菌絲的生長以及孢子的萌發(fā)[34]。

本研究中鏈霉菌A144的發(fā)酵濾液、脂肽粗提物、蛋白粗提物和揮發(fā)性物質(zhì)對蘋果樹腐爛病菌都具有一定的抑菌活性，抑菌率分別為 85.06%±0.86%、81.44%±0.92%、47.92%±2.55%和22.87%±4.40%，表明菌株A144在蘋果樹腐爛病的生物防治中具有良好的開發(fā)和應(yīng)用潛力。